In der nicht vollständig geklärten Pathogenese der juvenilen idiopathischen Arthritis (JIA) spielen insbesondere Effektor-T-Zellen und regulatorische T-Zellen (Tregs), sowie das Kontinuum ihrer plastischen Zelltypen eine wichtige Rolle. Im arthritischen Milieu, das auch Interleukin-17 (IL-17) beinhaltet, verschiebt sich das Gleichgewicht dieser Zellen hin zur Inflammation. Ziel dieser Arbeit war es, die T-Zellbalance im peripheren Blut von JIA-Patienten mit gesunden Kontrollen (HC) zu vergleichen, sowie den Einfluss von IL-17, anti-IL-17 und eines Th17-stimulierenden, proinflammatorischen Zytokinmilieus auf Phänotyp und Funktion der Tregs zu untersuchen. Es erfolgte die durchflusszytometrische Analyse des Lymphozytenpools von 16 JIA- und 10 HC-Probanden. Isolierte CD25+CD127-CD4+ Tregs wurden mit den genannten Stimuli kultiviert und danach durchflusszytometrisch phänotypisch sowie in Co-Kultur mit peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) auf ihre Suppressionsfunktion untersucht. Wir stellten erhöhte Proportionen von Th17-Zellen, Tregs und effector-like Tregs in JIA-Patienten fest. Bei Stimulation mit dem Th17-Cocktail zeigte sich eine verminderte Suppression der Effektor-Zellen durch Tregs bei zeitgleich vermehrter FoxP3-Expression insbesondere in JIA-Tregs. Secukinumab bewirkte eine Anpassung der FoxP3-Expression der Tregs in der Patientengruppe auf etwa das Niveau der gesunden Kontrollen. Insgesamt bestätigt diese Arbeit eine proinflammatorische Dysbalance bei JIA-Patienten mit Shift zu Th17-like Tregs als möglicherweise pathologischen Phänotyp. Ursache für die verminderte Suppression ist vermutlich eine gesteigerte Resistenz der Effektor-Zellen durch das Inflammationsmilieu. Die vermehrte FoxP3-Expression der JIA-Tregs ist am ehesten durch eine gesteigerte Zellaktivierung zu erklären. Diese erhöhte Sensitivität der Tregs für inflammatorische Stimuli mit vermehrter Aktivierung ist ein möglicher Ansatzpunkt für zukünftige Therapien. Die Adjustierung der FoxP3-Expression unter Secukinumab in der JIA-Gruppe auf Niveau der Kontrollen bildet daher einen denkbaren zusätzlichen therapeutischen Effekt der IL-17A Blockade durch potenzielle intrinsische Stabilisierung des Phänotyps der Tregs bei der JIA ab. / Background and Objective: As the exact pathophysiology of juvenile idiopathic arthritis (JIA) is yet not fully resolved, an important focus of research lays nowadays in the delicate balance between regulatory T cells (Tregs) and effector T-cells. In an arthritic milieu, involving interleukin-17 (IL-17), plasticity towards proinflammatory cell types is seen. The aim of the study was to analyze the distribution of Tregs and effector T-cells in the peripheral blood of JIA patients and healthy controls (HC). Besides that, the influence of IL-17, of anti-IL-17 and of a Th17-stimulating environment on phenotype and function of Tregs was investigated to determine a possible drift away from or towards an antiinflammatory immune status. Methods: Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were obtained from blood samples of 16 JIA patients and 10 HC and compared for differences in the lymphocytes’ characteristics. Isolated CD25+CD127-CD4+ Tregs were analyzed with flow cytometry after cultivation with the above-mentioned stimulating agents. Furthermore, suppression assays were performed to assess the Treg-mediated inhibition on proliferation of autologous PBMC proliferation after co-culture. Results: A shift towards pro-inflammatory T cells with elevated Th17-levels and concomitant increased amount of Tregs and Th17-like Tregs in JIA patients was detected. A diminished suppression of PBMC proliferation by Tregs in the Th17-stimulation environment was determined. This environment also promoted an increased FoxP3-expression on Tregs, especially in JIA. Secukinumab lead to adjustment of FoxP3-expression in JIA-Tregs to levels found in HC. Conclusion: Our results implicate that the increased proportions of Th17 cells and Th17-like Tregs might play an important part in the pathophysiology of JIA mediating the proinflammatory dysbalance. The mitigated inhibition of PBMC-proliferation in the Th17-environment is most likely the result of an effector cell resistance. The augmented FoxP3-expression in Th17-environment may be due to an increased cell activation, which especially JIA Tregs were prone to. This increased sensitivity of Tregs to inflammation might open new therapeutic approaches. The difference of FoxP3-activation was less pronounced after cultivation with Secukinumab, suggesting an adjustment of Treg activation in JIA to levels found in HC. This could demonstrate an additional benefit in IL-17A-inhibition in JIA possibly via intrinsically stabilizing the Treg phenotype.

Blimp-1 (B lymphocyte induced maturation protein-1) kontrolliert die Regulation der terminalen B-Zelldifferenzierung. So ist die ektopische Expression von Blimp-1 ausreichend, damit naive B-Zellen zu antikörpersezernierenden Zellen differenzieren können. Dabei wirkt Blimp-1 als transkriptioneller Repressor, der zusammen mit Kofaktoren die Chromatinstruktur in der Promotorregion der Zielgene modifiziert und so deren Expression steuert. Neben der ursprünglich beschriebnen Blimp-1 mRNA existiert eine weitere mRNA, welcher das Exon 7 fehlt (Blimp-1?exon7). In diesem Exon sind die ersten zwei von insgesamt fünf Zinkfingern kodiert, welche nachweislich essentiell für die sequenzspezifische DNA-Interaktion von Blimp-1 sind. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Blimp-1?exon7 Deletionsmutante vorwiegend in ruhenden CD19+ B-Zellen der Maus und in unstimulierten humanen B-Zellen exprimiert wird. Obwohl die Blimp-1 sequenzspezifische DNA-Bindung des Proteins (Blimp-1?Ex7) nicht mehr gegeben ist, lokalisiert es teilweise in den Kern, interagiert ebenfalls mit Korepressoren wie Histondeacetylase-2, und assoziiert mit heterochromatischen Bereichen der DNA. Die ektopische Expression von Blimp-1?Ex7 in einer murinen B-Zell-Lymphomlinie, führt zu Zellzyklusarrest und Apoptose, ohne jedoch die Differenzierung zur Plasmazelle zu ermöglichen. Darüber hinaus ist in Gegenwart von Blimp-1?Ex7 die LPS-induzierte B-Zelldifferenzierung blockiert. Die Unterdrückung der Differenzierung korreliert mit einer verminderten Blimp-1 Expression. Zusammenfassend legen die Ergebnisse den Schluss nahe, dass Blimp-1?Ex7 in naiven B-Zellen exprimiert wird und eine vorzeitige Differenzierung verhindert, indem es autoregulativ die Promotoraktivität herabsetzt und damit Blimp-1 kontrolliert. / Blimp-1 (B lymphocyte induced maturation protein-1) is the key regulator of terminal B cell differentiation. Ectopic expression of Blimp-1 is sufficient to drive naive B cells to differentiate into antibody-secreting cells. In this context, Blimp-1 acts as a transcriptional repressor that modifies, together with cofactors, the chromatin structure in the promoter region of its target genes and thereby controls their expression. In addition to Blimp-1 mRNA there is another mRNA existing lacking exon 7 (Blimp-1?exon7). This exon codifies two of the five zinc fingers that are absolutely essential for sequence-specific DNA interaction of Blimp-1. The Blimp-1?exon7 deletion mutant is predominantly expressed in resting or unstimulated CD19+ B cells of mice or humans, respectively. Although the protein (Blimp-1?Ex7) cannot bind to the Blimp-1-specific DNA sequences, it partially localizes to the nucleus where it interacts with corepressors like histone deacetylase-2 and is associated with heterochromatic DNA. Ectopic expression of Blimp-1?Ex7 in a murine B cell lymphoma line leads to cell cycle arrest and apoptosis without prior induction of plasma cell differentiation. Furthermore, in the presence of Blimp-1?Ex7, LPS induced B cell differentiation is blocked. This block of differentiation correlates with a reduction in endogenous Blimp-1 expression. Taken together, the data imply that Blimp-1?Ex7 is expressed in naïve B cells to block premature differentiation by regulating the promoter activity in an auto-regulatory manner and is thereby controlling Blimp-1.

