Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2017-07-12T16:05:41Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Dissertação ADALUCIA DA SILVA PPGG 2016.pdf: 2174365 bytes, checksum: e3305d6246515bbc247cd29783f8b265 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-12T16:05:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Dissertação ADALUCIA DA SILVA PPGG 2016.pdf: 2174365 bytes, checksum: e3305d6246515bbc247cd29783f8b265 (MD5) Previous issue date: 2016-03-07 / FACEPE / Os tripanossomatídeos são parasitas flagelados causadores de diversas doenças humanas e que apresentam algumas características moleculares bem distintas. Nestes organismos, o controle da sua expressão gênica é quase exclusivamente pós-transcricional e dados obtidos até o momento sugerem que a etapa de iniciação da tradução tem um papel importante neste controle. Durante a iniciação da tradução de eucariotos, o complexo trimérico eIF4F (formado pelas subunidades eIF4A, eIF4G e eIF4E) tem uma participação importante no reconhecimento do mRNA, facilitando o recrutamento ribossomal para iniciar a síntese proteica. Múltiplos homólogos das subunidades do complexo eIF4F foram identificados em tripanossomatídeos, mas não foi possível elucidar a função específica de cada um deles. Desta forma, este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de um ensaio in vivo para a avaliação do efeito da superexpressão desses homólogos de Trypanosoma brucei na tradução de um mRNA repórter, o qual codifica a proteína GFP (green fluorescent protein). Três linhagens repórter foram obtidas (4212, 4213 e 4235) e sete homólogos das subunidades do complexo eIF4F e um de PABP foram testados nestas linhagens. A análise da superexpressão foi feita através de ensaios de Western blot, seus perfis de crescimento foram avaliados por curvas de crescimento e a expressão de GFP foi avaliada através de citometria de fluxo. Os resultados apresentados mostram que as linhagens repórter 4213 e 4235 são viáveis para serem utilizadas na caracterização das proteínas envolvidas no controle da expressão gênica de tripanossomatídeos. Foi observado que as proteínas EIF4E1 e EIF4E2 provocam diminuição do crescimento, enquanto a superexpressão de EIF4E3, EIF4E4, EIF4E4W279A, EIF4G3, EIF4G4 e PABP1 não alteram o crescimento celular dos parasitas. Apesar da detecção de variações na expressão de GFP durante a superexpressão de alguns dos homólogos testados, não foi possível, contudo, confirmar que estas proteínas aumentam ou diminuem a tradução. Ensaios complementares ainda precisam ser feitos para confirmar a real função destes. / The trypanosomatids are flagellated parasites responsible for several human diseases and which display unique molecular characteristics. Control of gene expression in these organisms is almost exclusively post-transcriptional and the data generated so far suggest that the initiation stage of translation plays an important role in this control. During translation initiation in eukaryotes, the trimeric complex eIF4F (formed by the eIF4A eIF4G and eIF4E subunits) has a relevant role in mRNA recognition and facilitates ribosomal recruitment to start the protein synthesis. Multiples homologues for the eIF4F subunits have been identified in trypanosomes, but it has not been possible to elucidate their specific functions. Thus, this study aimed to develop an in vivo assay to evaluate the effect of the overexpression of these Trypanosoma brucei homologues during the translation of a reporter mRNA encoding for the green fluorescent protein (GFP). Three reporter strains were generated (4212, 4213 and 4235) in which seven homologues of eIF4F subunits and one of their PABP partner were overexpressed. Confirmation of overexpression was carried out by Western blot assays, growth profiles were evaluated by cell counting and GFP expression was assessed by flow cytometry. The results generated show that the reporter lines 4213 and 4235 are feasible for use in the characterization of proteins involved in the control of trypanosomatids gene expression. Overexpression of EIF4E1 and EIF4E2 was seen to induce a reduction in cell growth, while EIF4E3, EIF4E4, EIF4E4W279A, EIF4G3, EIF4G4 and PABP1 did not interfere with growh. Despite the detection of variations in GFP expression during overexpression of some of the homologues tested it was not possible to confirm if these proteins increase or decrease translation. Complementary assays still need to be done to confirm the true function of these factors.