It seemed desirable to investigate further the possible role of complement and its components in the protective action of serum against transplanted neoplasms. It is the purpose of this thesis to present data which suggest that the C'4 component plays an active part in this process though the mechanism is not disclosed.

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:52Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-04Bitstream added on 2014-08-13T18:00:11Z : No. of bitstreams: 1 000764397.pdf: 797747 bytes, checksum: 6a89fbc6b7371005e020d9f2b9ab35ec (MD5) / A Leucemia Linfocítica Crônica (LLC) é uma neoplasia de linfócitos B maduros, de curso clínico heterogêneo, com alguns pacientes necessitando de tratamento imediato e outros vivendo sem tratamento por décadas. Por essa característica, se faz necessária a identificação de marcadores prognósticos acessíveis e de valor clínico. O objetivo principal foi avaliar retrospectivamente os indicativos prognósticos de progressão da doença (ZAP-70, CD38, ploidia de DNA e Fase S) em pacientes portadores de LLC, frente a sua evolução clínica. Como objetivos secundários, foram comparadas as metodologias de análise de ZAP-70 por citometria de fluxo(CF) ISO Método e Análise em Tubo Único, assim como as técnicas de análise de conteúdo de DNA pelo modelo matemático (ModFit LT™) e estratégia de gating boleano (Infinicyt™). Na cauística foram incluídos 27 pacientes que possuíam disponíveis os dados clínicos e laboratoriais em estudo e que concordaram e preencheram o termo de consentimento livre e esclarecido. A avaliação da situação clínica foi feita uma única vez, e assim como os resultados das expressões de CD 38 e ZAP 70, foi realizada através de revisão de prontuário médico. A análise do conteúdo de DNA por CF foi avaliada pelos dois métodos supracitados, a partir de arquivos do laboratório de citometria de fluxo da instituição. Como resultados, não se observou relação das expressões de ZAP-70 e CD38 com o estado clínico dos pacientes. Em relação à análise de índice de DNA e Fase S, não houve diferença estatística (p=0,69 e p=0,08 respectivamente utilizando-se os softwares ModFit LT™ e Infinicyt™). Também foi encontrado que os dados obtidos na análise de DNA indicam a possibilidade de utilização da Fase S na avaliação prognóstica dessa série de pacientes. Todos os três fatores estudados são considerados prognósticos. Não houve relação dos marcadores estudados com a evolução ... / The Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) is a mature B lymphocytes malignancy, on heterogeneous clinical course, where some patients require immediate treatment and others live for decades without treatment. For this peculiarity, it’s required the identification of prognostic markers and clinical value. The main objective was to retrospectively, evaluate the prognostic indicator of the disease progression (ZAP- 70, CD38, DNA ploidy and S phase) in patients under CLL, facing the clinical evolution. As secondary purposes, methodologies were compared to ZAP- 70 analysis by flow cytometry (FC) ISO Method and Single-Tube Analysis, as well as technical analysis of DNA content by the mathematical model (ModFit LT ™) and boolean gating principle (Infinicyt ™ ). On the registration of the cases observed, there were included 27 patients under the clinical and laboratory data who had available and filled in the term consenting agreement. The evaluation of the clinical situation was made only once, and the results of expressions and CD38 and ZAP 70, were held by reviewing medical records. The analysis of DNA content by CF was evaluated by the above two methods files from a laboratorial flow cytometry institution. As a result, no relation of the expressions of CD38 and ZAP- 70 with the clinical status of the patients was observed. Concerning the analysis of DNA index and S phase, there wasn’t any statistical difference (p = 0.69 and p = 0.08 respectively using the ModFit LT ™ and Infinicyt ™ software ). It was also found that the data obtained in the analysis of DNA indicates the possibility of using the S phase in the prognostic evaluation of those patients. Conclusion: all the three factors studied are considered prognostic. There was no relation of the markers studied to the clinical course of patients. To correlate these data with clinical follow-up of those patients, it is necessary a longer period of time

