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Atividade dos óleos essenciais de Litsea cubeba e Cymbopogon martini sobre isolados do complexo Cryptococcus neoformans / Activity of Litsea cubeba and Cymbopogon martini essential oils against isolates of Cryptococcus neoformans species complexTreméa, Carolina Martins 13 April 2015 (has links)
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Previous issue date: 2015-04-13 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Cryptococcosis is a fungal infection caused by species of the complex
Cryptococcus neoformans (C. neoformans and C. gattii) with high incidence in
patients with acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). Antifungal drugs
used in therapy of this infection are scarce and, in addition, have evident toxicity
and low effectiveness, which motivates the search for new candidates to
antifungals. Essential oils (EOs) extracted from the fruit of Litsea cubeba (Litsea
cubeba (Lour.) Pers.) and leaves of Palmarosa (Cymbopogon martini (Roxb.)
Will. Watson) and its major constituents, citral and geraniol, were investigated as
antifungal sources. The aims of this work were to determine the isolated or
associated antifungal activity of EOs and major constituents with amphotericin B
(AMB) or fluconazole (FLU) on 15 isolates and two standard strains of C.
neoformans complex, evaluate the time-kill curve, the action on the biosynthesis
of ergosterol and on cell membrane, in addition to verify the cytotoxicity of EOs
and major constituents on human erythrocytes. By in vitro susceptibility testing
and minimum fungicidal concentration (MFC), the best activities were to L.
cubeba and citral. The EOs and major constituents exhibited minimum inhibitory
concentration (MIC) between 16 and 512 μg/mL and 64 and 2048 μg/mL, with a
MIC90 of 128 μg/mL for L. cubeba and citral, and 512 μg/mL for C. martini and
geraniol. To evaluate the association of EOs and major constituents with
antifungal agents was performed the Chequerboard method, that showed
indifference in the association of AMB and L. cubeba (94.1%) or citral (70.6%). In
association with FLU, L. cubeba was antagonistic (76.5%) and indifferent (94%)
for citral. C. martini and geraniol showed synergism associated with AMB,
respectively, in 52.9 and 70.6% of isolates, and showed indifference when
associated with the FLU in 64.7% and 88.2%. C. gattii 24065 time-kill curve
under the action of EOs and major constituents showed a rapid fungicidal
activity, which occurred after one hour incubation for L. cubeba, C. martini and
geraniol, and after two hours for citral. The amount of ergosterol was quantified
after contact with the EOs and major constituents and showed that L. cubeba
and citral inhibited 100% of sterol biosynthesis in MIC and 64% for C. martini.
This is the probably mechanism of action of these agents, except for geraniol,
which reduced only 12% in MIC. The major compounds of EOs showed no ability
to injure the plasma membrane of C. gattii, since an average of 2.7% propidium
iodide labeled cells were detected by flow cytometry. The in vitro cytotoxicity
assay by hemolysis showed that EOs and major constituents were not toxic in
the MIC and MFCs. Taken together, our results showed that the EOs of L.
cubeba and C. martini and their major constituents, citral e geraniol are
promising as candidates for new antifungal agents. / A criptococose é uma infecção fúngica causada por espécies do complexo
Cryptococcus neoformans (C. neoformans e C. gattii) com alta incidência em
indivíduos com a síndrome da imunodeficiência adquirida (aids). Os antifúngicos
utilizados na terapia dessa infecção são escassos e, além disso, possuem
toxicidade evidente e baixa eficácia, o que motiva a busca por novos candidatos
a antifúngicos. Os óleos essenciais (OEs) extraídos do fruto de Litsea cubeba
(Litsea cubeba (Lour.) Pers.) e das folhas de Palmarosa (Cymbopogon martini
(Roxb.) Will. Watson) e seus constituintes majoritários, citral e geraniol, foram
investigados como fontes de ação antifúngica. Os objetivos foram determinar a
atividade antifúngica isolada e associada à anfotericina B (AMB) ou fluconazol
(FLU) sobre 15 isolados e duas cepas padrão do complexo C. neoformans, além
de avaliar a curva de morte, a ação sobre a biossíntese do ergosterol e sobre a
membrana celular do fungo e a citotoxicidade dos OEs e constituintes
majoritários sobre hemácias humanas. Por meio de testes de suscetibilidade in
vitro e de concentração fungicida mínima (CFM), verificou-se melhor atividade
para L. cubeba e citral. Os OEs e constituintes majoritários avaliados exibiram
concentração inibitória mínima (CIM) entre 16 e 512 μg/mL e CFM entre 64 e
2048 μg/mL, com CIM90 de 128 μg/mL para L. cubeba e citral e de 512 μg/mL
para C. martini e geraniol. Para avaliar a associação dos OEs com antifúngicos
foi realizado o método de Chequerboard, onde houve indiferença na associação
de AMB a L. cubeba (94,1%) e citral (70,6%), e na associação com FLU, L.
cubeba foi antagônico (76,5%) e citral indiferente (94,%). C. martini e geraniol
apresentaram sinergismo associados a AMB, respectivamente, em 52,9 e 70,6%
dos isolados, e indiferença associado ao FLU em 64,7% e 88,2%. A curva de
morte de C. gattii 24065 sob ação dos OEs e constituintes majoritários mostrou
uma rápida ação fungicida, que ocorreu após uma hora de incubação para L.
cubeba, C. martini e geraniol, e em duas horas para o citral. A quantificação do
ergosterol após contato com os OEs e constituintes majoritários mostrou que L.
cubeba e citral inibiram 100% da biossíntese desse esterol na CIM e 64% para
C. martini, o que provavelmente é um mecanismo de ação destes agentes,
exceto para o geraniol, que reduziu apenas 12% na CIM. Os OEs e compostos
majoritários não apresentaram capacidade de lesionar a membrana plasmática
de C. gattii, visto que em média de 2,7% das células foram marcadas com iodeto
de propídio e detectadas por citometria de fluxo. O ensaio de citotoxicidade in
vitro por hemólise mostrou que os OEs e constituintes majoritários não foram
tóxicos nas CIMs e CFMs. Os resultados observados no presente trabalho
mostram que os OEs de L. cubeba e C. martini e seus constituintes majoritários,
citral e geraniol, são promissores candidatos a antifúngicos.
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