Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2012-08-24T17:47:03Z No. of bitstreams: 1 Tese_Fernanda Magalhaes Freire Campos.pdf: 4772318 bytes, checksum: 555a5b9ad51faf9705b69cd3e50f2676 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-08-24T17:47:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Fernanda Magalhaes Freire Campos.pdf: 4772318 bytes, checksum: 555a5b9ad51faf9705b69cd3e50f2676 (MD5) / FAPEMIG, CNPq, PAPES V, CPqRR / Os estudos sobre os mecanismos patogênicos que levam à malária grave foram durante muitos anos restritos basicamente ao Plasmodium falciparum. Entretanto, o número de casos de P. vivax vem aumentando em todo o mundo, incluindo aqueles de malária grave. Evidências recentes sugerem que a infecção pelo P. vivax induz uma resposta imune inflamatória mais intensa que aquela induzida pelo P. falciparum. Diante disso, os objetivos deste trabalho foram: (i) investigar mediadores plasmáticos relacionados à inflamação que poderiam ser utilizados como marcadores de morbidade da malária por P. vivax; (ii) identificar indivíduos geneticamente susceptíveis e/ou resistentes à malária clínica. Na busca de biomarcadores, a hipótese investigada foi a de que as micropartículas (MPs) – vesículas resultantes da ativação e/ou apoptose celular – e os ácidos nucléicos circulantes (CNAs) estariam associados à infecção pelo P. vivax. Em pacientes bem caracterizados clinicamente foi possível demonstrar que as MPs, de diferentes origens, estavam significativamente aumentadas na malária por P. vivax, sendo as MPs de origem plaquetária associadas à sintomatologia da doença. Os níveis de CNAs plasmáticos estavam aumentados nos pacientes infectados pelo P. vivax sendo estes níveis associados ao espectro clínico da doença. Um achado interessante no presente trabalho foi que os níveis de CNAs também correlacionaram- se com a trombocitopenia. Um resultado de grande importância foi que os níveis de MPs e CNAs no plasma retornaram aos valores basais após o tratamento antimalárico específico, o que sugere que ambos os fatores podem ser bons marcadores de morbidade por P. vivax. Na segunda parte do estudo, buscou- se a associação entre os polimorfismos genéticos de citocinas (MIF, TNF-α, IL-10 e TGF-β) e de glicoproteínas plaquetárias (GPIa/IIa e GPIIb/IIIa) com as complicações clínicas e hematológicas da infecção pelo P. vivax. Os resultados obtidos evidenciaram associações entre os polimorfismos dos genes GPIa/IIa, TNF-α, MIF e IL-10 e alterações clínicas e hematológicas na malária causada pelo P. vivax. Em resumo, os dados apresentados reforçam a influência de múltiplos genes do hospedeiro vertebrado na malária por P. vivax. Espera-se que os resultados observados no presente trabalho possam contribuir no esclarecimento dos mecanismos envolvidos na patogenia do P. vivax . / Study of the mechanisms involved in the pathogenesis of severe malaria has been widely concentrated in malaria caused by P. falciparum. However, the number of severe cases of P. vivax has been increasing, placing P. vivax infection in a higher status of global health concern. The few studies that had addressed the pathogenesis of vivax malaria had shown that P. vivax infection induces greater host inflammatory responses compared to P. falciparum malaria. Here, the main objectives of the study were: (i) to investigate plasma-derived mediators of inflammation that could be a potential marker of P. vivax clinical disease, (ii) to identify individuals who are genetically susceptible and/or resistant to vivax malaria. Searching for biomarkers, the hypothesis investigated was that cellular microparticles (MPs) – submicron membrane vesicles released upon cellular activation or apoptosis– and circulating nucleic acids (CNAs) are involved in P.vivax infection. In patients clinically well characterized, it was possible to demonstrate that MPs from different cellular origins were significantly increased in P. vivax infection, and those platelet-derived were associated with acute malaria symptoms. Also, the levels of CNAs were increased in plasma of P. vivax patients, with their levels associated with the clinical spectrum of vivax malaria. An interesting finding was that the levels of CNAs were correlated with thrombocytopenia. Of importance, the levels of MPs and CNAs in plasma returned to basal values after specific antimalarial treatment, which suggested they may have potential as biomarkers of vivax morbidity. Further, we sought to investigate the association between genetic polymorphisms in cytokines (MIF, TNF-α, IL-10 and TGF-β) and platelet surface glycoproteins (GPIa/IIa and GPIIb/IIIa) with clinical complications of P. vivax infection. The results showed associations between genetic polymorphisms of several genes – GPIa/IIa, TNF-α, MIF and IL-10 – with hematological and clinical parameters of P. vivax infection. Taken together, the results presented here may shed light on the mechanism involved in the pathogenesis of P.vivax, and it might contribute to the current studies on P. vivax malaria.