Dosage compensation is the key regulatory process employed in <i>Drosophila melanogaster</i> to equalize the level of gene transcripts between the single X chromosome in males (XY) and the two X chromosomes in females (XX). Dimorphic sex chromosomes evolved by the severe degeneration of the Y chromosome, giving rise to an imbalance between the heterogametic sex and the homogametic sex. Vital to the viability of male Drosophila is the dosage compensation complex (DCC), a ribonucleoprotein complex that mediates the precise two-fold transcription of the single male X chromosome. The DCC is comprised of five proteins: male-specific-lethal proteins (MSL) 1, 2, and 3, male absent-on-the-first (MOF), maleless (MLE), and two non-coding RNAs. The complex specifically co-localizes along the male X chromosome in a reproducible manner, resulting in acetylation of lysine 16 of the N-terminal tail of histone H4. The exact mechanism of recruitment and spreading of the DCC along the male X chromosome remains unclear; recent studies propose a multi-step mechanism involving DNA sequence elements, epigenetic marks, and transcription. Understanding how dosage compensation functions provides insight into the interplay between gene regulation and chromatin remodelling. The goal of this project was to better understand how <i>Drosophila</i> MSL1, MSL3, and MOF interact and how their interaction modulates MOFs acetyltransferase activity. Recombinant protein constructs were cloned and over-expressed in a bacterial expression system permitting future structure determination by X-ray crystallography. The dMSL1820-1039 construct consisted of the C-terminal domain, reported to be able to interact with both dMSL3 and dMOF. dMSL3186-512 contained the domain required for the interaction with dMSL1 and dMOF. dMOF371-827 was comprised of the catalytic domain, the CCHC zinc finger, and the chromodomain, as the N-terminal region does not encode any known domains. All three recombinant proteins were successfully cloned, over-expressed, and purified to homogeneity. Recombinant dMOF371-827 was determined to acetylate histones. Interaction studies using GST pull-down assays and size exclusion chromatography determined that dMSL1820-1039 and dMOF371-827 did not interact above background levels. Moreover, size exclusion chromatography revealed dMSL3186-512 and dMOF371-827 did not interact nor did the three recombinant proteins form a stable complex.

Dosage compensation is the key regulatory process employed in <i>Drosophila melanogaster</i> to equalize the level of gene transcripts between the single X chromosome in males (XY) and the two X chromosomes in females (XX). Dimorphic sex chromosomes evolved by the severe degeneration of the Y chromosome, giving rise to an imbalance between the heterogametic sex and the homogametic sex. Vital to the viability of male Drosophila is the dosage compensation complex (DCC), a ribonucleoprotein complex that mediates the precise two-fold transcription of the single male X chromosome. The DCC is comprised of five proteins: male-specific-lethal proteins (MSL) 1, 2, and 3, male absent-on-the-first (MOF), maleless (MLE), and two non-coding RNAs. The complex specifically co-localizes along the male X chromosome in a reproducible manner, resulting in acetylation of lysine 16 of the N-terminal tail of histone H4. The exact mechanism of recruitment and spreading of the DCC along the male X chromosome remains unclear; recent studies propose a multi-step mechanism involving DNA sequence elements, epigenetic marks, and transcription. Understanding how dosage compensation functions provides insight into the interplay between gene regulation and chromatin remodelling. The goal of this project was to better understand how <i>Drosophila</i> MSL1, MSL3, and MOF interact and how their interaction modulates MOFs acetyltransferase activity. Recombinant protein constructs were cloned and over-expressed in a bacterial expression system permitting future structure determination by X-ray crystallography. The dMSL1820-1039 construct consisted of the C-terminal domain, reported to be able to interact with both dMSL3 and dMOF. dMSL3186-512 contained the domain required for the interaction with dMSL1 and dMOF. dMOF371-827 was comprised of the catalytic domain, the CCHC zinc finger, and the chromodomain, as the N-terminal region does not encode any known domains. All three recombinant proteins were successfully cloned, over-expressed, and purified to homogeneity. Recombinant dMOF371-827 was determined to acetylate histones. Interaction studies using GST pull-down assays and size exclusion chromatography determined that dMSL1820-1039 and dMOF371-827 did not interact above background levels. Moreover, size exclusion chromatography revealed dMSL3186-512 and dMOF371-827 did not interact nor did the three recombinant proteins form a stable complex.