Orientador: Jose Andres Yunes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-15T09:06:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vasconcellos_JairaFerreirade_D.pdf: 12382146 bytes, checksum: 9d05fdf79968e31e12ded32312675286 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A leucemia linfóide aguda (LLA) é a neoplasia mais freqüente na infância. As interações dos blastos da LLA com as células do estroma da medula óssea (MO) têm um impacto positivo na sobrevivência das células e resistência a quimioterapia. A LLA estimula as células do estroma da MO que reciprocamente promovem a sobrevivência da leucemia. Para identificar moléculas envolvidas na interação leucemia-microambiente foi realizada análise do perfil de expressão gênica de células mesenquimais (MSC) da MO estimuladas com células primárias da LLA. O estímulo da LLA nas MSC ativou várias quimiocinas próinflamatórias, incluindo CCL2 e IL-8. Os níveis plasmáticos de CCL2 e IL-8 em crianças com LLA ao diagnóstico foram significativamente maiores do que em controles normais. A maioria das amostras de LLA primária expressou transcritos dos receptores de CCL2 e IL-8. Ensaios funcionais in vitro demonstraram que a LLA não é afetada pela adição de CCL2, IL- 8 ou anticorpos neutralizantes. Porém ambas as quimiocinas demonstraram estimular a sobrevivência das MSC em meio sem soro e aumentar sua proliferação em meio com quantidades limitadas de soro. Para explorar o efeito da IL-8 no microambiente da MO leucêmica foi sintetizado um antagonista do receptor CXCR2 da IL-8, denominado SB225002 (N-(2-hydroxy-4-nitrophenyl)-N'-(2-bromophenyl)urea). O SB225002 demonstrou efeito deletério contra as linhagens da LLA (Nalm6, REH, Jurkat, CEM e Molt4). Mas nem todas as linhagens da LLA sensíveis ao SB225002 expressaram o receptor CXCR2, sugerindo que seu mecanismo de ação ocorreria através de receptor alternativo. Recentemente foi descrito que o SB225002 também se liga a outros receptores acoplados a proteína G, dentre eles os receptores da histamina e dos canabinóides. Ambos foram testados in vitro e o receptor CNR2 dos canabinóides demonstra desempenhar função no mecanismo de ação do SB225002. Além disso, para identificar moléculas envolvidas na resposta celular ao SB225002 foi realizada a análise do perfil de expressão gênica de células Jurkat tratadas com SB225002. Eventos celulares de resposta inicial ao SB225002 incluíram (i) ativação de phospho-p44/42 ERK e (ii) ativação de GLIPR1 que demonstrou mediar a indução de morte do SB225002. Em conclusão, este trabalho indica a importância das quimiocinas CCL2 e IL-8 no microambiente da LLA, e demonstra o potencial do SB225002 como agente antileucêmico. / Abstract: The interactions of Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) blasts with bone marrow (BM) stromal cells have a positive impact on leukemia cell survival and resistance to chemotherapy. ALL stimulates BM stromal cells, which reciprocally promote leukemia cell survival. To identify molecules critically involved in leukemia-microenvironment crosstalk, we performed gene expression profiling analyses of primary BM mesenchymal stem cells (BMMSC) following stimulation by primary ALL cells. Leukemia stimulation of BMMSC up regulated the expression of several inflammatory chemokines, including CCL2 and IL-8. Secretion of these molecules was confirmed by ELISA assays of in vitro co-culture experiments and in BM plasma samples from pediatric ALL patients. Most primary ALL samples were found to express mRNA for CCL2 and IL-8 receptors. In vitro functional studies revealed that primary ALL cells co-cultured with BMMSC were not affected by addition of CCL2, IL-8 or neutralizing antibodies to these chemokines. On the other hand, both chemokines were found to enhance BMMSC survival in serum-free medium and to increase their proliferation in serum-starved conditions. To further explore the effect of IL-8 in the ALL-BM microenvironment the CXCR2 -IL-8 receptor-antagonist SB225002 ( N - ( 2 - hydroxyl - 4 - nitrophenyl ) - N' - ( 2 - bromophenyl ) urea) was synthesized. SB225002 had a deleterious effect against ALL cell lines (Nalm6, REH, Jurkat, CEM, and Molt4). Suprisingly, not all the ALL cells lines that were sensitive to SB225002 expressed CXCR2 receptor. This find suggested that the SB225002's mechanism of action occurred through a different receptor. SB225002 was recently described to also bind histamine and cannabinoid receptors that were investigated in ALL and the CNR2 cannabinoid receptor demonstrated to play a role in SB225002 mechanism of action. To identify molecules involved in the cellular effects promoted by SB225002, gene expression profiling analyses was performed of Jurkat cells treated with SB225002. Early cellular effects enhanced by SB225002 included (i) activation of phospho-p44/42 ERK and (ii) up regulation of GLIPR1 that shown to mediate SB225002-induced apoptosis. In conclusion, this work support a significant role for the chemokines CCL2 and IL-8 in the ALL-BM microenvironment, and demonstrate SB225002's therapeutic potential. / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas

