Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-17T17:31:57Z No. of bitstreams: 1 tese_BCM_FlaviaCarolinaFaustinodeAraujo (1).pdf: 6447994 bytes, checksum: e1003f53d66906ae9e36b51d22b19b5a (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-17T17:32:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 tese_BCM_FlaviaCarolinaFaustinodeAraujo (1).pdf: 6447994 bytes, checksum: e1003f53d66906ae9e36b51d22b19b5a (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-17T17:32:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 tese_BCM_FlaviaCarolinaFaustinodeAraujo (1).pdf: 6447994 bytes, checksum: e1003f53d66906ae9e36b51d22b19b5a (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-17T17:32:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_BCM_FlaviaCarolinaFaustinodeAraujo (1).pdf: 6447994 bytes, checksum: e1003f53d66906ae9e36b51d22b19b5a (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / As hipóteses deste trabalho são a de que parasitos que causam recaídas são geneticamente homólogos aos parasitos das infecções primárias e que infecções múltiplas podem estar presentes nas infecções primárias e recaídas; Além dessas, outra hipóstese é de que a hepcidina esteja envolvida no desenvolvimento de recaídas. Neste contexto, o objetivo do trabalho foi analisar a variabilidade genética de isolados de amostras pareadas infecção primária/recaídas de um mesmo paciente e investigar a associação entre a homeostase do ferro, particularmente da hepcidina e sua associação com a ativação dos hipnozoítos além de avaliar a resposta imunológica contra os principais antígenos do P. vivax. Sessenta e cinco amostras pareadas de 30 pacientes foram genotipadas utilizando 10 marcadores moleculares através de eletroforese capilar. Além disso, a presença de infecção múltipla nos pacientes foi confirmada através da clonagem dos fragmentos amplificados dos microssatélites e genotipagem a partir de diferentes colônias. Na análise baseada nos alelos predominantes foi demonstrado que os parasitos da recaída são principalmente heterólogos em relação à infecção primária e que geralmente ocorre uma flutuação entre os alelos predominantes nos diferentes episódios do indivíduo. Entretanto, o número de alelos por marcador foi limitado e geralmente os alelos foram idênticos nos diferentes episódios da doença num mesmo paciente. A principal contribuição deste estudo foi demonstrar uma alta taxa de infecções múltiplas tanto das infecções primárias como nas recaídas, sendo que infecções múltiplas puderam ser identificadas com um mínimo de Cinco marcadores. Foram feitas dosagens bioquímicas de ferro, ferritina, níveis de hepcidina e análise de outras variáveis como hemoglobina e parasitemia dos pacientes. Houve diferença significativa entre os grupos somente na análise de níveis de hemoglobina sendo maior nas recaídas. Acredita-se que o número de amostras foi um limitante das análises estatísticas. O gene codificador da hepcidina foi sequenciado nas amostras de área sem transmissão e de área endêmica. Não foram encontrado polimorfismos nesse gene mostrando seu alto grau de conservação. Não foi observada diferença nos níveis de resposta imunológica contra os antígenos do P. vivax nas infecções primárias e recaídas. As infecções por este parasito são observadas com alta diversidade genética e com a presença de múltiplas variantes em uma mesma infecção, sendo esta, primária ou recaída da doença, variantes que podem sofrer variações em sua frequência durante a evolução da doença. Com estes resultados espera-se contribuir para o esclarecimento dos aspectos relacionados à diversidade genética dos parasitos e dos mecanismos que influenciam o desenvolvimento das recaídas do P. vivax, que poderão ajudar no seu prognóstico, direcionamento o tratamento e auxiliando no controle da doença. / The hypothesis of this study was that the parasites causing relapses are genetically homologous to the parasites from primary infections and multiple clone infections might be present in both primary and relapses of vivax malaria. Moreover the hypothesis here was that hepcidin is involved in the development of relapses In this context, the aim of the study was to analyze the genetic variability of isolates of paired samples primary / relapse infection in the same patient and to investigate the association between iron homeostasis, particularly hepcidin and its association with hypnozoites activation and to assess the immune response against the main antigens of P. vivax. Sixty-five paired samples of 30 patients were genotyped using 10 molecular markers by capillary electrophoresis. Moreover, the presence of multiple infections was confirmed by cloning of microsatellites amplicons and genotyping of different colonies. We showed that relapse parasites are mainly heterologous compared to the ones of the primary infection and that a change in the alleles composition occurs in the different episodes of the individual. However, the number of alleles per marker was usually limited and the alleles were identical in the different episodes of the disease in the same patient. The main contribution of this study was to demonstrate a high rate of multiple infections both in primary infection and relapse, demonstrated for the first time, and multiple infections could be identified with a minimum of five markers. Biochemical levels of iron, ferritin, hepcidin levels and analysis of other variables such as hemoglobin and parasitemia of patients were performed. There was a significant difference between the groups only in the analysis of hemoglobin levels being higher in relapse. It is believed that the number of samples was a restriction to statistical analysis. The gene encoding hepcidin was sequenced in samples from area without transmission and endemic area. No polymorphisms were found in this gene showing the high conservation. There was no difference in levels of immune response against the antigens of P. vivax infections in primary and relapse. Infections with this parasite are observed with high genetic diversity and the presence of multiple variants in the same infection, which is primary or recurrence of disease, variants that may vary in their frequency during the course of the disease. With these results we hope to contribute to the clarification of aspects of the genetic diversity of parasites in relapses of P. vivax, which may help in the prognostic treatment guidance and ultimately help the control of the disease.