Μελέτες στη Μεσογειακή μύγα έχουν οδηγήσει στον χαρακτηρισμό πέντε άρρενο-ειδικών πρωτεϊνών (MSSPs) οι οποίες είναι ομο- και ετερο- διμερή δύο συγγενών, τύπου α και β, πολυπεπτιδίων (MSSP-α και –β). Τα πολυπεπτίδια αυτά κωδικοποιούνται από τουλάχιστον 7 γονίδια τα οποία με βάση την ομοιότητα των αλληλουχιών τους κατατάσσονται σε 3 ομάδες: msspα (α1 και α2), msspβ (β1, β2 και β3) και msspγ (γ1 και γ2). Λειτουργική ανάλυση των υποκινητών των γονιδίων msspα2 και msspβ2 έδειξε ότι το γονίδιο msspα2 εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα στο λιπώδη ιστό των ενήλικων αρσενικών ατόμων ενώ το γονίδιο msspβ2 εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα στο έντερο και των δύο φύλων. Με στόχο την αρρενο- ειδική υπερέκφραση τής αλκοολικής αφυδρογονάσης τής D. melanogaster σε άτομα C. Capitata για την κατασκευή ενός Στελέχους Διαλογής Φύλου στη Μεσογεική μύγα στο οποίο παρουσία υψηλών επιπέδων αλκοόλης θα πεθαίνουν τα θηλυκά άτομα, ενώ τα αρσενικά θα επιβιώνουν, κατασκευάστηκαν διαγονιδιακά στελέχη τα οποία έφεραν το γονίδιο DmadhFAST υπό τον έλεγχο της περιοχής -522/+37 (α2PL) του γονιδίου msspα2. Η κατασκευή των διαγονιδιακών στελεχών έγινε με γενετικό μετασχηματισμό χρησιμοποιώντας το σύστημα μετασχηματισμού Minos. Από την ανάλυση 9 μετασχηματισμένων σειρών σε επίπεδο RNA (Northern ανάλυση και RT-PCR) και σε επίπεδο πρωτεΐνης (Western ανάλυση και Adh assay) προέκυψαν τα εξής συμπεράσματα: α) Ο υποκινητής α2PL είναι κατάλληλος για υψηλή φύλο-ειδική έκφραση διαγονιδίων στα ενήλικα αρσενικά άτομα της Μεσογειακής μύγας και β) Το γονίδιο της ADH της D. melanogaster πιθανόν δεν είναι το κατάλληλο γονίδιο επιλογής για τη δημιουργία στελεχών γενετικού διαχωρισμού του φύλου στη Μεσογειακή μύγα. Επιπλέον, στην παρούσα διατριβή επιλέχθηκε να μελετηθεί ο τρόπος έκφρασης του γονιδίου msspβ1. Όπως και με το msspα2 γονίδιο μελετήθηκε η λειτουργία του msspβ1 γονιδίου, in vivo, σε μετασχηματισμένες σειρές χρησιμοποιώντας το τμήμα -485/+35 (β1PL) του υποκινητή και το γονίδιο lacZ ως γονίδιο αναφοράς. Οι αναλύσεις έκφρασης του διαγονιδίου lacZ, τόσο στο επίπεδο του RNA (RT-PCR) όσο και στο επίπεδο της πρωτεΐνης (β-gal assay), σε 7 διαφορετικές σειρές έδειξαν ότι το τμήμα β1PL είναι αρκετό για την ορθή χρονο- ειδική έκφραση του διαγονιδίου σύμφωνα με το φυσιολογικό πρότυπο έκφρασης των mssp-α και -β γονιδίων, εντούτοις, δεν παρουσιάζει αυστηρά άρρενο-ειδικό πρότυπο έκφρασης, αν και η έκφραση στα αρσενικά άτομα ήταν εντονότερη από ότι στα θηλυκά. Από τη σύγκριση των επιπέδων μεταγραφής του διαγονιδίου lacZ υπό τον έλεγχο του υποκινητή β1PL με εκείνα του διαγονιδίου DmadhFAST υπό τον έλεγχο του υποκινητή α2PL, φαίνεται ότι η ισχύς του υποκινητή του γονιδίου msspβ1 είναι εκατοντάδες φορές μικρότερη από εκείνη του msspα2. Τα αποτελέσματα αυτά σε συνδυασμό με προηγούμενη μελέτη υποδηλώνουν ότι το δεύτερο γονίδιο mssp που εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα και με αρρενο-ειδικό τρόπο θα πρέπει να είναι το msspβ3 γονίδιο ή κάποιο άλλο mssp γονίδιο του οποίου το προϊόν είναι ένα MSSP πολυπεπτίδιο τύπου β. / Studies in the medfly have led to the characterization of five male-specific serum proteins (MSSPs) that are homo- and hetero- dimmers of two major polypeptide types, MSSP-α and –β. These polypeptides are coded by at least 7 distinct genes which, based on their homology, are classified in three subgroups, MSSP-α (α1 and α2), MSSP-β (β1, β2 and β3) and MSSP-γ (γ1 and γ2). Functional analysis of the msspa2 and msspβ2 promoters showed that msspa2 is expressed in high levels in the fat body of adult male individuals, whereas msspβ2 is expressed in low levels in the midgut of both sexes. In order to overexpress in a male-specific manner the D. melanogaster alcohol dehydrogenase (ADH) in C. capitata for the construction of a Genetic Sexing Strain (GSS) in the medfly, which in the presence of high alcohol concentration will lead to the death of female and the survival of the male individuals, we constructed transgenic medfly strains using DmadhFAST under the control of the -522/+37 fragment (α2PL) of the msspa2 promoter, via Minos-mediated germline transformation. The RNA analysis (Northern and RT-PCR) and the protein analysis (Western and Adh assay) of 9 transgenic strains showed that: a) The α2PL fragment is sufficient for high levels of male-specific expression of transgenes in the medfly and b) The D. melanogaster ADH gene may not be the appropriate gene for the construction of GSS strains in the medfly. In addition in the present study we performed functional analysis of the msspβ1promoter in vivo in medfly transgenic adults generated by Minos-mediated germ line transformation. For this analysis we used the -485/+37 fragment of the msspβ1 promoter and the lacZ reporter gene. The RNA analysis (RT-PCR) and the protein analysis (b-gal assay) performed on 7 transgenic strains showed that the β1PL fragment is sufficient for the proper time-specific expression of the transgene in accordance to the expression pattern of mssp-a and –β genes, not in male-specific manner, although the level of expression in males was higher than in females. The comparison of the expression levels of the lacZ and the DmadhFAST transgenes showed that the α2PL promoter fragment is a hundred time stronger than the β1PL. These results indicate that msspβ3 or another β type mssp gene may be expressed in high levels in the male adults of the medfly.

No description available.

No description available.