Neben dem bekannten Tropismus des Masernvirus für CD150-positive aktivierte Zellen des Immunsystems, spielt der Endothelzelltropismus für die akute Masernviruserkrankung einschließlich ihren nachfolgenden Komplikationen eine wichtige pathogene Rolle. Die Infektion der Endothelzellen steht in Zusammenhang mit dem Auftreten des MV-Exanthems. Es ist auch möglich, dass die „Akute Enzephalitits“ und der Viruseintritt ins zentrale Nervensystem wie im Falle der subakuten sklerosierenden Panenzephalitis (SSPE) durch Endothelzellinfektion vermittelt wird. Ziel der Arbeit war herauszufinden, wie und ob das MV Endothelzellbarrieren überwinden kann mittels Transport infizierter Leukozyten oder durch Infektion von EZs mit basolateraler Virusfreisetzung. Es wurde untersucht, ob die Fähigkeit von primären humanen T- Zellen durch polarisierte Zellschichten von „human brain microvascular endothelial cells“ (HBMECs) zu wandern durch die Infektion beeinflusst wird. Die Fähigkeit von infizierten Lymphozyten durch die Poren der Filter zu wandern war teilweise beeinträchtigt, jedoch war das Ergebnis statistisch nicht signifikant. Im Gegensatz dazu war die Fähigkeit der Zellen durch Endothelzellbarrieren zu wandern drastisch reduziert. Nach Infektion adhärierten die Leukozyten stärker auf den Endothelzellen. Bei dieser Adhäsion von PBMCs an Endothelzellen kam es trotz Infektion zur Ausbildung von sogenannten „transmigratory cups“ oder docking- Strukturen. Dieser enge Zell-Zell-Kontakt hatte zur Folge, dass die MV-Infektion vom Lymphozyten auf die Endothelzelle übertragen wurde. Die MV-Hüllproteine wurden auf der apikalen und basolateralen Seite infizierter Endothelzellen exprimiert wie anhand von Aufnahmen mit dem konfokalen Mikroskop am Beispiel des H-Proteins gezeigt werden konnte. Titrationen ergaben, dass das Virus auf beiden Seiten der Zellen freigesetzt wurde. Desweiteren wurde bestätigt, dass auch für polarisierte Endothelzellen die auf Tyrosin basierenden Transportsignale verantwortlich sind für die basolaterale Virusfreisetzung. Die Daten unterstützen die Hypothese, dass das Virus mit Hilfe der Infektion und der bipolaren Virusfreisetzung über Endothelzellbarrieren / In addition to the known tropism of measles virus (MV) for CD150-positive activated cells of the immune system, its endothelial cell tropism plays an important pathogenic role during acute measles and the following complications. The infection of endothelial cells is associated with the rash. It is also possible that endothelial infection mediates the acute encephalitis and viral entry in the central nervous system in cases of subacute sclerosing panencephalitis (SSPE). The aim of this investigation was to find out, how and if at all MV is able to overcome endothelial barriers via transport of infected leukocytes or infection of endothelial cells with basolateral virus release. We analysed if the capacity of primary human T cells to transmigrate through “human brain microvascular endothelial cells” (HBMECs) is influenced by the infection. The capacity of infected lymphocytes to migrated through filter pores was partially reduced but the results were statistacally not significant. In contrast the capacity to migrate through endothelial barriers was drastically reduced. The attachment of PBMCs to the endothelial monolayer was increased once the cells were infected. During this attachment normal so called “transmigratory cups” or docking-structures were formed, although the leukocytes were infected. As a consequence of this close cell-cell-contact the MV-infection was transferred to the endothelial cells. The MV envelope proteins were expressed on the apical and basolateral side as could be shown on pictures taken with the confocal microscope. Titrations showed that the virus was released on both sides of the cells. Moreover it could be demonstrated, that tyrosine-based sorting signals were responsible for basolateral virus release from polarized endothelial cells. These data support the hypothesis, that the virus can cross endothelial barriers by infection of the endothelium and by bipolar virus release.

The bidirectional influence of parenchymal cells and cells of the immune system, especially of antigen-presenting and CD8\(^+\) T cells, in situations of putative auto- immune pathogenicity and degeneration was the main topic of this thesis. In the first part, the influence of human muscle cells on antigen-presenting cells was investigated. In inflammatory myopathies prominent infiltrates of immune cells containing T cells and antigen-presenting cells like macrophages and dendritic cells are present. The hypothesis was that human myoblasts have an inhibiting influence on these antigen-presenting cells under homeostatic conditions. A dysfunction or impairment under inflammatory circumstances might contribute to the development of myopathic conditions. The surface analysis of dendritic cells cocultured with myoblasts showed that immature dendritic cells could be driven into a reversible semi- mature state with significantly elevated levels of CD80. These dendritic cells were additionally characterized by their inhibiting function on T-cell proliferation. It was also shown that the lysates of healthy myoblasts could strongly enhance the phagocytic ability of macrophages, which could help with muscle regeneration and which might be disturbed in myositis patients. The second part of this thesis was about the clonal specificity of CD8\(^+\) T cells in a mouse model with genetically induced over-expression of PLP in oligodendrocytes. Here, we could show that the cytotoxic T lymphocytes, which had previously been shown to be pathogenic, were clonally expanded in the CNS of the transgenic mice. The amino acid sequences of the corresponding receptor chains were not identical, yet showed some similarities, which could mean that these clones recognize similar antigens (or epitopes of the same antigen). The knockout of PD-1 in this setting allowed for an analysis of the importance of tissue immune regulation. It became evident that the absence of PD-1 induced a larger number of clonal expansions in the CNS, hinting towards a reduced threshold for clonal disturbance and activation in these T cells. The expansions were, however, not pathogenic by themselves. Only in the presence of tissue damage and an antigenic stimulus (in our case the overexpression of PLP), the PD-1 limitation exacerbated the immune pathogenicity. Therefore, only in the presence of a “tissue damage signal”, the dyshomeostasis of T cells lacking PD-1 achieved high pathogenetic relevance. Finally, we