As peroxirredoxinas (Prx) são enzimas antioxidantes que se destacam pela capacidade de decompor uma grande variedade de hidroperóxidos com elevada eficiência (106-108M-1s-1), mantendo essas moléculas em níveis adequados à homeostase celular. Entretanto, já foi demonstrado que em diversos tipos tumorais os níveis de Prx são extremamente aumentados e experimentos envolvendo sua inativação resultam na diferenciação ou apoptose de células tumorais. Recentemente, foi descoberto um diterpenóide denominado adenantina que seria o primeiro inibidor para as Prx1 e Prx2 de humanos e foi demonstrada que sua aplicação em células de leucemia mieloide aguda promoveu diferenciação ou apoptose dessas células. Nesse contexto, o presente trabalho apresenta duas vertentes: 1) A caracterização das alterações estruturais e funcionais promovidas pela ligação da adenantina ao sítio ativo das Prx utilizando Tsa1 de Saccharomyces cerevisiae como modelo biológico, em função da sua alta similaridade com Prx2 de humanos; 2) Avaliação da atividade antitumoral dose dependente de adenantina sobre as linhagens celulares REH e MOLT-4 de leucemia linfoide aguda. No que concerne à primeira linha de investigação, nossos resultados revelam que Tsa1 é suscetível à inibição por adenantina, uma vez que o tratamento reduziu em ~66 % a velocidade de decomposição de peróxido de hidrogênio. Adicionalmente, a mutação da Thr44 de Tsa1, pertencente à chamada tríade catalítica, por uma Ser resultou em uma proteína mais suscetível a alterações na estrutura secundária e à inibição da atividade peroxidásica em função da ligação com adenantina, apresentando uma diminuição de ~85% na velocidade de reação. Características semelhantes foram observadas para a proteoforma Tsa2 de S. cerevisiae, que carreia naturalmente a substituição da Thr44 pela Ser. Análises de sequências de Prx em bancos de dados revelaram que majoritariamente proteínas contendo Ser são encontradas em organismos procariotos, muitos deles patogênicos. Finalmente, demonstramos por meio de ensaios citotoxicidade que as bactérias Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis, que possuem uma Ser na tríade catalítica, têm seu crescimento inibido pelo tratamento com adenantina (IC50 de 460µM e 77µM, respectivamente), enquanto que para Escherichia coli, que possui Thr nessa posição, a toxicidade da adenantina foi bastante baixa (não foi possível determinar o IC50 nas condições utilizadas). Dessa forma, os dados apresentados neste trabalho demonstram o potencial da utilização da adenantina tanto como antibiótico quanto como antileucêmico. / Peroxiredoxins (Prx) are antioxidant enzymes which stand out due the ability to decompose a wide variety of hydroperoxides with high efficiency (106-108M-1s-1) maintaining these molecules at suitable levels to cellular homeostasis and participating in several signaling events. However, it has been shown that, in many tumor types, Prx levels are extremely increased and experiments involving its inactivation have resulted in differentiation or apoptosis of tumor cells. It was recently found a diterpenoid, called adenanthin, that would be the first human Prx1 and Prx2 inhibitor and it was demonstrated that its application in acute myeloid leukemia cells was able to promote differentiation or apoptosis. In this context, this work presents two lines of research: 1) Characterization of structural and functional changes promoted by adenanthin binding to Prx active site using Tsa1 from Saccharomyces cerevisiae as biological model, due to its high similarity to human Prx2. 2) Evaluation of adenanthin dose-dependent antitumor activity over the acute lymphoid leukemia cell lines REH and MOLT-4. As regards the first line of research, our result reveal that Tsa1 is susceptible to inhibition by adenanthin, since the treatment with this binder reduced the hydrogen peroxide decomposition velocity in ~ 66%. In addition, the replacement of Thr44 from Tsa1, aminoacid belonging to the so-called catalytic triad, by a Ser resulted in a protein more susceptible to alterations in secondary structure and to peroxidase activity inhibition in function of adenanthin binding, presenting ~85% of decrease in reaction velocity. Similar characteristics were observed for Tsa2 proteoform from S. cerevisiae, which naturally carries the substitution of Thr44 by Ser. Prx sequences analyzes in databases revealed that mostly Ser-containing proteins are found in prokaryotic organisms, many of them pathogenic ones. Finally, we demonstrate through cytotoxicity assays that the bacteria Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis, which have a Ser in catalytic triad, have their growth inhibited by adenanthin treatment (IC50 of 460µM and 77µM, respectively), whereas for Escherichia Coli, which has Thr at that position, the tocyxicity of adenanthin was quite low (it was not possible to determine the IC50 under the used conditions). Regarding the second line of investigation, we found that adenanthin is able to induce the death of leukemic cell lines REH and MOLT-4, and for the last one, there was an unexpected proliferation of cells treated by the longest incubation period (72 hours), characterizing a possible indication of differentiation process. In this sense, the data presented here demonstrate the potential of adenanthin use in both antibiotic and antileukemic treatments.

