Würzburg, Univ., Diss., 2000. / Zsfassung in dt. Sprache. - Auch als CD-Rom.

Techn. Universiẗat, Diss., 2005--München.

Würzburg, Univ., Diss., 2003.

München, Techn. Univ., Diss., 2002.

Würzburg, Univ., Diss., 2001. / Erscheinungsjahr an der Haupttitelstelle: 2001

Würzburg, Univ., Diss., 2001. / Erscheinungsjahr an der Haupttitelstelle: 2000

Diabetes mellitus Typ 1 ist eine chronische Autoimmunkrankheit, bei der die Beta-Zellen der Langerhans-Inseln im Pankreas durch autoreaktive T Lymphozyten zerstört werden und somit die Insulinproduktion zum Erliegen kommt. Die vorliegende prospektive Querschnittsstudie untersucht die die Reaktion und Polarisierbarkeit der peripheren T Lymphozyten, die Zytokinproduktion der PBMCs und die Expression der spezifischen Transkriptionsfaktoren Tbet (Th1), FoxP3 (Th17) und RORc (Treg) nach Stimulation mit diabetesspezifischen Antigenen und Candida albicans bei sieben gesunden Kontrollen, neun erstmanifestierten T1DM Patienten und elf langzeiterkrankten T1DM Patienten. Bei der Untersuchung der spezifischen CD4+ T Zellen zeigte sich, dass EM sowohl im unstimulierten Ansatz, aber auch nach Stimulation mit den Antigenen eine größere Proliferationsaktivität aufwies als HD und LS. Interessanterweise war ein vergleichbarer Unterschied bei den CD8+ T Zellen lediglich nach Stimulation mit GAD65 zu sehen. Bei Betrachtung der CD4+ Subpopulationen erkennt man, dass es in allen Kohorten große interindividuelle Unterschiede gibt und man keine signifikanten Unterschiede zwischen den Kohorten beobachten kann. Trotzdem lässt sich sagen, dass sich die Subpopulationen nach den spezifischen Stimulationen in den drei Kohorten teilweise unterschiedlich verschieben und dies Anzeichen dafür ist, dass die T Zellen der T1DM Patienten auf diese Antigene anders verhalten als HD. Bei den CD8+ TEMRAs gibt es mehrere signifikante Unterschiede und es fällt auf, dass EM deutlich weniger TEMRA aufweisen als die anderen beiden Kohorten. Sowohl bei den CD25+ Tregs als auch bei den CD161+ Th17 Zellen zeigen sich keine relevanten Signifikanzen. Die Chemokinrezeptor tragenden weisen sowohl bei den CD4+-T Zellen als auch bei den CD8+ T Zellen Unterschiede und auch Parallelen zwischen den Kohorten auf. Während sich die CD4+CCR5+ Th1 Zellen bei EM durch die Antigene polarisieren lassen, findet bei HD keine Polarisierung statt. Dafür tragen die HD über allen Ansätzen mehr CD4+ und CD8+CXCR3+ Th1 Zellen als EM. Bei den Chemokinrezeptoren CCR6+ und CD25+CCR5+ zeigen sich keine bemerkenswerten Unterschiede oder Polarisierungen durch die Antigene. Im Einklang mit den Ergebnissen der Phänotypisierung der Th1, Th17 und Treg Zellen stehen die der spezifischen Transkriptionsfaktoren. Auch hier waren keine signifikanten Unterschiede zwischen den drei Kohorten vorhanden. Interessanterweise zeigte sich jedoch, dass die relative Transkription nach Stimulation mit den Antigenen in allen drei Kohorten fast ausnahmslos abnahm. Abschließend ist zu erwähnen, dass die Probandenzahl bei dieser Untersuchung sehr klein war und große interindividuelle Unterschiede vorlagen. Bei Betrachtung des Th1 spezifischen Zytokins IFN y fiel auf, dass HD und LS im unstimulierten Ansatz deutlich mehr produzierte als EM, während die Konzentrationen durch Stimulation mit den diabetesspezifischen Antigenen bei HD und LS stark abfiel und bei EM annähernd gleichgeblieben ist. Auffallend war außerdem, dass die durchschnittliche Produktion des Th17 spezifischen Zytokins IL 17 von EM in vielen Ansätzen deutlich größer war als von HD. Das hauptsächlich von den Treg Zellen produzierte IL-10 war bei den T1DM Patienten deutlich kleiner als bei HD. Ebenso wie IFN-y fiel die Konzentration durch die Stimulationen bei HD jedoch stark ab, während sie bei EM und LS gleichblieb oder anstieg. Insgesamt lässt sich sagen, dass es große interindividuelle Unterschiede innerhalb der Kohorten hinsichtlich der Produktion der Zytokine in den verschiedenen Ansätzen gab. Somit ist es von enormem Interesse, die Zytokinproduktion nach Stimulation mit den diabetesspezifischen Antigenen in den verschiedenen Kohorten an einer größeren Anzahl an Probanden zu untersuchen. Zusammenfassend ergeben sich einzelne Hinweise, dass sich die Reaktion der T