investigated the pathogenetic role of CD8 T cells in Rasmussen encephalitis, a rare and chronic neurological disease mainly affecting children. The analysis of the T-cell receptor repertoire in Rasmussen encephalitis patients in the peripheral CD4\(^+\) and CD8\(^+\) T-cell compartments as well as the brain revealed the involvement of T cells in the pathogenicity of this disease. Many clonal expansions in the brain matched CD8\(^+\) T-cell expansions in the periphery on the sequence level. These putatively pathogenic clones could be visualized by immunohistochemistry in the brain and were found in close proximity to astrocytes and neurons. Additionally, the expanded clones could be found in the periphery of patients for at least one year. / Der Einfluss von Parenchymzellen auf Immunzellen und umgekehrt, im Besonderen von Antigen-präsentierenden Zellen und CD8\(^+\) T-Zellen, im Zusammenhang von auto- immuner Pathogenese und Degeneration war das Hauptthema dieser Dissertation. Im ersten Teil wurde der Einfluss menschlicher Muskelzellen auf Antigen- präsentierende Zellen untersucht. In entzündlichen Myopathien kommt es zu massiven Infiltraten von Immunzellen, die T-Zellen und auch Antigen-präsentierende Zellen wie Makrophagen und dendritische Zellen enthalten. Die Hypothese war, dass menschliche Myoblasten einen hemmenden Einfluss auf die Antigen-präsentierenden Zellen unter homöostatischen Bedingungen haben. Eine Störung dieses Einflusses oder eine Beeinträchtigung unter entzündlichen Rahmenbedingungen könnte eventuell zur Entwicklung eines myopathischen Zustands beitragen. In der Oberflächenanalyse der dendritischen Zellen, die mit Myoblasten kultiviert wurden, zeigte sich, dass unreife dendritische Zellen in einen halb-reifen Zustand versetzt werden konnten, der sich beispielsweise durch stark erhöhte CD80 Expression kennzeichnet. Diese dendritischen Zellen wurden weiterhin charakterisiert über ihre hemmende Funktion auf die T-Zell Proliferation. Außerdem wurde gezeigt, dass Zelllysate gesunder Myoblasten die Phagozytoserate von Makrophagen enorm verstärken, was die Regeneration des Muskelgewebes erhöhen und möglicherweise in Myositispatienten gestört sein könnte. Im zweiten Teil der Dissertation ging es um die klonale Spezifität von CD8\(^+\) T-Zellen in einem Mausmodell mit genetisch induzierter Überexpression von PLP in Oligodendrozyten. Hier konnte gezeigt werden, dass die zytotoxischen T-Zellen, deren Pathogenität Gegenstand früherer Arbeiten war, im ZNS der transgenen Mäuse klonal expandiert waren. Die Aminosäuresequenzen der TCRβ Kette der expandierten Klone waren nicht identisch, zeigten jedoch einige Ähnlichkeiten, die darauf hinweisen könnten, dass diese Klone ähnliche Antigene (oder Epitope des gleichen Antigens) erkennen. Die genetisch induzierte Abwesenheit von PD-1 ermöglichte es, in diesem Zusammenhang den Einfluss von spezifischer Immunregulation im Gewebe zu untersuchen. Es zeigte sich, dass die Deletion von PD-1 eine erhöhte Anzahl von klonalen Expansionen im ZNS der Mäuse erzeugte, was auf eine herabgesetzte Schwelle für klonale Störungen und Aktivierung schließen lässt. Diese Expansionen 
 waren jedoch für sich genommen nicht pathogen. Nur in der Anwesenheit eines Gewebeschadens und eines zusätzlicher Antigenstimulus (in unserem Fall in Form der PLP Überexpression) konnte man die erhöhte Pathogenität durch die PD-1 Deletion erkennen. Deswegen erreichten die PD-1 deletierten T-Zellen nur in der Gegenwart eines „Gewebeschaden-Signals“ hohe pathogenetische Relevanz. Schließlich untersuchten wir die pathogenetische Rolle von CD8\(^+\) T-Zellen in der Rasmussen Enzephalitis, einer seltenen, chronischen Erkrankung des Gehirns, die hauptsächlich in Kindern vorkommt. Die Analyse des T-Zell-Rezeptor Repertoires in Rasmussen Enzephalitis Patienten in peripheren CD4\(^+\) und CD8\(^+\) T-Zell Populationen und im Gehirn zeigte die Beteiligung von T-Zellen in der Pathogenese dieser Krankheit auf. Viele klonale Expansionen waren zwischen Gehirn und der peripheren CD8\(^+\) Population bis hin zur Aminosäuresequenz identisch. Diese vermutlich pathogenen Klone konnten in Gehirnbiopsien von Rasmussenpatienten histochemisch nachgewiesen werden und wurden in enger Nachbarschaft zu Astrozyten und Neuronen gefunden. Zusätzlich konnten diese expandierten Kone in der Peripherie von Patienten für die beobachteten Zeiträume (mindestens ein Jahr) nachgewiesen werden.

Eine grundlegende Aufgabe unseres Immunsystems ist der Schutz unseres Organismus durch die Abwehr von Erregern. Im Zentrum jeder Immunantwort liegt die Unterscheidung zwischen dem „Selbst“ (der Erkennung körpereigener Antigene) und dem „Nicht-Selbst“ (der Erkennung körperfremder Antigene). Ein wichtiger Faktor in der Aufrechterhaltung der zentralen Toleranz ist das AIRE-Protein. In der Thymusmedulla, dem Ort der stärksten AIRE-Expression, erfolgt die sog. negative Selektion der heranreifenden autoreaktiven T-Zellen. Es wird angenommen, dass AIRE durch Regulation der Präsentation von Selbst-Antigenen in mTECs und DCs die Thymozyten auf Autoreaktivität kontrolliert und potentielle Auslöser einer Autoimmunkrankheit eliminiert. Thymome sind epitheliale Tumoren des Thymus, die häufig mit Autoimmunphänomenen, insbesondere paraneoplastischer Myasthenia gravis, einhergehen. Da bei Thymomen meist ein vollständiger Verlust von AIRE sowohl auf Transkriptions- als auch Proteinebene vorliegt, lag es nahe, einen Zusammenhang mit dem Auftreten Thymom-assoziierter Autoimmunerkrankungen zu vermuten. Thymome wurden initial in einer histogenetischen Klassifikation aufgrund morphologischer Kriterien in „medulläre“ und „corticale“ Typen unterteilt. Dieses Konzept sollte in der vorgelegten Arbeit überprüft werden. Durch Kombination verschiedener Gen-Expressions-Datensätze wurden „medulläre Thymusgene“ identifiziert und in 3 Gruppen (Gene ohne Beeinflussung durch AIRE bzw. Gene mit positiver bzw. negativer Regulation durch AIRE) unterteilt. Unter den hier identifizierten, durch AIRE positiv regulierten Genen fanden sich zahlreiche Gene mit potentieller Bedeutung für die Immunregulation bzw. die Entstehung experimenteller und humaner Autoimmunerkrankungen. Eine Analyse verschiedener Thymom-Subtypen ergab weder eine erkennbare „AIRE-Verlust-Signatur“ noch eine medulläre Gensignatur in den „medullären“ Typ A Thymomen. Die erhobenen Befunde wären aber mit einem Stammzellmodell der Thymomentstehung vereinbar, nach dem die unterschiedlichen Thymom-Subtypen aus unterschiedlich determinierten Stamm- oder Progenitorzellen mit verschiedenen Reifungsblockaden hervorgehen könnten.