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-16T17:01:19Z No. of bitstreams: 1 Tese_ClaudiaMaríaRíosVelásquez.pdf: 10298436 bytes, checksum: a818292b9ed3715f2201a29b38afb273 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-16T17:01:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_ClaudiaMaríaRíosVelásquez.pdf: 10298436 bytes, checksum: a818292b9ed3715f2201a29b38afb273 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-16T17:01:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_ClaudiaMaríaRíosVelásquez.pdf: 10298436 bytes, checksum: a818292b9ed3715f2201a29b38afb273 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-16T17:01:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_ClaudiaMaríaRíosVelásquez.pdf: 10298436 bytes, checksum: a818292b9ed3715f2201a29b38afb273 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / A malária é um problema de saúde pública. O Brasil é o país sul-americano que mais casos aporta todo ano, a maioria deles ocorridos na região Amazônica. Até o presente não há nenhuma vacina eficaz contra a malária. O controle dessa doença baseia-se principalmente no combate vetorial. Um dos desafios atuais é encontrar novas moléculas úteis para bloquear a transmissão da malária no vetor, sendo necessário para isso conhecer a biologia da interação entre os parasitos e seus hospedeiros. A maioria dos grupos de pesquisa utiliza como modelos de laboratórios combinações não naturais de Anopheles – Plasmodium. Neste trabalho foi avaliada a suscetibilidade ao P. vivax em espécies Amazônicas de Anopheles, fêmeas de Anopheles darlingi, An. albitarsis s.l., An. nuneztovari s.l. e An. triannulatus s.l. e An. aquasalis foram infectadas com P. vivax utilizando um sistema de infecção experimental por membrana artificial. Todas as espécies de Anopheles estudadas foram suscetíveis à infecção por P. vivax, porém a taxa de infecção e o numero de oocistos variaram significativamente entre elas. An. aquasalis (Spearman rho = 0.255, n = 386, p < 0.01) e An. darlingi (rho = 0.518; n = 54, p < 0.01) mostraram uma correlação positiva entre o número de gametócitos e o número de oocistos formados. Também foi avaliada a via JAK/STAT de resposta imune em A. aquasalis, durante a fase tardia da infecção, e em A. darlingi, no início da infecção. A expressão dos genes STAT, PIAS e NOS foi avaliada por q-PCR. Em An. aquasalis a expressão dos genes estudados foi induzida a partir de 8 dPI (PIAS e NOS) e 12 dPI (STAT), e começou a diminuir aos 14dPI, provavelmente indicando a indução transitória desses genes na fase tardia da infecção. Em An. darlingi não foi observada a ativação dessa via imune durante a fase inicial da infecção com P. vivax. Estudos futuros devem ser realizados para saber de que forma os genes regulados pela via JAK/STAT podem modular o desenvolvimento do P. vivax em An. aquasalis, e outras vias de sinalização devem ser estudadas na resposta de An. darlingi à infecção pelo Plasmodium. / Malaria is a public health concern. Brasil is the Latin American country with the higher number of cases registered, the most in the Amazon Region. Actually, there is not an effective vaccine against malaria and the disease control is based on vector control. New challenges include finding new molecules to block malaria transmission, making necessary to know the mechanisms involved in the Plasmodium – Anopheles interactions. The most studies have used laboratory parasite – vector pairs which does not resemble natural parasite – hst interactions. The goals of this work were 1) to compare the susceptibility of five Amazonian Anopheles mosquito species to Plasmodium vivax, and 2) to evaluate JAK/STAT immune pathway during the late-phase of A. aquasalis infection and the early phase of A. darlingi. To evaluate the P. vivax mosquito susceptibility we fed by membrane feeding assays field populations of Anopheles darlingi, An. albitarsis s.l., An. nuneztovari s.l. and An. triannulatus adult females and, An. aquasalis from colony. All the Anopheles species were susceptible to P. vivax infection, although the infection rate and oocyst numbers were significantly different among them. There was a positive correlation between the density of gametocytes and the infection rate in An. aquasalis (Spearman rho = 0.255, n = 386, p < 0.01) and An. darling (rho = 0.518; n = 54, p < 0.01). Anopheles aquasalis had high infection intensity, showing that the An. aquasalis - P. vivax pair is a feasible laboratory model. To evaluate the expression of STAT, PIAS and NOS in An. aquasalis and An. darlingi was used qPCR method. In An. aquasalis the studied genes were induzed since 8 dPI (STAT) and 12 dPI (both PIAS and NOS), and was diminishing at 14dPI, probably indicating that JAK/STAT activation in later phases of P. vivax infection is transient. In An. darlingi the genes STAT, PIAS and NOS were no expressed during the early phase of the infection with P. vivax. The role of JAK/STAT pathway, in later stages of P. vivax infection of An. darling, remains to be investigated.