A L-Asparaginase (L-ASNase) é uma enzima tetramérica bacteriana, utilizada em sessões de quimioterapia. Essa enzima depleta os aminoácidos asparagina (Asn) e glutamina (Gln), transformando-os em aspartato (Asp) ou glutamato (Glu), respectivamente, e em amônia. Contudo, a L-ASNase pode induzir resposta imune, levando à produção de anticorpos antiasparaginase, uma causa importante de resistência ao medicamento. Uma L-ASNase ideal seria aquela com alta atividade e estabilidade e baixo potencial imunogênico, porém, as L-ASNases utilizadas na terapêutica não reúnem essas características simultaneamente. Por essa razão, o presente trabalho utilizou técnicas de mutagênese randômica, a fim de criar uma nova proteoforma de L-ASNase de E. chrysanthemi com uma melhor atividade e estabilidade. Além disso, foram estudadas condições de cultivo em agitador metabólico, visando à otimização de condições de produção. Foi criada uma biblioteca com 1.056 clones, e desses, 19 foram selecionados por apresentarem atividade superior ou igual à enzima selvagem quando dosada em extrato bruto. Dentre eles, dois mutantes se destacaram por apresentarem a atividade específica glutaminásica diferente da enzima selvagem. Análises in silico indicam que o mutante 9-6D apresentou diminuição de desordem estrutural e epítopos imunogênicos. O mutante 9-5F demonstrou uma diminuição da porcentagem da atividade glutaminásica quando comparada a enzima selvagem. O estudo de produção do mutante 9-5F indicou que a temperatura de indução, seguida da concentração do indutor, são os parâmetros mais relevantes para a otimização da produção de L-ASNase de E. chrysanthemi mutante. / L-Asparaginase (L-ASNase) is a bacterial tetrameric enzyme used in chemotherapy sessions that deplete asparagine (Asn) and glutamine (Gln), transforming them into Aspartate (Asp) or glutamate (Glu), respectively, and ammonia. However, L-ASNase can induce immune response leading to the production of anti-asparaginase antibody, an important cause of drug resistance. Ideally, L-ASNase would be one with high activity, high stability and low immunogenic potential, but the L-ASNases commercially available today do not present these characteristics simultaneously. For this reason, this study used techniques of random and site-directed mutagenesis in order to create a new proteoform of E. chrysanthemi L-ASNase with improved activity and stability. In addition, culture conditions were studied in a metabolic shaker, aiming at the optimization of production conditions. A library with 1,056 clones was created, and of these clones, 19 were selected because they had activity superior or equal to the wild-type enzyme in crude protein extract. Among them, 2 mutants stood out for having different glutaminase specific activity in relation to wild-type enzyme. The 9-6D mutant also showed decreased structural disorder and immunogenic epitopes. The 9-5F mutant demonstrated a decrease in percentage of glutaminase activity when compared to the wild-type enzyme. The production study of 9-5F mutant indicated that the induction temperature followed by the inductor concentration are the most relevant parameters for the production optimization of E. chrysanthemi mutant L-ASNase.

A L-Asparaginase (L-ASNase) é uma enzima tetramérica bacteriana, utilizada em sessões de quimioterapia. Essa enzima depleta os aminoácidos asparagina (Asn) e glutamina (Gln), transformando-os em aspartato (Asp) ou glutamato (Glu), respectivamente, e em amônia. Contudo, a L-ASNase pode induzir resposta imune, levando à produção de anticorpos antiasparaginase, uma causa importante de resistência ao medicamento. Uma L-ASNase ideal seria aquela com alta atividade e estabilidade e baixo potencial imunogênico, porém, as L-ASNases utilizadas na terapêutica não reúnem essas características simultaneamente. Por essa razão, o presente trabalho utilizou técnicas de mutagênese randômica, a fim de criar uma nova proteoforma de L-ASNase de E. chrysanthemi com uma melhor atividade e estabilidade. Além disso, foram estudadas condições de cultivo em agitador metabólico, visando à otimização de condições de produção. Foi criada uma biblioteca com 1.056 clones, e desses, 19 foram selecionados por apresentarem atividade superior ou igual à enzima selvagem quando dosada em extrato bruto. Dentre eles, dois mutantes se destacaram por apresentarem a atividade específica glutaminásica diferente da enzima selvagem. Análises in silico indicam que o mutante 9-6D apresentou diminuição de desordem estrutural e epítopos imunogênicos. O mutante 9-5F demonstrou uma diminuição da porcentagem da atividade glutaminásica quando comparada a enzima selvagem. O estudo de produção do mutante 9-5F indicou que a temperatura de indução, seguida da concentração do indutor, são os parâmetros mais relevantes para a otimização da produção de L-ASNase de E. chrysanthemi mutante. / L-Asparaginase (L-ASNase) is a bacterial tetrameric enzyme used in chemotherapy sessions that deplete asparagine (Asn) and glutamine (Gln), transforming them into Aspartate (Asp) or glutamate (Glu), respectively, and ammonia. However, L-ASNase can induce immune response leading to the production of anti-asparaginase antibody, an important cause of drug resistance. Ideally, L-ASNase would be one with high activity, high stability and low immunogenic potential, but the L-ASNases commercially available today do not present these characteristics simultaneously. For this reason, this study used techniques of random and site-directed mutagenesis in order to create a new proteoform of E. chrysanthemi L-ASNase with improved activity and stability. In addition, culture conditions were studied in a metabolic shaker, aiming at the optimization of production conditions. A library with 1,056 clones was created, and of these clones, 19 were selected because they had activity superior or equal to the wild-type enzyme in crude protein extract. Among them, 2 mutants stood out for having different glutaminase specific activity in relation to wild-type enzyme. The 9-6D mutant also showed decreased structural disorder and immunogenic epitopes. The 9-5F mutant demonstrated a decrease in percentage of glutaminase activity when compared to the wild-type enzyme. The production study of 9-5F mutant indicated that the induction temperature followed by the inductor concentration are the most relevant parameters for the production optimization of E. chrysanthemi mutant L-ASNase.