Zellen auf diabetesspezifische Antigene bei erstmanifestierten T1DM von HD unterscheiden. Inwieweit einzelne Autoantigen-spezifische Subpopulationen, Transkriptionsfaktoren oder proinflammatorische bzw. antiinflammatorische Zytokine eine Rolle in der Pathogenese des T1DM spielen und diese ein Angriffsziel für Therapeutika sein könnten, gilt es weiterhin in humanen Studien herauszufinden. / Diabetes mellitus type 1 is a chronic autoimmune disease in which the beta cells of the islets of Langerhans in the pancreas are destroyed by autoreactive T lymphocytes, thus the insulin production is stopped. The present prospective cross-sectional study investigates the response and polarizability of peripheral T lymphocytes, the cytokine production of PBMCs and the expression of the specific transcription factors Tbet (Th1), FoxP3 (Th17) and RORc (Treg) after stimulation with diabetic specific antigens and Candida albicans in seven healthy controls, nine first manifested T1DM patients and eleven long-term T1DM patients. Examination of the specific CD4+ T cells showed that EM had a higher proliferation activity than HD and LS both in the unstimulated approach and after stimulation with the antigens. Interestingly, a comparable difference in CD8+ T cells was only seen after stimulation with GAD65. When looking at the CD4+ subpopulations, it is evident that there are large interindividual differences in all cohorts and no significant differences between the cohorts can be observed. Nevertheless, it can be said that the subpopulations shift differs after specific stimulation in the three cohorts and this is an indication that the T cells of T1DM patients respond differently to these antigens than HD. In CD8+ TEMRAs there are several significant differences and it is noticeable that EM show significantly less TEMRA than the other two cohorts. Both CD25+ Tregs and CD161+ Th17 cells do not show any relevant significance. The chemokine receptor carrying cells show differences and parallels between the cohorts in both CD4+ T cells and CD8+ T cells. While CD4+CCR5+ Th1 cells are polarized by the antigens in EM, no polarization occurs in HD. However, HD carries more CD4+ and CD8+CXCR3+ Th1 cells than EM. The chemokine receptors CCR6+ and CD25+CCR5+ do not show any remarkable differences or polarization by the antigens. The results of phenotyping of Th1, Th17 and Treg cells are consistent with those of the specific transcription factors. Again, there were no significant differences between the three cohorts. Interestingly, however, it was found that relative transcription decreased almost without exception in all three cohorts after stimulation with the antigens. Finally, it should be mentioned that the number of subjects in this study was very small and that there were large interindividual differences. When looking at the Th1 specific cytokine IFN-y, it was noticeable that HD and LS produced significantly more than EM in the unstimulated approach, whereas the concentrations dropped sharply in HD and LS after stimulation with the diabetic-specific antigens and remained approximately the same in EM. It was also remarkable that the average production of the Th17 specific cytokine IL-17 of EM was significantly higher in many approaches than in HD. The IL-10 produced mainly by Treg cells was significantly smaller in T1DM patients than in HD. Like IFN-y, however, the concentration decreased significantly in HD, while it remained the same or increased in EM and LS. Overall, it can be said that there were large interindividual differences within the cohorts regarding the production of cytokines in the different approaches. Therefore, it is of great interest to study the cytokine production after stimulation with the diabetic specific antigens in the different cohorts in a larger number of volunteers. In summary, there is some evidence that the response of T cells to diabetes-specific antigens differs from HD in first manifested T1DM. The extent to which individual autoantigen-specific subpopulations, transcription factors or proinflammatory or anti-inflammatory cytokines play a role in the pathogenesis of T1DM and could be a target for therapeutic agents remains to be determined in human studies.