Glukokortikoide induzieren Apoptose in vielen verschiedenen Zelltypen. Wenngleich die Glukokortikoid-induzierte Apoptose eine der zuerst entdeckten Formen des Programmierten Zelltodes war, ist sie dennoch kaum verstanden und daher heute noch Teil vieler Forschungen. Eine Bcl-2 Überexpression resultiert in einer Resistenz gegenüber GC- induzierter Apoptose in einer Reihe von Zellen wie einigen Lymphomzell-linien, aber auch normalen Thymozyten, sowie reifen T- und B-Zellen. Glukokortikoide können die Transkription der BH3-only Gene Bim (BCL-2-interacting mediator of cell death) und Puma (p53-upregulated modulator of apoptosis), einer proapoptotischen Untergruppe der Bcl-2 Familie, induzieren. Dies legt nahe, dass Bim und Puma am Weg der GC-induzierten Apoptose beteiligt sind. Ceramid ist in der Lage über die Aktivierung der proapoptotischen Bcl-2 Mitglieder Bax und Bak die äußere Mitochondrienmembran zu schädigen und damit zur Aktivierung von Caspasen zu führen. Verschiedene apoptotische Stimuli, wie z.B. Glukokortikoide, führen so über eine Erhöhung des endogenen Ceramid Levels zur Apoptose. Ceramid kann auf zwei verschiedenen Wegen gebildet werden: zum einen durch Hydrolyse von Sphingomyelin (katalysiert durch saure (a), oder neutrale (n) Sphingomyelinase (SMase)), zum anderen durch de novo Biosynthese. Studien an Thymozyten zeigen, dass von den beiden Möglichkeiten der Ceramidsynthese, lediglich die Inhibition der aSMase zu einer Resistenz gegenüber GC-induzierter Apoptose führt. Um nun die Rolle von Bim und der aSMase bei der Glukokortikoid-induzierten Apoptose zu untersuchen, wurde die murine T-Zelllymphomlinie WEHI7.15a zu Hilfe genommen. Während die Überexpression retroviral eingebrachter shRNAs gegen Bim und aSMase keine Wirkung auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose zeigten, führte der knockdown des Glukokortikoid-Rezeptors selbst zu einer Resistenz gegenüber Dexamethason. Auch der pharmakologische Inhibitor der Sphingomyelin-Hydrolyse, Imipramin, zeigte sowohl in vitro, als auch in vivo keine Wirkung auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose. Darüber hinaus waren sowohl Thymozyten, als auch periphere T-Zellen von aSMase knockout Mäusen genauso sensitiv auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose wie Wildtyp-Zellen. Die in vitro knockdown Ergebnisse von Bim und vom Glukokortikoid-Rezeptor selbst, konnten weiterhin ex vivo, durch das Einbringen der shRNAs in hämatopoetische Stammzellen, welche zur Rekonstitution bestrahlter Mäuse genutzt wurden, bestätigt werden. Während der Bim knockdown keinerlei Einfluss auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose ex vivo zeigte, konnte die verminderte Expression des Glukokortikoid-Rezeptors den Zelltod verhindern. Im Gegensatz hierzu zeigten sowohl der GR knockdown, als auch der Bim knockdown im hämatopoetischen System einen Einfluss auf die Thymozytenentwicklung in vivo. / Glucocorticoids (GC) induce apoptosis in many cell types, but the mechanisms are not well understood. Recently it was reported that the proapoptotic Bcl-2 family member Bim and an upregulation of ceramides by a caspase-activated acidic sphingomyelinase (aSMase) play important roles. In order to study their involvement in GC-induced apoptosis I took advantage of the GC-sensitive murine T-cell lymphoma line WEHI 7.15a. Overexpression of retrovirally expressed shRNAs against Bim or aSMase had no influence, whereas knockdown of the GC receptor (GR) itself rendered these cells resistant to Dexamethasone. In addition, various pharmacological inhibitors of ceramide production had no influence on GC-induced apoptosis. Moreover, thymocytes and peripheral T-cells from aSMase knockout mice were equally sensitive to GC induced apoptosis as wildtype cells. Furthermore, I confirmed the in vitro knock down results of Bim and the GR by introducing shRNAs into hematopoietic stem cells that were used to reconstitute lethally irradiated mice. While Bim inactivation did not impact ex vivo GC-induced apoptosis, loss of GR expression prevented cell death. In contrast both, the GR knockdown as well as the Bim knockdown in reconstituted mice, showed an influence in T-cell development in vivo.

This study focuses on phosphoantigen specific Vg9Vd2 T cells which only exist in human and non-human primates. This population accounts for 1%-5% of peripheral blood T-lymphocytes but their frequency can rise to 50% of total blood T cells upon infection. Vg9Vd2 T cells can be activated by nonpeptide compounds with critical phosphate moieties which are termed as phosphoantigens. These include isopentenyl pyrophosphate (IPP), a key compound of isoprenoid synthesis in all organisms, and (E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), a direct precursor of IPP in DOXP pathway which only exist in eubacteria, plants, apicomplexaen parasites. Its activity as phosphoantigen is at least 1000 fold higher than that of IPP. However, direct structural evidence of phosphoantigen binding to the TCR is missing so far. Moreover, Vg9Vd2 T cells have potent anti-tumor activity e.g. against the B-cell lymphoma Daudi, whose Vg9Vd2 T cell activating properties have been suggested to result from sensing of abnormal intracellular IPP levels by the Vg9Vd2 TCR or Vg9Vd2 TCR binding to other postulated ligands such as an ectopically expressed F1-ATPase or UL-16 binding protein 4 (ULBP4). Aminobisphosphonates and alkymines were hypothesized to activate Vg9Vd2 T cells indirectly by inhibiting the IPP consuming enzyme farnysyl pyrophosphates synthesis (FPPS) although off target effects of these drugs or a direct interaction with the Vg9Vd2 TCR could not be excluded. This thesis presents new approaches for the mechanistic analysis of Vg9Vd2 T cell activation. By employing retroviral transduction of FPPS specific shRNA, it shows that specific shRNA reduces expression of FPPS and is sufficient to convert hematopoietic and non-hematopoietic tumor cell lines into Vg9Vd2 T cell activators. FPPS knockdown cells activated Vg9Vd2 T cells as measured by increased levels of CD69 and CD107a, kill of FPPS knockdown cells and induction of IFN-γ secretion. The IPP-synthesis-inhibiting drug mevastatin reduced Vg9Vd2 T cell activation by FPPS knockdown cells or aminobisphosphonate treated cells but not activation by the phosphoantigen bromohydrin pyrophosphate (BrHPP). A reduced growth of the FPPS knockdown cells has not been observed which is different to what has been reported for aminobisphosphonate treated cells. Finally, the human B-cell lymphoma RAJI has been transduced with Tetracyclin-inducible FPPS specific shRNA and proven to gain and loose the capacity to activate Vg9Vd2 TCR transductants upon doxycylin provision or removal. Another approach for the analysis of Vg9Vd2 T cell activation is Vg9Vd2 TCR transduced mouse cell lines with specificity for phosphoantigens. In contrast to the previously used Vg9Vd2 TCR transduced Jurkat cells, these cells do not present phosphoantigens, and are therefore specially suited for analysis of phosphoantigen presentation. The response of the new TCR transductants to presumed Vg9Vd2 TCR ligands/activators such as phosphoantigens, aminobisphosphonates or FPPS knockdown cells, depended strongly on the expression