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-01-25T14:50:53Z No. of bitstreams: 1 Antonio mauro Rezende.pdf: 690614 bytes, checksum: b6e63e721fa01db8344fd047db4db0fe (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-25T14:50:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Antonio mauro Rezende.pdf: 690614 bytes, checksum: b6e63e721fa01db8344fd047db4db0fe (MD5) Previous issue date: 2009 / A malária humana é causada por protozoários do gênero Plasmodium. Atualmente, mais de 2 bilhões de pessoas estão sob risco de contrair malária sobretudo em áreas tropicais e subtropicais. No Brasil, a malária está concentrada na região da Amazônia Legal, onde se registram mais de 99% dos casos, sendo cerca de 80% causados pelo Plasmodium vivax. Estratégias efetivas de combate ao parasito são essenciais para o controle da doença, e estas dependem do entendimento de diversos fatores como, por exemplo, a variabilidade genética e a estrutura populacional do P. vivax. Desta maneira, os marcadores moleculares são importantes ferramentas que podem auxiliar na elucidação destes aspectos biológicos do parasito. Contudo, poucos marcadores moleculares estão disponíveis para estudos populacionais de P. vivax, comparado ao P. falciparum, principalmente marcadores neutros ou quase neutros, ideais para esse tipo de estudo. Portanto, o objetivo deste trabalho foi identificar novos microssatélites em P. vivax e realizar análises de genética de população em isolados de cinco áreas da Amazônia Brasileira utilizando esses microssatélites e os cinco marcadores do tipo TR mais polimórficos descritos na literatura. Deste modo, uma busca in silico foi realizada utilizando o rascunho do genoma do parasito, e foram selecionados microssatélites com unidades repetitivas variando de 2 a 4 pares de base. Cada locus foi amplificado utilizando iniciadores específicos, incluindo os TRs cujos iniciadores foram baseados na literatura. O DNA molde para a realização da amplificação foi extraído de pacientes com infecção aguda de P. vivax. Os produtos amplificados foram analisados em seqüenciadores automáticos de DNA utilizando programas de análise de tamanhos de fragmentos. As análises de genética de população foram realizadas utilizando vários pacotes computacionais. Ambos marcadores detectaram uma alta diversidade nas populações estudadas. Porém, algumas diferenças foram identificadas nas análises com cada tipo de marcador molecular, dentre elas: as populações geneticamentes próximas foram diferentes juntamente com o padrão de desequilíbrio de ligação em cada população e a taxa de multiplicidade de infecção também variou entre os tipos de marcadores. Além disso, foi possível, utilizando os microssatélites, estruturar as populações, o que não ocorreu utilizando os TRs. Por fim, foi possível perceber que os microssatélites se mostraram mais polimórficos, mais bem distribuídos pelo genoma do parasito e ainda assim, o seu mecanismo de manutenção de variabilidade é conhecido, logo, eles aparentam ser mais aptos na utilização de estudos de genética de população de P. vivax. / Human malaria is caused by a protozoan from genus Plasmodium. Currently, more than 2 billion people are under risk to contract malaria mainly in tropical and subtropical areas. In Brazil, malaria is concentrated in the Legal Amazon, where more than 99% of the cases are registered, being around 80% caused by Plasmodium vivax. Effective strategies of combating are essential to control the disease, and these ones depend on understanding of many factors such as the genetic variability and population structure of P. vivax. Hence, molecular markers are important tools that can help to elucidate these biological aspects of the parasite. However, few molecular markers are available for population studies of P. vivax, compared with P. falciparum, mainly neutral or near neutral markers, which are indicated for this kind of study. Thus, the aim of this work was to identify new polymorphic microsatellite loci in P. vivax and to perform population genetic analyses with isolates from five areas of Brazilian Amazon using these microsatellites and also the five most polymorphic tandem repeats markers described in literature. For this, an in silico search was performed using the genome draft of the parasite, and microsatellite with repeat units ranging from 2 to 4 base pairs were selected. Each locus was amplified using specific primers, including the TRs whose primers were previously described. The template DNA for amplification was obtained from patient’s blood with acute P. vivax infection. The amplified products were analyzed in automatic DNA sequencer using software to identify fragments size. The genetic population analyses were performed with several computational packages. Although, some differences were identified among the measured parameters with each kind of molecular marker: the populations genetically close, linkage disequilibrium pattern in each population and level of multiple infection were different. Besides, it was possible, using the microsatellites, to detect structuring of the populations, what did not happen using the TRs. In conclusion, it was possible to notice that the microsatellite are more polymorphic, more spread across parasite genome, and its variability maintenance mechanism is known; thus, they seem to be more useful in population genetic studies of P. vivax field isolates.