Thesis (doctoral)--Katholieke Universiteit te Nijmegen.

FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / A leucemia linfocÃtica crÃnica (LLC) à a leucemia mais freqÃente nos paÃses ocidentais, ocorrendo em cerca de 30% de todas as leucemias do adulto, acometendo principalmente a populaÃÃo acima de 65 anos de idade. à caracterizada pela proliferaÃÃo clonal de linfÃcitos tipo B CD5 positivos. Do ponto de vista epidemiolÃgico, raramente à vista entre os orientais e a sua incidÃncia nÃo sofre influÃncia de agentes ambientais como substÃncias tÃxicas ou radiaÃÃes ionizantes. Os pacientes com LLC podem apresentar evoluÃÃo clÃnica variÃvel desde indolente a forma mais agressiva e rapidamente fatal. Na Ãltima dÃcada, houve um grande avanÃo no conhecimento da fisiopatologia desta doenÃa e fatores de prognÃstico de maior impacto foram estabelecidos e, do ponto de vista terapÃutico, novos medicamentos com maior eficÃcia surgiram. Desta forma à interessante conhecer a real situaÃÃo desta doenÃa com caracterÃsticas epidemiolÃgicas, clÃnicas e de prognÃstico muito peculiares. Nesse trabalho traÃamos o perfil (demogrÃfico, clÃnico e laboratorial) dos pacientes com LLC atendidos no serviÃo de Hematologia e Hemoterapia do Cearà (HEMOCE) do HUWC, correlacionando a expressÃo dos marcadores de prognÃstico (CD38 e ZAP-70) com algumas variÃveis e com o tratamento farmacolÃgico. Foram utilizadas amostras de sangue de 55 pacientes com LLC confirmados atravÃs de imunofenotipagem, em tratamento ou nÃo. Os marcadores CD38 e ZAP-70 foram analisados por citometria de fluxo e a dosagem de β2-microglobulina obtida atravÃs de mÃtodo imunoenzimÃtico (ELISA). Os dados obtidos foram analisados atravÃs de programa estatÃstico. Observamos um leve predomÃnio de pacientes do sexo masculino (1,4:1), 78% acima de 65 anos de idade e 60% eram procedentes da capital. Quanto ao estadiamento, 50,9% pacientes foram classificados como de baixo risco, segundo classificaÃÃo de Rai. Quanto a evoluÃÃo clÃnica, mais de 30% dos pacientes nÃo apresentavam sinais clÃnicos, nem no momento do diagnÃstico nem no final do estudo. Em relaÃÃo aos marcadores, 22,2% dos pacientes apresentavam expressÃo do ZAP-70 e 24,13% do CD38. NÃo houve diferenÃa estatÃsticamente significante entre os marcadores ZAP-70 e CD38 e as variÃveis hematolÃgicas (Hb, Ht e Plaquetas). Houve correlaÃÃo entre o estadiamento clÃnico de Rai e o tratamento farmacolÃgico e com os marcadores de prognÃstico (ZAP-70 e CD38). O perfil foi caracterizado por pacientes em estÃgios clÃnicos, segundo Rai, de baixo risco, com ausÃncia da expressÃo dos marcadores de prognÃstico (ZAP-70 e CD38) e com ausÃncia de tratamento especÃfico. / Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) is the most frequent leukemia on western countries, responding for 30% off all leukemia cases, reaching, specially, the under 65 years old population. It is characterized by accumulation of neoplasic mature B lymphocytes positives CD5. Concerning epidemiology, it is barely seen among eastern people, and its incidence is not influenced by environmental agents, such as toxic substances or ionizing radiation. CLL-B patients may present a variable clinical evolution, which goes from indolent to aggressive and rapidly fast cases. On last decade, there have been great advance on biology knowledge of this disease, and greater impact prognostic factors have been established. In relation to treatment, new medication, with better efficacy, appeared. Therefore, it is interesting to know the real situation of this disease, which has singular epidemiological, clinical and prognostic characteristics. In this work we trace the demographical, clinical and laboratorial profile of patients with CLL-B, at a state hemocenter (HEMOCE). We correlate prognostic markers expression (CD38 e ZAP-70) with some variable and with pharmacological treatment. We used 55 blood samples from patients CLL-B confirmed by their immunophenotypes; these patients may or may not be in treatment. CD38 and ZAP-70 were analyzed by flow cytometry and β2-microglobulin dosage, obtained through ELISA. Results were treated by statistic program. We see a discrete prevalence of male patients (1,4:1), 78% are under 65 years old and 60% live at CearÃâs capital. In relation to Rai staging system, 50,9% were classified as low risk patients. Concerning clinical evolution, more than 30% of the patients did not show clinical signs, neither at diagnose moment nor at the end of this study. In relation to the markers, 22,2% of the patients show ZAP-70 expression, and 24,13% show CD38 expression. There was no significant statistic difference between ZAP-70 and CD38 markers and hematological variable (Hb, Ht and platelets). There was correlation between Raiâs staging and pharmacological treatment and with prognostic markers. CONCLUSION: The profile was characterized by low risk patients, according Raiâs staging, it lacks prognostic markers expression and it also lacks specific treatment.