of a rat/mouse CD28 molecule by the transductants and its ligation by the (CD80) counter receptor on the ligand-presenting cell. The response is likely to reflect recognition of cognate Vg9Vd2 TCR antigens since mutations in the TCR-δ chain CDR2 and 3 abolished this response but activation by TCR or CD3 specific antibodies. A major difference between TCR transductants and primary gd T cells, was the lacking response of TCR transductants to Daudi or IPP. In addition their sensitivity to other soluble phosphoantigens was about 100 fold weaker than that of primary cells, stimulation of both cell type to CD80 expressing FPPS knock down or aminobisphosphonates was similar. Finally, the transductants have also been used to analyze effects of over-expression or knockdown of enzymes of isoprenoid synthesis such as 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase (HMG-CoA reductase or HMGR), mevalonate-5-pyrophosphate decarboxylase (MVD), isopentenyl pyrophosphate isomerase (IDI), geranyl-geranyl pyrophosphate synthase (GGPPS) but no clear effects have been found. In conclusion, this thesis supports the concept of Vg9Vd2 T cells being sensors of a dysregulated isoprenoid metabolism and established new tools to study ligand recognition and TCR mediated activation of this T cell population. These tools will be most useful to address following questions: 1) How does the dysregulation of isoprenoid metabolism affect tumor growth? 2) What is the correlation between the modulation of IPP levels and the Vg9Vd2 TCR binding or expression of other postulated ligands? 3) Are there any mevalonate pathway enzymes other than FPPS and HMGR, which play an important role in Vg9Vd2 T cells activation? 4) What is/are the putative phosphoantigen-presenting molecule(s)? / Die vorliegende Arbeit widmet sich den phosphoantigenspezifischen Vg9Vd2 T Zellen, die nur im Menschen und nicht-humanen Primaten zu finden ist. Diese Population stellt 1-5% der peripheren Blut T-Zellen aber ihre Frequenz kann bei Infektionen auf bis zu 50% steigen. Vg9Vd2 T Zellen können durch nicht Peptid-Moleküle aktiviert werden, die sich durch eine essentielle Phosphatkomponente auszeichnen. Hierzu gehören das Isopentenyl-pyrophosphat (IPP), ein Schlüsselmolekül der Isoprenoidsynthese aller Organismen, sowie das bezüglich seiner gd T zellaktivierenden Eigenschaften mehr als 1000fach stärkere (E)-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl-pyrophosphat (HMBPP), dass der direkte Vorläufer des IPP im DOXP Stoffwechselweg ist, der nur bei Eubakterien, Pflanzen und apikomplexen Bakterien zu finden ist. Direkte strukturelle Belege für die Bindung von Phosphoantigenen an den gd TCR stehen jedoch aus. Darüber hinaus besitzen Vg9Vd2 T Zellen eine direkte gegen Tumoren wie das B-Zelllymphom Daudi gerichtete Aktivität, für deren Erklärung ein „Erspüren“ eines abnormal erhöhten intrazellulären IPP Spiegels durch den Vg9Vd2 TCR oder Bindung des Vg9Vd2 TCR an Liganden, wie einer ectopisch exprimierten F1-ATPase oder des UL-16 bindenden Proteins 4 (ULBP4) herangezogen wurde. Die Vg9Vd2 T Zell Aktivierung durch Aminobisphosphonate und Alkylamine wurde hingegen auf die Inhibition des IPP verbrauchenden Enzyms Farnesylpyrophosphatsynthase (FPPS) zurückgeführt, obgleich Wirkungen auf andere Moleküle oder eine direkte Bindung an den TCR nicht ausgeschlossen werden konnten. Die vorgelegte Dissertationsschrift beschreibt neue Ansätze der Analyse der Mechanismen der Vg9Vd2 T Zell Aktivierung. Sie zeigt, dass eine mittels retroviraler Transduktion von shRNA erzielte Reduktion der FPPS Expression ausreicht, um hematopoietische und nicht-hematopoietische Tumorzellen zu Vg9Vd2 T Zellaktivatoren zu machen. Die FPPS knockdown zellvermittelte Aktivierung der Vg9Vd2 T Zellen zeigte sich in erhöhter Expression von CD69, CD107a, Zytotoxizität gegen FPPS knockdown Zellen und Induktion der IFNg Sekretion. Die, die IPP-Synthese inhibierende Substanz Mevastatin, reduzierte die Vg9Vd2 T Zellaktivierung durch FPPS knockdown Zellen oder Aminobisphosphonat behandelte Zellen, aber nicht die Aktivierung durch das Phosphoantigen Bromhydrin Pyrophosphat. Ein vermindertes Wachstum der FPPS knockdown Zellen wurde nicht nachgewiesen was im Gegensatz zur Literatur über Aminobisphosphonat behandelte Zellen steht. Weiterhin wurde ein Tetracyclin-induzierbares FPPS spezifische shRNA kodierendes lentivirales Konstrukt in humane B-Zelllymphom Raji Zellen transduziert, die anschließlich die durch Zugabe bzw. Entfernung von doxycyclin gesteuerte Fähigkeit erhielten, Vg9Vd2 T Zellen zu aktivieren. Ein anderer Ansatz zur Analyse der Vg9Vd2 T-zellvermittelten Aktivierung war die Entwicklung phosphoantigenspezifischer Vg9Vd2 TCR transduzierter Mauszelllinien. Diese Zellen unterscheiden sich von den bisher benutzten humanen Vg9Vd2 TCR transduzierten Jurkat Zellen dadurch, dass sie keine Phosphoantigene präsentieren, und sind daher für Analyse der Phosphoantigenpräsentation besonders geeignet. Die Antwort der neuen TCR Transduktanten auf wahrscheinliche Vg9Vd2 TCR Zellliganden bzw. Vg9Vd2 T-Zellaktivatoren wie Phosphoantigene, Aminobisphosphonate oder FPPS knockdown Zellen hing im hohen Maße von der Expression eines Ratten/Maus CD28 Moleküls auf den Transduktanten und dessen Bindung an den (CD80) Gegenrezeptor auf der antigenpräsentierenden Zelle ab. Höchstwahrscheinlich reflektiert die Antwort auf eine spezifische Antigenerkennung, da Mutationen in den CDR2 und 3 der TCRd Kette die Antwort verschwinden ließen, aber keine Effekte auf die Stimulation durch CD3 oder TCR spezifische Antikörper hatten. Ein gravierender Unterschied der TCR-Transduktanten zu primären gd T Zellen lag auch darin, dass die TCR Transduktanten weder durch Daudi Zellen noch durch IPP stimuliert wurden und ihre Empfindlichkeit gegenüber löslichen Phosphoantigenen ungefähr 1000fach geringer als bei primären Vg9Vd2 T-Zellen war, während sich die Antwort der beiden Zelltypen auf FPPS knockdown oder Aminobisphosphonate-behandelte Zellen ähnelten. Schließlich wurden die Transduktanten verwendet, um Effekte der Überexpression oder des knockdown von Enzymen der Isoprenoidsynthese wie 3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl-CoA reductase (HMG-CoA reduktase or HMGR), Mevalonat-5-Pyrophosphat decarboxylase (MVD), Isopentenyl Pyrophosphat Isomerase (IDI), Geranylgeranyl Pyrophosphate Synthase (GGPPS) zu analysieren, wobei keine eindeutigen Effekte beobachtet wurden. Zusammengefasst kann gesagt werden, dass die vorgelegte Arbeit die Vorstellung von Vg9Vd2 TCR Zellen als Sensoren eines entgleisten Isoprenoidstoffwechsel unterstützt und neue Werkzeuge zur Analyse der Ligandenerkennung und TCR vermittelten Aktivierung dieser Zellpopulation vorstellt. Diese Werkzeuge sollten bei der Beantwortung folgender Fragen helfen: 1) Wie beeinflusst die Fehlregulation des Isoprenoidstoffwechesle das Tumorwachstum. 2) Welche Korrelation besteht zwischen der Modulation der IPP Spiegel und der Vg9Vd2 TCR vermittelten Aktivierung bzw. der Expression anderer vorgeschlagener Vg9Vd2 Liganden. 3) Gibt es Enzyme außer der FPPS und der HMG-CoA Reduktase, die eine wichtige Rolle bei der Vg9Vd2 T-Zellaktivierung spielen und schließlich 4) Welche(s) Molekül(e) präsentiert bzw. präsentieren Phosphoantigene ?