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-17T17:31:57Z No. of bitstreams: 1 tese_BCM_FlaviaCarolinaFaustinodeAraujo (1).pdf: 6447994 bytes, checksum: e1003f53d66906ae9e36b51d22b19b5a (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-17T17:32:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 tese_BCM_FlaviaCarolinaFaustinodeAraujo (1).pdf: 6447994 bytes, checksum: e1003f53d66906ae9e36b51d22b19b5a (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-17T17:32:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 tese_BCM_FlaviaCarolinaFaustinodeAraujo (1).pdf: 6447994 bytes, checksum: e1003f53d66906ae9e36b51d22b19b5a (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-17T17:32:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_BCM_FlaviaCarolinaFaustinodeAraujo (1).pdf: 6447994 bytes, checksum: e1003f53d66906ae9e36b51d22b19b5a (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / As hipóteses deste trabalho são a de que parasitos que causam recaídas são geneticamente homólogos aos parasitos das infecções primárias e que infecções múltiplas podem estar presentes nas infecções primárias e recaídas; Além dessas, outra hipóstese é de que a hepcidina esteja envolvida no desenvolvimento de recaídas. Neste contexto, o objetivo do trabalho foi analisar a variabilidade genética de isolados de amostras pareadas infecção primária/recaídas de um mesmo paciente e investigar a associação entre a homeostase do ferro, particularmente da hepcidina e sua associação com a ativação dos hipnozoítos além de avaliar a resposta imunológica contra os principais antígenos do P. vivax. Sessenta e cinco amostras pareadas de 30 pacientes foram genotipadas utilizando 10 marcadores moleculares através de eletroforese capilar. Além disso, a presença de infecção múltipla nos pacientes foi confirmada através da clonagem dos fragmentos amplificados dos microssatélites e genotipagem a partir de diferentes colônias. Na análise baseada nos alelos predominantes foi demonstrado que os parasitos da recaída são principalmente heterólogos em relação à infecção primária e que geralmente ocorre uma flutuação entre os alelos predominantes nos diferentes episódios do indivíduo. Entretanto, o número de alelos por marcador foi limitado e geralmente os alelos foram idênticos nos diferentes episódios da doença num mesmo paciente. A principal contribuição deste estudo foi demonstrar uma alta taxa de infecções múltiplas tanto das infecções primárias como nas recaídas, sendo que infecções múltiplas puderam ser identificadas com um mínimo de Cinco marcadores. Foram feitas dosagens bioquímicas de ferro, ferritina, níveis de hepcidina e análise de outras variáveis como hemoglobina e parasitemia dos pacientes. Houve diferença significativa entre os grupos somente na análise de níveis de hemoglobina sendo maior nas recaídas. Acredita-se que o número de amostras foi um limitante das análises estatísticas. O gene codificador da hepcidina foi sequenciado nas amostras de área sem transmissão e de área endêmica. Não foram encontrado polimorfismos nesse gene mostrando seu alto grau de conservação. Não foi observada diferença nos níveis de resposta imunológica contra os antígenos do P. vivax nas infecções primárias e recaídas. As infecções por este parasito são observadas com alta diversidade genética e com a presença de múltiplas variantes em uma mesma infecção, sendo esta, primária ou recaída da doença, variantes que podem sofrer variações em sua frequência durante a evolução da doença. Com estes resultados espera-se contribuir para o esclarecimento dos aspectos relacionados à diversidade genética dos parasitos e dos mecanismos que influenciam o desenvolvimento das recaídas do P. vivax, que poderão ajudar no seu prognóstico, direcionamento o tratamento e auxiliando no controle da doença. / The hypothesis of this study was that the parasites causing relapses are genetically homologous to the parasites from primary infections and multiple clone infections might be present in both primary and relapses of vivax malaria. Moreover the hypothesis here was that hepcidin is involved in the development of relapses In this context, the aim of the study was to analyze the genetic variability of isolates of paired samples primary / relapse infection in the same patient and to investigate the association between iron homeostasis, particularly hepcidin and its association with hypnozoites activation and to assess the immune response against the main antigens of P. vivax. Sixty-five paired samples of 30 patients were genotyped using 10 molecular markers by capillary electrophoresis. Moreover, the presence of multiple infections was confirmed by cloning of microsatellites amplicons and genotyping of different colonies. We showed that relapse parasites are mainly heterologous compared to the ones of the primary infection and that a change in the alleles composition occurs in the different episodes of the individual. However, the number of alleles per marker was usually limited and the alleles were identical in the different episodes of the disease in the same patient. The main contribution of this study was to demonstrate a high rate of multiple infections both in primary infection and relapse, demonstrated for the first time, and multiple infections could be identified with a minimum of five markers. Biochemical levels of iron, ferritin, hepcidin levels and analysis of other variables such as hemoglobin and parasitemia of patients were performed. There was a significant difference between the groups only in the analysis of hemoglobin levels being higher in relapse. It is believed that the number of samples was a restriction to statistical analysis. The gene encoding hepcidin was sequenced in samples from area without transmission and endemic area. No polymorphisms were found in this gene showing the high conservation. There was no difference in levels of immune response against the antigens of P. vivax infections in primary and relapse. Infections with this parasite are observed with high genetic diversity and the presence of multiple variants in the same infection, which is primary or recurrence of disease, variants that may vary in their frequency during the course of the disease. With these results we hope to contribute to the clarification of aspects of the genetic diversity of parasites in relapses of P. vivax, which may help in the prognostic treatment guidance and ultimately help the control of the disease.