Introdução: A leucemia linfoide aguda (LLA) \"BCR-ABL1-like\" exibe um perfil de expressão gênica semelhante ao observado em pacientes com LLA BCR-ABL1+. Este subtipo representa até 15% de todos os casos de LLA de linhagem B na população pediátrica e é frequentemente associado à presença de deleção total ou parcial do gene IKZF1. As isoformas de domínio negativo têm sido associadas a um aumento na chance de falha de resposta ao tratamento e tem sido associada com pior prognóstico. Objetivos: Analisar a presença de deleções do gene IKZF1 e a expressão de suas isoformas em amostras de medula óssea ao diagnóstico de crianças com LLA por técnica simplificada e de baixo custo de RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) e avaliar a associação desta alteração com fatores clínicos, biológicos e sobrevida. Metodologia: Foram analisadas 137 amostras de medula óssea colhidas ao diagnóstico de crianças com LLA, sendo 100 amostras de LLA de linhagem B, 35 de linhagem T e 2 na qual não foi possível a definição do imunofenópo, todas classificadas e tratadas segundo o protocolos GBTLI-99. A presença de deleções das isoformas do gene IKZF1 foi analisada por técnica de RT-PCR e confirmadas por sequenciamento automático. Associação entre deleção do IKZF1 e as variáveis idade, número de glóbulos brancos, grupo de risco, subgrupo molecular, presença de doença residual mínima e evento (recidiva ou óbito) foi analisada pelo teste exato de Fisher. Sobrevida livre de eventos, sobrevida livre de doença e sobrevida global foram avaliadas por curvas de Kaplan-Meier e teste log-rank. Análise multivariada por modelo de regressão de Cox foi utilizada para testar a independência dos fatores prognósticos. Resultados: Deleção total ou parcial no gene IKZF1 foi observada em 27/100 amostras de LLA B-derivada, sendo 15 evidenciando hiperexpressão das isoformas 6 ou 10, em 9 a expressão das isoformas foi de fraca intensidade e em 3 houve deleção total do gene. Nas amostras de LLA T-derivada foram observadas 3 alterações sendo 2 hiperexpressões da isoforma Ik6 e uma deleção total do gene. Presença de expressão forte das isoformas Ik6/Ik10 de IKZF1 foi associada na LLA B-derivada com pior sobrevida livre de eventos (SG), sobrevida livre de doença (SLD) e sobrevida global (SG)(P<0,001)). A presença de qualquer deleção do gene teve impacto apenas na SG (P=0,003). A sobrevida livre de eventos em 5 anos foi de 78,1 ± 4,6% versus 32 ± 12,4 % (P< 0,001), para os grupos sem e com expressão forte das isoformas Ik6/Ik10 forte de IKZF1 respectivamente, com risco relativo de evento desfavorável de 6.034 (95% IC: 2,105 - 17,295) para a presença da deleção. Análise multivariada por modelo de regressão de Cox nas LLA de linhagem B mostrou que expressão forte das isoformas Ik6/Ik10 foi o principal fator prognóstico independente (P<0.001) quando analisada em associação com idade, imunofenótipo (ausência de CD10), status da medula óssea no D28 da terapia de indução (M2/M3) e presença de DRM no D28 da indução tanto para SLE, quanto para SLD e SG. Nossos dados sugerem que o uso de técnica simplificada e de baixo custo para análise de deleções do gene IKZF1 é capaz de detectar pacientes com maior risco de recidiva, podendo ser útil na estratificação de pacientes com LLA de linhagem B em futuros protocolos de tratamento. Estudos multicêntricos com maior número de casos são necessários para confirmação destes resultados. / Introduction: Acute lymphoblastic leukemia (ALL) \"BCR-ABL1-like\" exhibits a gene expression profile similar to that observed in patients with BCR-ABL1 + ALL. This subtype accounts for up to 15% of all B lineage ALL cases in the pediatric population and is often associated with the presence of total or partial deletion of the IKZF1 gene. Negative domain isoforms have been associated with an increased chance of treatment failure and have been associated with poorer prognosis. Objectives: To analyze the presence of deletions of the IKZF1 gene and the expression of its isoforms in bone marrow samples to the diagnosis of children with ALL by simplified technique and lowcost RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) and to evaluate the association of this with clinical, biological and survival factors. Methodology: It has been analyzed 137 bone marrow samples collected at the diagnosis of children with ALL, 100 samples of ALL B lineage , 35 of T lineage and 2 in which it was not possible to define the immunophenotype, all classified