Bispecific T cell engager (BiTE) display a novel design among the class of bispecific antibodies and hold great promise to fight diverse cancers. BiTE molecules consist of two different binding entities derived from two human IgG antibodies connected by a short peptide linker. Their binding arms are directed against the CD3e chain of the T cell receptor on T cells and against an antigen that is specific for (e.g., CD19 for lymphoma in MT103) or over-expressed on (e.g., EpCAM for epithelial cancer in MT110) tumor cells. Without requirement for pre- or co-stimulation, BiTE molecules efficiently redirect CD3+ T cells towards tumor cells expressing the relevant target antigen. Only a BiTE molecule simultaneously bound to both tumor cell and T cell activates the T cell to exert its cytolytic function resulting in tumor cell death. In T cells stimulated with both BiTE and target cells, elevated levels of caspase activation and increased expression of cytotoxic and signaling proteins are observed. These include cytolytic proteins granzyme B and perforin, activation markers CD69 and CD25 and adhesion molecules CD2 and LFA-1. Activated T cells secrete the usual mix of cytokines, among them pro-inflammatory cytokines IFN-g and TNF-a. The membrane of tumor cells expressing the relevant target antigen is perforated during the attack of BiTE-stimulated effector cells as can be concluded from adenylate kinase release from the cytosol of tumor cells. Ca2+-chelator EGTA completely blocked BiTE-mediated activation of caspases and tumor cell lysis. As perforin is strictly Ca2+-dependent, a major role for this pore-forming protein is assumed for the elimination of tumor cells via BiTE-stimulated T cells. Granzyme B and caspases are main players in BiTE-mediated elimination of tumor cells. Inhibitors of granzyme B or caspases reduce or block, respectively the activation of caspases. However, other signals of apoptosis (cleavage of PARP and fragmentation of DNA) were only reduced by granzyme B inhibitor or caspase inhibitor. Most interestingly, the lytic capacity of BiTE molecules was not impaired by granzyme B inhibitor or caspase inhibitor. It seems that there is no requirement for granzyme B and caspases to be present simultaneously. Instead the data presented provide evidence that they can be replaced one at a time by related proteins. Pre-incubation of effector cells with the glucocorticoids dexamethasone or methylprednisolone resulted in markedly decreased secretion of cytokines by T cells yet only a small reduction in the expression of activation markers and adhesion molecules on T cells and specific lysis of tumor cells upon BiTE stimulation. Soluble factors secreted in an undirected manner by BiTE-stimulated T cells do not mediate tumor cell death by themselves. Bystander cells negative for the antigen that is recognized by the BiTE molecule will not be compromised by BiTE activity. The cytokine TGF-b reduced proliferation as well as granzyme B and perforin expression of BiTE-stimulated T cells. Redirected lysis by BiTE-activated T cells was also decreased under the influence of TGF-b, however lysis was still performed at a reasonable rate (72 % of target cells). TGF-b does not exert a deleterious effect on lytic potential of BiTE-stimulated T cells. The minimal anticipated biological effect level for the BiTE MT110 was determined for the entry of MT110 into phase I clinical studies. Experiments analyzing redirected lysis of tumor cells, expression of activation marker CD25 and cytokine release by T cells revealed a MABEL value of 50 pg/ml for MT110. / Bispecific T cell engager stellen mit ihrem neuartigen Design eine eigene Gruppe unter den bispezifischen Antikörpern dar und zeigen sich vielversprechend im Kampf gegen unter-schiedliche Krebsarten. BiTE Moleküle bestehen aus zwei unterschiedlichen Bindungsstellen, die von zwei humanen IgG Antikörpern abgeleitet sind und durch einen kurzen Peptidlinker verbunden sind. Die Bindungsstellen sind gerichtet gegen die CD3e Kette des T-Zell-Rezeptors auf T-Zellen und gegen ein Antigen, das auf den Tumorzellen ausschließlich (CD19 bei Lymphomen in MT103) oder in erhöhtem Maße (EpCAM bei epithelialem Krebs in MT110) exprimiert wird. BiTE Moleküle richten CD3+ T-Zellen gegen Tumorzellen, die das relevante Zielantigen präsentieren. Dabei sind sie nicht auf Vor- oder Kostimulation angewiesen. Nur wenn das BiTE Molekül gleichzeitig an Tumorzelle und T-Zelle gebunden ist, aktiviert es die T-Zelle zytolytisch zu wirken und die Tumorzelle zu töten. T-Zellen, die mit BiTE und zugleich Targetzellen stimuliert wurden, zeigen erhöhte Raten von Caspaseaktivierung und vermehrte Expression von zytotoxischen und Signalproteinen. Diese beinhalten die zytolytischen Proteine Granzyme B und Perforin, die Aktivierungs-marker CD69 und CD25 und die Adhäsionsmoleküle CD2 und LFA-1. Aktivierte T-Zellen sezernieren die übliche Mischung an Zytokinen, darunter die pro-inflammatorischen Zytokine IFN-g und TNF-a. Die Freisetzung von Adenylatkinase aus dem Zytosol von Tumorzellen lässt darauf schließen, dass die Membran von Tumorzellen, die das relevante Zielantigen exprimieren, während dem Angriff von BiTE-stimulierten Effektorzellen durchlöchert wird. Der Ca2+ Chelator EGTA verhinderte die BiTE-vermittelte Aktivierung von Caspasen und Lyse von Tumorzellen vollständig. Da Perforin in Abhängigkeit von Ca2+ wirkt, wird für dieses porenbildende Protein eine entscheidende Rolle in der Beseitigung von Tumorzellen mittels BiTE-stimulierter T-Zellen angenommen. Granzyme B und Caspasen sind die Hauptakteure in der BiTE-vermittelten Beseitigung von Tumorzellen. Inhibitoren von Granzyme B oder den Caspasen vermindern bzw. hemmen die Aktivierung von Caspasen. Andere Apoptosesignale (PARP-Spaltung und DNA-Fragmentierung) werden von Granzyme B- oder Caspase-Inhibitoren jedoch lediglich reduziert. Bemerkenswerterweise wurde die lytische Kapazität von BiTE Molekülen durch einen Granzyme B- oder Caspase-Inhibitor nicht beeinträchtigt. Es scheint, dass keine Notwendigkeit für die gleichzeitige Anwesenheit von Granzyme B und Caspasen besteht. Stattdessen erbringen die vorgestellten Ergebnisse einen Hinweis dafür, dass diese Proteine jeweils einzeln durch verwandte Proteine ersetzt werden können. Präinkubation von Effektorzellen mit den Glucocorticoiden Dexamethason oder Methylpred-nisolon bewirkte eine deutlich verminderte Zytokinsekretion von T-Zellen, jedoch nur eine geringe Abnahme der Expression von Aktivierungsmarkern und Adhäsionsmolekülen auf T-Zellen und der spezifischen Lyse von Tumorzellen in Folge von BiTE-Stimulierung. Lösliche Faktoren, die von BiTE-stimulierten T-Zellen nicht zielgerichtet abgegeben werden, vermitteln keine Lyse von Tumorzellen. Zellen, die sich in der Nachbarschaft des Tumors befinden, aber das Antigen nicht exprimieren, das vom BiTE Moleküle erkannt wird, werden daher durch BiTE Aktivität nicht in Mitleidenschaft gezogen. Das Zytokin TGF-b verminderte die Proliferation von BiTE-stimulierten T-Zellen sowie deren Expression von Granzyme B und Perforin. Die gerichtete Lyse von BiTE-aktivierten T-Zellen war unter dem Einflusss von TGF-b ebenfalls vermindert. Trotzdem erreichten die Lysisraten Werte von 72 %. TGF-b übt keinen schädlichen Effekt auf das lytische Potential von BiTE-stimulierten T-Zellen aus. Die MT110-Konzentration, bei der der geringste biologische Effekt erwartet wird, wurde für den Eintritt von MT110 in klinische Studien der Phase I bestimmt. Auf Grundlage von Experimenten zur gerichteten Lyse von Tumorzellen, zur Expression des Aktivierungsmarker CD25 auf T-Zellen und zu Freisetzung von Zytokinen aus T-Zellen, ergab sich ein MABEL-Wert von 50 pg/ml für MT110.