Die Immunthrombozytopenie (ITP) ist eine erworbene Autoimmunerkrankung, bei der sich Autoantikörper gegen Thrombozyten bilden. Dadurch werden diese, unter anderem in der Milz, vermehrt abgebaut und es treten Blutungskomplikationen auf. Der fehlgeleiteten Immunabwehr wird versucht mit medikamentösen Therapien wie z. B. mit Glucocorticoiden und Rituximab bis hin zur Splenektomie entgegenzuwirken. Im Rahmen dieser Arbeit untersuchte ich durchflusszytometrisch die Verteilung der B-Zell-Subpopulationen bei Patienten mit chronischer, primärer ITP und Gesunden hinsichtlich einer möglichen Störung in der B-Zell-Entwicklung und -Differenzierung. Dabei wurden 7 Knochenmark-, 28 Blut- und 12 Milzproben von ITP-Patienten sowie 5 Knochenmark- und 10 Milzproben von Gesunden aufbereitet. Anschließend wurden die B-Zell-Subpopulationen mittels immunphänotypischer Marker gefärbt um die Proben danach durchflusszytometrisch zu vermessen und zu charakterisieren. Zusätzlich erfolgte der Vergleich zu laboreigenen, bereits etablierten Referenzwerten von 220 Blutproben von Gesunden. Bei den Knochenmarkproben konnten keine signifikanten Unterschiede in der Verteilung von Vorläufer-B-Zellen zwischen den ITP-Patienten und den Gesunden beobachtet werden, d. h. die frühe B-Zell-Entwicklung im Knochenmark erscheint bei der ITP auf zellulärer Ebene nicht beeinträchtigt. Die Analyse der Blutproben zeigte, dass auch keine signifikanten Unterschiede in der Verteilung von naiven B-Zellen zwischen den ITP-Patienten und den Gesunden vorzufinden sind. Dies bekräftigt, dass bei der ITP auf zellulärer Ebene keine Abweichungen in der frühen pre-immunen B-Zell-Entwicklung vorzuliegen scheinen und eine intakte B-Zell-Reifung bis hin zur naiven B-Zelle stattfindet. Es zeigte sich jedoch bei den ITP-Patienten ein erhöhter Anteil an anergen B-Zellen und atypischen Gedächtnis-B-Zellen, von denen allgemein angenommen wird, dass sie aus einer chronischen bzw. dysregulierten antigen-abhängigen B-Zell-Aktivierung entstammen. Aus der Untersuchung der Milzproben zeigte sich zudem, dass bei den ITP-Patienten der Anteil der antikörperproduzierenden Plasmablasten im Vergleich zu den Gesunden erhöht ist. Folglich lassen sich bei der ITP auf zellulärer Ebene vor allem Abweichungen in der späten Phase der B-Zell-Differenzierung nachweisen. Es kann somit angenommen werden, dass Störungen der B-Zell-Entwicklung, wie sie auf zellulärer Ebene bei verschiedenen mit sekundärer ITP einhergehenden Erkrankungen (systemischer Lupus erythematodes, variables Immundefektsyndrom) beschrieben wurden, bei der primären ITP nicht für die Produktion von antithrombozytären Antikörpern notwendig sind. Eine weitere detaillierte Aufarbeitung, auf welcher Ebene der B-Zell-Differenzierung der Toleranzverlust gegenüber thrombozytären Antigenen auftritt, ist entscheidend für die zukünftige Entwicklung spezifischer, zellgerichteter Therapien. / Immune thrombocytopenia (ITP) is an acquired autoimmune disease in which autoantibodies against platelets are produced. As a result, the platelets are increasingly reduced in the spleen, and bleeding disorders occur. The misdirected immune defense is tried to counteract with drug therapies such as glucocorticoids and rituximab up to surgery with splenectomy. In this study, I used flow cytometry to investigate the distribution of B-cell subpopulations in patients with chronic, primary ITP and healthy individuals regarding possible disruptions in B-cell development and differentiation. 7 bone marrow, 28 blood and 12 spleen samples from ITP patients as well as 5 bone marrow and 10 spleen samples from healthy individuals were processed. The B-cell subpopulations were stained using immunophenotypic markers to measure and characterize the samples by flow cytometry. In addition, the results were compared with the laboratory's own established reference values of 220 blood samples from healthy individuals. No significant differences in the distribution of precursor B cells between the ITP patients and the healthy subjects could be observed in the bone marrow samples. Therefore, the early B-cell development in the bone marrow does not appear to be impaired in ITP at the cellular level. The analysis of the blood samples showed that there were no significant differences in the distribution of naive B cells between the ITP patients and the healthy individuals. This confirms that in ITP at the cellular level there seem to be no deviations in the early pre-immune B-cell development and that intact B-cell maturation takes place up to naive B-cells. However, ITP patients revealed an increased proportion of anergic B-cells and atypical memory B-cells, which are generally assumed to originate from chronic or dysregulated antigen-dependent B-cell activation. The examination of the spleen samples also displayed that the proportion of antibody-producing plasmablasts in ITP patients is higher than in healthy individuals. Consequently, in ITP at the cellular level especially deviations in the late phase of B-cell differentiation can be detected. It can thus be assumed that disorders of B-cell development, as described at the cellular level in various diseases associated with secondary ITP (systemic lupus erythematosus, variable immunodeficiency syndrome), are not necessary for the production of anti-platelet antibodies in primary ITP. A further detailed investigation at which stage of the B-cell differentiation a loss of tolerance to platelet antigens occurs is crucial for the future development of specific, cell-directed therapies.