and treated according to GBTLI protocols -99. The presence of deletions of the IKZF1 gene isoforms was analyzed by RT-PCR technique and confirmed by automatic sequencing. The association between IKZF1 deletion and the variables age, white blood cell count, risk group, molecular subgroup, presence of minimal residual disease and event (recurrence or death) were analyzed by the Fisher exact test. Event-free survival, disease-free survival and overall survival were assessed by Kaplan-Meier curves and log-rank test. Multivariate analysis by Cox regression model was used to test the independence of prognostic factors. Results: Total or partial deletion in the IKZF1 gene was observed in 27/100 samples of B-derived ALL, 15 of which showed hyperexpression of isoforms 6 or 10, in 9 the expression of the isoforms was of low intensity and in 3 there was total deletion of the gene . In the T- derived ALL samples, 3 alterations were observed, 2 hyperexpressions of the Ik6 isoform and a total deletion of the gene. The presence of strong Ik6/Ik10 isoform expression was associated in B-derived ALL with worse event-free survival (SLE), disease-free survival (SLD), and overall survival (OS) (P <0.001). The presence of any deletion of the gene had an impact only on the SLE (P = 0.003). The 5-year event-free survival was 78.1 ± 4.6% versus 32 ± 12.4% (P <0.001), for the groups with and without a strong deletion of IKZF1 respectively, with relative risk of unfavorable event of 6,034 (95% CI: 2,105 - 17,295) for the presence of the deletion. Multivariate analysis by Cox regression model in B lineage ALL showed that the strong expression of Ik6 / Ik10 isoforms was the main independent prognostic factor (P <0.001) when analyzed in association with age, immunophenotype (absence of CD10), marrow status bone in D28 of induction therapy (M2 / M3) and presence of DRM in induction D28 for both SLE, SLD and SG. Our data suggest that the use of simplified and low-cost IKZF1 gene deletion analysis is capable of detecting patients at higher risk of relapse and may be useful in the stratification of patients with B lineage ALL in future treatment protocols. Multicentric studies with a greater number of cases are necessary to confirm these results.

Introdução: A leucemia linfoide aguda (LLA) \"BCR-ABL1-like\" exibe um perfil de expressão gênica semelhante ao observado em pacientes com LLA BCR-ABL1+. Este subtipo representa até 15% de todos os casos de LLA de linhagem B na população pediátrica e é frequentemente associado à presença de deleção total ou parcial do gene IKZF1. As isoformas de domínio negativo têm sido associadas a um aumento na chance de falha de resposta ao tratamento e tem sido associada com pior prognóstico. Objetivos: Analisar a presença de deleções do gene IKZF1 e a expressão de suas isoformas em amostras de medula óssea ao diagnóstico de crianças com LLA por técnica simplificada e de baixo custo de RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) e avaliar a associação desta alteração com fatores clínicos, biológicos e sobrevida. Metodologia: Foram analisadas 137 amostras de medula óssea colhidas ao diagnóstico de crianças com LLA, sendo 100 amostras de LLA de linhagem B, 35 de linhagem T e 2 na qual não foi possível a definição do imunofenópo, todas classificadas e tratadas segundo o protocolos GBTLI-99. A presença de deleções das isoformas do gene IKZF1 foi analisada por técnica de RT-PCR e confirmadas por sequenciamento automático. Associação entre deleção do IKZF1 e as variáveis idade, número de glóbulos brancos, grupo de risco, subgrupo molecular, presença de doença residual mínima e evento (recidiva ou óbito) foi analisada pelo teste exato de Fisher. Sobrevida livre de eventos, sobrevida livre de doença e sobrevida global foram avaliadas por curvas de Kaplan-Meier e teste log-rank. Análise multivariada por modelo de regressão de Cox foi utilizada para testar a independência dos fatores prognósticos. Resultados: Deleção total ou parcial no gene IKZF1 foi observada em 27/100 amostras de LLA B-derivada, sendo 15 evidenciando hiperexpressão das isoformas 6 ou 10, em 9 a expressão das isoformas foi de fraca intensidade e em 3 houve deleção total do gene. Nas amostras de LLA T-derivada foram observadas 3 alterações sendo 2 hiperexpressões da isoforma Ik6 e uma deleção total do gene. Presença de expressão forte das isoformas Ik6/Ik10 de IKZF1 foi associada na LLA B-derivada com pior sobrevida livre de eventos (SG), sobrevida livre