Beim Zigarettenrauchen als der häufigsten Form des Tabakkonsums stellt das respiratorische Epithel des oberen und unteren Aerodigestivtraktes das primäre Kontaktorgan der zyto- und genotoxischen Inhaltsstoffe dar. Nikotin, das Hauptalkaloid des Tabaks, ruft nicht nur eine starke Abhängigkeit hervor, sondern kann in Anbetracht früherer Studien auch zum Tabak assoziierten Krebsrisiko beitragen. Neben tumorproliferativen Effekten wie etwa der Angioneogenese, der Zellproliferation oder einer Apoptoseinhibition ist die Rolle der tumorinitiierenden Wirkung von Nikotin durch eine direkte Schädigung der DNA noch unzureichend untersucht. Ziele dieser experimentellen Arbeit waren deshalb, Nikotin induzierte DNA-Schäden an frisch isolierten sowie rekultivierten humanen Lymphozyten mit Hilfe des alkalischen Einzelzell-Mikrogelelektrophorese (Comet) Assays darzustellen, den Nachweis dieser Schäden durch Koinkubation mit dem Reparaturenzyminhibitor Aphidicolin (APC) zu sensitivieren sowie oxidativ geschädigte Basen durch die Formamidopyrimidin-Glykosylase (Fpg) aufzuzeigen. Durch Koinkubation mit Epibatidin, einem Subtyp spezifischen und kompetitiven Agonisten am nikotinergen Acetylcholinrezeptor (nAChR), wurde die Rolle der rezeptorvermittelten Mechanismen Nikotin induzierter DNA-Schäden an Lymphozyten und nasalen Mukosazellen untersucht. Auch der Frage, ob Rauchen zu einer erhöhten basalen Schädigung an nasalen Mukosazellen führe, wurde nachgegangen. Nach der Zellisolierung der humanen nasalen Schleimhautzellen und peripheren Lymphozyten erfolgte zum Ausschluss zytotoxischer Effekte jeweils vor und nach der einstündigen Fremdstoffinkubation mit Nikotin (1 µM bis 1000 µM), APC (2,5 µg/ml), Epibatidin (1 µM bis 100 µM) und MMS (100 µM) die Bestimmung der Zellvitalität mit dem Trypanblau-Ausschlusstest. Durch Inkubation mit Fpg nach der Lyse zellulärer Membranen erfolgte die Augmentation oxidativ geschädigter Basen. Potentielle DNA-Schäden in Form von Einzelstrangbrüchen und alkalilabilen Stellen der DNA wurden mit dem Comet Assay erfasst. An frisch isolierten Lymphozyten konnte nach ein-stündiger Inkubation mit Nikotin ab 100 µM ein signifikanter DNA-Schaden festgestellt werden. Mit dem Einsatz von Fpg kam es ab 10 µM Nikotin zu einem signifikanten Anstieg der DNA-Fragmentierung. An rekultivierten Lymphozyten konnte nach Kryokonservierung bei einstündiger Inkubation mit Nikotin bereits ab 1 µM eine signifikante DNA-Schädigung nachgewiesen werden, die sich ebenfalls bei Koinkubation mit APC ab 1 µM darstellte. Durch Koinkubation von Nikotin (1000 µM) mit Epibatidin in aufsteigender Konzentration konnte an frisch isolierten Lymphozyten nur in einer Konzentration (10 µM) die Nikotin induzierte DNA-Fragmentierung gesenkt werden. Hierbei zeigte Epibatidin selbst einen DNA-Schaden in niedriger Konzentration (1 µM und 10 µM). An nasalen Mukosazellen konnte der Nikotin induzierte DNA-Schaden durch die Koinkubation mit Epibatidin nicht gesenkt werden. Auch an nasaler Mukosa rief Epibatidin ab 1 µM einen signifikanten DNA-Schaden hervor. Bezüglich einer Einflussgröße durch das Rauchen auf die Ergebnisse im Comet Assay konnte kein Unterschied der basalen als auch der durch Nikotin induzierten DNA-Fragmentierung zwischen der Gruppe der Raucher und Nichtraucher festgestellt werden. Nikotin verursachte bereits bei einer einstündigen Expositionsdauer DNA-Schäden an humanen Lymphozyten und nasalen Mukosazellen. Der Nachweis oxidativ geschädigter Basen an Lymphozyten zeigt auf eine Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) durch Nikotin hin. Die Aktivierung des homomeren α7 nAChR durch Nikotin soll hierbei eine wichtige Rolle als Auslöser der intrazellulären Signaltransduktion der Radikalbildung spielen. Epibatidin als ein starker Agonist am α7 Rezeptor führte bereits in geringen Konzentrationen zu einer signifikanten DNA-Fragmentierung. Bei fehlender Reparatur dieser DNA-Schäden und einer ausbleibenden Elimination der geschädigten Zelle können diese Mutationen akkumulieren und zur Tabak assoziierten Krebsentstehung beitragen. Eine Substitutionstherapie mit Nikotin zur Raucherentwöhnung muss bei solchen Ergebnissen äußerst kritisch betrachtet werden. / Respiratory epithelia of the upper and lower aero digestive tract are in first contact with cyto- and genotoxic components of tobacco smoke. Nicotine, being the main alkaloid of tobacco, is responsible for addiction to tobacco and contributes to tobacco carcinogenesis, too. While mechanisms of tumor proliferation caused by nicotine, such as stimulation of angiogenesis and cell proliferation or inhibition of apoptosis, are well accepted, the role of direct DNA damage by nicotine as a potentially tumor initiating factor is in focus of the present study. This experimental study demonstrates DNA damage in freshly isolated and cryo-preserved human lymphocytes after exposure to nicotine with the alkaline single-cell microgel electrophoresis (comet) assay. Co-incubations with aphidicolin (APC), an inhibitor of repair enzymes, and formamidopyrimidine-glycosylase (Fpg), an enzyme to detect oxidative damaged bases, were performed. Epibatidine as a subtype-specific and competitive agonist of the nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) correspondent to nicotine was implemented to evaluate the role of receptor associated mechanisms of DNA damage. Furthermore, the influence of the smoking-status on the DNA damage of nasal mucosa cells was evaluated. Cytotoxic effects were investigated before and after one hour of exposure to nicotine (1 µM to 1000 µM), APC (2,5 µg/ml), epibatidine (1 µM to 100 µM) and methyl methane sulfonate as control (100 µM) in the trypan blue exclusion test. After lysis of cellular membranes, oxidative damaged bases of DNA were detected by incubation with Fpg. DNA damage like single strand brakes and alkali labile sites of DNA were investigated with the aid of the comet assay. Freshly isolated lymphocytes showed at 100 µM nicotine a significant DNA damage. Applying Fpg, a significant increase in DNA fragmentation could already be detected at 10 µM nicotine. Cryopreserved lymphocytes showed a significant DNA damage at 1 µM nicotine both with and without the co-incubation of APC. The co-incubation of 1000 µM nicotine with epibatidine showed in a single concentration (10 µM) a reduction of nicotine induced DNA damage in lymphocytes. Epibatidine itself caused DNA damage at lower concentrations (1 µM and 10 µM) in lymphocytes. In nasal mucosa cells epibatidine did not reduce the nicotine induced DNA damage but caused itself DNA damage at 1 µM. The smoking-status of the participants had no influence on basal and nicotine induced DNA fragmentation. Nicotine induced DNA damage to cells of human blood and nasal mucosa just after one hour of exposure. The evidence of oxidative damaged bases of DNA in lymphocytes shows the development of reactive oxygen species (ROS) by nicotine. The activation of the homomeric α7 nAChR by nicotine seems to be relevant to the intracellular transduction for generating ROS. Epibatidine, as a strong agonist on the α7 nAChR, caused significant DNA fragmentation in low concentrations, already. By insufficient repair of the DNA damage and inhibited elimination of damaged cells, mutations can accumulate and contribute to tobacco carcinogenesis. Hence, nicotine in a replacement therapy should be considered very critically.