Die HIV-Infektion wird von einer Hyperimmunaktivierung begleitet, die vermutlich eine treibende Kraft in der Pathogenese der Entwicklung von AIDS darstellt. Die Rolle der B-Zellen im Rahmen dieser Veränderungen und dem Einfluss einer Prednisolontherapie wird durch die ProCort-Studie genauer beschrieben. Diese stellt eine zweijährige, Placebo-kontrollierte, randomisierte Doppelblindstudie dar, bei der die Patienten 5mg Prednisolon täglich einnahmen. Mittels durchflusszytometrischen Messungen wurden bestimmte B-Zellpopulationen differenziert und quantifiziert. Die resultierenden Ergebnisse wurden weiterhin mit bekannten Immunaktivierungsmarkern korreliert. In der Arbeit konnte gezeigt werden, dass Studienteilnehmerinnen durch eine Prednisolontherapie signifikant mehr Memory-B-Zellen bzw. resting Memory-B-Zellen im Vergleich zur Placebogruppe aufweisen. Ferner konnte die Bedeutung der B-Zellen als prognostischer Marker der HIV-Infektion dadurch unterstützt werden, dass die genannten B-Zellreihen signifikant negative Korrelationen zu anderen, bereits etablierten Progressionsmarkern (CD4/CD8-Ratio, CD8/CD38/HLADR-Aktivierung, suPAR, sCD14) vorlagen. Zusammenfassend zeigt die Arbeit, dass die Veränderungen im B-Zellkompartment Teil des Immunaktiverungsprozesses im Rahmen der HIV- Infektion sind und Prednisolon modulierende Einflüsse darauf hat. / The HIV-infection goes along with a chronic immune activation, which is considered as the driving force of progression to AIDS. As part of the ProCort trial, which is a double-blind, randomized, placebo-controlled clinical trial over two years, HIV-infected patients got 5 mg prednisolone per day for two years. In this dissertation specific b-cell-populations were measured and correlated with known biomarkers of immune activation (CD38+/HLADR+ t-cells, suPAR, sCD14). As result higher counts of memory-b-cells and resting-memory-b-cells especially in the female subgroup were found. Furthermore these cell-populations showed a negative correlation with biomarkers of immune activation. In summary the prednisolone therapy had positive immune modulating effects on b-cells and biomarkers of immune activation.