de doença (SLD) e sobrevida global (SG)(P<0,001)). A presença de qualquer deleção do gene teve impacto apenas na SG (P=0,003). A sobrevida livre de eventos em 5 anos foi de 78,1 ± 4,6% versus 32 ± 12,4 % (P< 0,001), para os grupos sem e com expressão forte das isoformas Ik6/Ik10 forte de IKZF1 respectivamente, com risco relativo de evento desfavorável de 6.034 (95% IC: 2,105 - 17,295) para a presença da deleção. Análise multivariada por modelo de regressão de Cox nas LLA de linhagem B mostrou que expressão forte das isoformas Ik6/Ik10 foi o principal fator prognóstico independente (P<0.001) quando analisada em associação com idade, imunofenótipo (ausência de CD10), status da medula óssea no D28 da terapia de indução (M2/M3) e presença de DRM no D28 da indução tanto para SLE, quanto para SLD e SG. Nossos dados sugerem que o uso de técnica simplificada e de baixo custo para análise de deleções do gene IKZF1 é capaz de detectar pacientes com maior risco de recidiva, podendo ser útil na estratificação de pacientes com LLA de linhagem B em futuros protocolos de tratamento. Estudos multicêntricos com maior número de casos são necessários para confirmação destes resultados. / Introduction: Acute lymphoblastic leukemia (ALL) \"BCR-ABL1-like\" exhibits a gene expression profile similar to that observed in patients with BCR-ABL1 + ALL. This subtype accounts for up to 15% of all B lineage ALL cases in the pediatric population and is often associated with the presence of total or partial deletion of the IKZF1 gene. Negative domain isoforms have been associated with an increased chance of treatment failure and have been associated with poorer prognosis. Objectives: To analyze the presence of deletions of the IKZF1 gene and the expression of its isoforms in bone marrow samples to the diagnosis of children with ALL by simplified technique and lowcost RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) and to evaluate the association of this with clinical, biological and survival factors. Methodology: It has been analyzed 137 bone marrow samples collected at the diagnosis of children with ALL, 100 samples of ALL B lineage , 35 of T lineage and 2 in which it was not possible to define the immunophenotype, all classified and treated according to GBTLI protocols -99. The presence of deletions of the IKZF1 gene isoforms was analyzed by RT-PCR technique and confirmed by automatic sequencing. The association between IKZF1 deletion and the variables age, white blood cell count, risk group, molecular subgroup, presence of minimal residual disease and event (recurrence or death) were analyzed by the Fisher exact test. Event-free survival, disease-free survival and overall survival were assessed by Kaplan-Meier curves and log-rank test. Multivariate analysis by Cox regression model was used to test the independence of prognostic factors. Results: Total or partial deletion in the IKZF1 gene was observed in 27/100 samples of B-derived ALL, 15 of which showed hyperexpression of isoforms 6 or 10, in 9 the expression of the isoforms was of low intensity and in 3 there was total deletion of the gene . In the T- derived ALL samples, 3 alterations were observed, 2 hyperexpressions of the Ik6 isoform and a total deletion of the gene. The presence of strong Ik6/Ik10 isoform expression was associated in B-derived ALL with worse event-free survival (SLE), disease-free survival (SLD), and overall survival (OS) (P <0.001). The presence of any deletion of the gene had an impact only on the SLE (P = 0.003). The 5-year event-free survival was 78.1 ± 4.6% versus 32 ± 12.4% (P <0.001), for the groups with and without a strong deletion of IKZF1 respectively, with relative risk of unfavorable event of 6,034 (95% CI: 2,105 - 17,295) for the presence of the deletion. Multivariate analysis by Cox regression model in B lineage ALL showed that the strong expression of Ik6 / Ik10 isoforms was the main independent prognostic factor (P <0.001) when analyzed in association with age, immunophenotype (absence of CD10), marrow status bone in D28 of induction therapy (M2 / M3) and presence of DRM in induction D28 for both SLE, SLD and SG. Our data suggest that the use of simplified and low-cost IKZF1 gene deletion analysis is capable of detecting patients at higher risk of relapse and may be useful in the stratification of patients with B lineage ALL in future treatment protocols. Multicentric studies with a greater number of cases are necessary to confirm these results.