Thymome sind die einzigen Tumoren, die reife T-Zellen aus unreifen Vorläuferzellen generieren, wobei die unreifen Thymozytenpopulationen in Thymomen im Vergleich zum Thymus abnorm vermehrt und die reifen Populationen vermindert sind. Zusätzlich weist das Thymomgewebe im Vergleich zum Thymus weniger B-Zellen und Effektor-T-Zellen auf. Bisher ist unbekannt, welche Faktoren die veränderte intratumoröse Zusammensetzung der Zellpopulationen bedingen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, Mikromilieufaktoren in Thymomen mit möglichen Auswirkungen auf die intratumoröse Thymopoese zu identifizieren und deren Einfluß auf das periphere Immunsystem zu untersuchen. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde nach Ursachen für die abnorme Thymozytenreifung und die Generierung autoreaktiver T-Zellen in Thymomen gesucht. Als potentielles Autoantigen, das die positive Selektion in Thymomen beeinflussen könnte, wurde das in Thymomen exprimierte Protein p153 als Neurofilament mittleren Molekulargewichtes (NF-M) identifiziert. Mittels T-Zell-Proliferationstests konnte gezeigt werden, daß intratumoröse T-Zellen von Thymompatienten mit Myasthenia gravis (MG) nach Stimulation mit dem mittleren Fragment dieses Proteins (NF-M-B) signifikant höhere Antworten aufwiesen als Thymozyten von Thymitispatienten oder Thymompatienten ohne MG. NF-M-B-reaktive T-Zellen waren charakteristisch für die paraneoplastische MG, wohingegen T-Zell-Antworten gegen ein Azetylcholinrezeptor (AChR)-Fragment bei allen MG-Patienten (Thymitis und Thymom) erhöht waren. Diese Ergebnisse geben einen Hinweis darauf, daß intratumoröses NF-M eine autoantigene Determinante speziell für die paraneoplastische MG darstellt. Das Mikromilieu von Thymomen wurde außerdem mittels cDNA-Arrays und RT-PCR analysiert. Als differentiell exprimierte Gene sind besonders das "Heparin-binding growth-associated molecule" (HB-GAM) und der "B-cell growth factor 1" (BCGF 1) hervorzuheben. Die Expression von HB-GAM zeigte sowohl eine Abhängigkeit vom histologischen Thymomtyp (kortikal > gemischt / medullär) als auch vom MG-Status der Patienten (MG+ > MG-).Umgekehrt wurde für den Faktor BCGF 1 eine signifikante Erhöhung in Thymomen ohne MG gefunden und keine Abhängigkeit vom histologischen Thymomtyp. Die Expression des Chemokins "Interferon-inducible T cell alpha chemoattractant" (I-TAC) war ebenfalls mit dem MG (+)-Status von Thymompatienten signifikant assoziiert. Diese Befunde machen eine Beteiligung von HB-GAM, BCGF 1 und I-TAC an der Pathogenese der paraneoplastischen MG wahrscheinlich. Im Gegensatz dazu wurde die Expression des Chemokins "Thymus-expressed chemokine" (TECK) weder durch den histologischen Thymomtyp noch durch den MG-Status der Patienten beeinflußt. TECK ist vermutlich auch in Thymomen dafür verantwortlich, daß unreife Thymozyten nicht ins Blut gelangen. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe von FACS-Analysen und T-Zell-Proliferationsassays der Einfluß von Thymomen auf das periphere Immunsystem untersucht. Es zeigte sich, daß die veränderte Thymopoese und autoreaktive T-Zell-Funktion in Thymomen mit immunologischen Veränderungen im Blut korreliert waren. Der Anteil zirkulierender CD45RA+ CD8+ T-Zellen war bei Thymompatienten im Vergleich zu gesunden Kontrollen signifikant erhöht, in Übereinstimmung mit einer intratumorösen T-Zell-Reifung, die in Richtung der CD8+-Linie verschoben war. Auf funktioneller Ebene war die intratumorös nachweisbare, thymomtypische T-Zell-Autoreaktivität gegen NF-M-B und alpha-AChR (301-398) gleichermaßen im Thymom und Blut zu finden. Diese funktionellen Studien unterstützen die Hypothese, daß die in Thymomen stattfindende Thymopoese das periphere T-Zell-Repertoire verändert. Hinsichtlich des Importes von T-Zellen aus der Peripherie in das Thymom ergaben die funktionellen Assays dagegen, daß T-Zellen, die auf ein fremdes Antigen (Tetanus Toxoid) reagierten, nur innerhalb zirkulierender T-Zellen, nicht aber innerhalb intratumoröser Thymozyten nachweisbar waren. Ebenso fanden sich erhöhte autoreaktive T-Zell-Antworten gegen andere Fragmente des NF-M-Proteins (NF-M-A und NF-M-C) sowie für ein Fragment der delta-Untereinheit des AChR nur im Blut von Thymompatienten. Diese Befunde sprechen dafür, daß die Migration von Effektor-T-Zellen aus der Peripherie ins Thymom vermindert ist. Während die Mechanismen für diese gestörte T-Zell-Rezirkulation ins Thymom ungeklärt sind, bestand eine Korrelation zwischen der Expression des B-Zell-spezifischen Chemokins BLC (B-Lymphocyte chemoattractant) und der Anzahl der B-Zellen, die immunhistochemisch in den entsprechenden Geweben dargestellt wurden. Dieser Befund kann auf eine Rolle von BLC bei der Migration reifer B-Zellen in Thymus- bzw. Thymomgewebe hinweisen. Zusammenfassend konnten im Rahmen der vorliegenden Arbeit Mikromilieufaktoren benannt werden, die von potentieller pathogenetischer Relevanz für die gestörte, nicht-tolerogene Thymopoese innerhalb von Thymomen sind. Zweitens konnte eindeutig gezeigt werden, daß die intratumoröse Thymopoese das periphere Immunsystem beeinflußt und bei MG-assoziierten Thymomen in Richtung auf ein höheres autoreaktives Potential verändert / Thymomas are the only tumors that generate mature T cells from immature precursors. In particular, the precursor subsets are increased inside thymomas while the mature T-cell subsets are decreased compared with normal thymus. Moreover, the number of B cells and effector T-cells are diminished in thymomas. It is unknown, which kind of intratumorous factors are responsible for the abnormal thymopoiesis and abnormal thymocyte subset composition in these tumors. The aim of this study was therefore to investigate micromilieu factors inside thymomas which have an impact on the abnormal thymopoiesis and on the extrathymic immune system. In the first part of the study, the molecular basis of the abnormal thymopoiesis and the generation of autoreactive T cells inside thymomas were investigated. It was shown, that the previously described thymoma protein p153 and the midsize-neurofilament (NF-M) are the same molecule. This potential autoantigen could have an impact on the generation of autoreactive T cells by influencing the positive selection inside thymomas. Using T-cell proliferation assays, intratumorous T cells showed significantly increased responses to one fragment of this protein (NF-M-B) in thymoma patients with myasthenia gravis (MG), in contrast to MG patients with thymitis or thymoma patients without MG. NF-M-B reactive T cells were characteristic for paraneoplastic MG while anti-AChR responses were increased in MG patients in general. These results offer further evidence that intratumurous NF-M is an autoantigenic determinant in paraneoplastic MG. Further investigations concerning the micromilieu inside thymomas were performed, using cDNA array technology and RT-PCR analysis. Among the differentially expressed genes were "heparin-binding growth-associated molecule" (HB-GAM) and the "B-cell growth factor" (BCGF 1). The expression of HB-GAM depended on the histological thymoma subtype (cortical > mixed/medullar) and on the MG association of the thymomas (MG+ > MG-). By contrast, BCGF 1 was significantly increased in thymomas of patients without MG, irrespective of the histological thymoma subtype. Furthermore, there was a significant association between the expression of the chemokine "Interferon-inducible T cell alpha chemoattractant" (I-TAC) and the occurrence of MG. These results could be a hint at an influence of HB-GAM, BCGF 1 or I-TAC on the pathogenesis of MG. By contrast, expression of the chemokine "thymus-expressed chemokine" (TECK) was normal irrespective of the histological thymoma subtype and the MG association. Therefore, this chemokine probably acts as a "thymocyte retention factor" inside thymomas as previously described for non-neoplastic thymus. In the second part of this work, the impact of thymomas on the peripheral immune system was investigated, using FACS analysis and T-cell proliferation assays. The results showed, that abnormal thympoiesis and autoreactive T-cell function in thymomas correspond with immunologic alterations in the blood. Specifically, the proportion of circulating CD45RA+ CD8+ T cells was significantly increased in patients with thymoma compared with normal controls, in accordance with intratumorous T-cell development that is abnormally skewed toward the CD8+ phenotype. On the functional level, the intratumous thymoma-specific T-cell responses to NF-M-B and alpha-AChR (301-398) were equally distributed between thymomas and blood. These functional studies support the hypothesis that thymopoiesis occurring within thymomas alters the peripheral T-cell repertoire. Concerning T-cell import from the periphery into thymomas, the functional studies demonstrate that T-cell responses to foreign antigen (ie, tetanus toxoid) were seen only among circulating T cells and not among thymoma-derived T cells. Moreover, increased autoreactive T-cell responses towards other fragments of the NF-M protein (NF-M-A, NF-M-C) or toward a fragment of the AChR d-subunit could be detected only in the blood of thymoma patients. These results demonstrate a diminished migration of effector T-cells from the periphery into thymomas. While the mechanisms for this altered T-cell recirculation are still unknown, the results of this study could show a correlation between the expression of the B-cell chemokine "B-lymphocyte chemoattractant" (BLC) and the number of B cells as determined by immunohistochemistry. This is a hint at a role of BLC in the migration of mature B cells into thymus or thymoma tissue. In summary, the present study could identify micromilieu factors with potential relevance for the pathogenesis of the disturbed, non-tolerogenic thympoiesis occurring inside thymomas. Furthermore, it could be shown unequivocally that intratumorous thymopoiesis has an impact on the peripheral immune system of virtually all thymoma patients but contributes to its increased autoreactive potential specifically in thymoma patients with myasthenia gravis.