Cardiovascular diseases (CVD), subsuming atherosclerosis of the coronary arteries and subsequent myocardial infarction, are the leading cause of death in the European Union (over 4 million deaths annually), with devastating individual and economic consequences. Recent studies revealed that T cells play a crucial role in post-MI inflammation, healing and remodelling processes. Nevertheless, the specificity profile of adaptive immune responses in the infarcted myocardium has not yet been differentiated. The experiments portrayed in this thesis sought to assess whether post-MI CD4+ T cell responses in mice are triggered by heart specific antigens, and eventually identify relevant epitopes. We were able to create a murine antigen atlas including a list of 206 epitopes for I-Ab and 193 epitopes for I-Ad presented on MHC-II in the context of MI. We sought to consecutively test this panel by in vitro T cell proliferation and antigen recall assays ex vivo. The elispot assay was used as a readout for antigen-specific stimulation by measurement of IL-2 and IFN-γ production, currently the most sensitive approach available to detect even small counts of antigen producing cells. Splenocytes as well as lymphocytes from mediastinal lymph nodes were purified from animals 7 days or 56 days after EMI conducted by ligation of the left anterior descending artery. We were able to provide evidence that post-MI T cell responses in Balb/c mice are triggered by heart-specific antigens and that MYHCA, especially MYHCA614-628, is relevant for that response. Moreover, a significant specific T cell response after MI in C57BL/6J mice was observed for α actin, cardiac muscle 1 [ACTC1], myosin-binding protein C3 [MYBPC3] and myosin heavy chain α [MYHCA] derived heart specific antigens. Generally, the epitopes of interest for Balb/c as well as C57BL/6J could be further investigated and may eventually be modulated in the future. / Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) sowie der häufig folgende Myokardinfarkt sind die häufigsten Todesursachen in der Europäischen Union (über 4 Millionen Todesfälle pro Jahr) mit verheerenden individuellen und wirtschaftlichen Folgen. Aktuelle Studien haben gezeigt, dass T-Zellen eine entscheidende Rolle bei Entzündungs-, Heilungs- und Umbauprozessen nach einem Myokardinfarkt spielen. Das Spezifitätsprofil adaptiver Immunantworten im infarzierten Myokard konnte bisher jedoch noch nicht differenziert werden. Die in dieser Arbeit dargestellten Experimente gingen der Frage nach, ob CD4+ T-Zellantworten nach einem Myokardinfarkt in Mäusen durch herzspezifische Antigene ausgelöst werden und ob hieraus relevante Epitope identifiziert werden können. Uns gelang es, einen Maus-Antigen-Atlas zu erstellen, der eine Zusammenstellung von 206 Epitopen für I-Ab und 193 Epitope für I-Ad enthält, welche auf MHC-II im Rahmen des Myokardinfarkts präsentiert werden. Dieses Panel wurde nacheinander durch In-vitro-T-Zell-Proliferations- und Antigen-Recall-Assays ex vivo getestet. Der Elispot-Assay wurde als sensitivster verfügbare Ansatz zur Quantifizierung der antigen-spezifischen Stimulation durch Messung der IL-2- und IFN-γ-Produktion verwendet. Splenozyten sowie Lymphozyten aus mediastinalen Lymphknoten der Mäuse wurden 7 Tage bzw. 56 Tage nach einem experimentellen Myokardinfarkt, welcher durch Ligation der RIVA Arterie durchgeführt wurde, aufgereinigt. Wir konnten nachweisen, dass Post-MI-T-Zellantworten in Balb/c Mäusen durch herzspezifische Antigene ausgelöst werden, und dass MYHCA, insbesondere MYHCA614-628, für diese Antwort relevant ist. Darüber hinaus konnte eine signifikante spezifische T-Zell-Antwort nach Myokardinfarkt in C57BL/6J Mäusen auf aus Alpha-Actin des Herzmuskels 1 [ACTC1], Myosin-bindendes Protein C vom Herztyp [MYBPC3] und der schweren Kette des Myosins α [MYHCA] generierten herzspezifischen Antigenen gezeigt werden.