Thesis (Ph. D.)--Cornell University, 1922. / Cover title. Includes bibliographical references.

A macieira (Malus x domestica) é uma das mais importantes frutíferas do mundo, e sua produção tem destaque na região sul do Brasil. Comparações entre padrões de expressão gênica de diferentes variedades constituem uma estratégia de alto valor científico para seu melhoramento genético. Contudo, a acurácia das análises é dependente de genes de referência estáveis para a normalização dos dados. A escolha de controles inapropriados pode resultar em determinações estatísticas e conclusões incorretas. Pelo presente trabalho, teve-se como objetivo selecionar os melhores genes-referência para estudos de expressão gênica em macieiras, via reação em cadeia da DNA polimerase quantitativa precedida de transcrição reversa (RT-qPCR). A expressão de 21 genes, incluindo tradicionais “housekeeping genes” ou genes sugeridos como constitutivos por dados de microarranjos disponíveis na literatura, foram avaliados em diferentes tecidos vegetativos e reprodutivos da cultivar ‘Gala’ de macieira. Para todos os genes, as combinações de primers testadas permitiram amplificações específicas e curvas de eficiência apropriadas. A estabilidade dos genes foi determinada por dois diferentes algoritmos estatísticos, geNorm e NormFinder. Os resultados permitiram concluir que, para os tecidos e condições avaliadas, EF1β, MDH, SAND, THFS e WD40 são os melhores genes normalizadores para quantificação relativa da abundância de transcritos de interesse em diferentes tecidos-alvos de macieira. A expressão de PAL foi utilizada para validação dos controles selecionados. Combinações específicas de dois ou três genes-referência demonstraram ser suficientes para a normalização dos dados em cada conjunto de amostras analisado. Finalmente, a expressão do gene MDP0000232313 ou MdDAM6, potencial gene MADS-box associado à dormência em macieira, foi avaliada em gemas da cultivar ‘Fuji Standard’, amostradas durante o ciclo vegetativo e de dormência das plantas ao longo do ano 2009. As análises foram conduzidas via RT-qPCR e de forma relativa aos genes EF1β e WD40. Observou-se um nível basal de expressão de MdDAM6 durante o verão e um aumento de cerca de 10 vezes no inverno, refletindo sua possível função no estabelecimento e/ou manutenção do estado endodormente das gemas de macieira, uma vez que este tenha sido estabelecido. / Apple (Malus x domestica) is one of the most important fruit tree crop in the world, and its production is prominent in southern Brazil. Comparisons among profiles of gene expression from different cultivars are valuable scientific tools for apple genetic breeding. However, the accuracy of the analyses is dependent on the evaluation of stable reference genes for data normalization. The inappropriate choice of controls may result in statistical significance undue or incorrect conclusions. In the present work, the objective was to select the best reference genes for gene expression studies by reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) in apple trees. The expression of 21 genes, including traditional housekeeping or genes suggested as constitutive by microarray data available in the literature, was evaluated in different vegetative and reproductive tissues of the apple ‘Gala’ cultivar. For all genes, tested combinations of primers allowed specific amplification and suitable efficiency curves. The stability of the genes was determined by two different statistical algorithms, geNorm and NormFinder. The results allowed us to conclude that, for tissues and conditions evaluated, EF1β, MDH, SAND, THFS and WD40 are the best normalizing genes for relative quantification of interest transcript abundance in different target tissues of apple. PAL expression was used to validate the selected normalizers. Specific combinations of two or three reference genes were shown to be sufficient to normalize each apple sample set analyzed. Finally, the MDP0000232313 or MdDAM6 gene expression, a potential MADS-box gene associated with dormancy in apple, was evaluated in buds of the apple 'Fuji' cultivar, sampled in the vegetative and dormant cycle of plants during the year of 2009. The analysis was performed by RT-qPCR and quantified in relation to the EF1β and WD40 normalizing genes. It a basal level of expression was observed during summer and a ten fold increase during winter, reflecting its possible function associated with the establishment and/or maintenance of the endodormant state of apple buds, once it has been established.

A macieira (Malus × domestica) possui importância mundial entre as frutíferas de clima temperado, e o Brasil se destaca entre os maiores produtores mundiais de maçã.À sarna da macieira, causada pelo fungo ascomiceto Venturia inaequalis, é uma das principais doenças nessa cultura. As duas cultivares mais consumidas no Brasil, Fuji e Gala, são altamente suscetíveis à sarna. O gene Vf2, derivado do clone 821 da espécie silvestre Malus floribunda, é capaz de conferir resistência à doença. O processo de melhoramento genético da macieira e a introgressão de novos genes derivados de germoplasma é um processo demorado e difícil devido ao longo tempo de geração das plantas e à autoincompatibilidade à autopolinização em Malus.Historicamente a introgressão recombinante de genes em vegetais baseou-se na transformação genética via Agrobacterium tumefaciens. Porém, novas técnicasestão sendo estabelecidas e vem revolucionado o campo da genômica funcional em plantas como a utilização de DNA epissomal em plasmídeos vegetais derivados de vírus. Estes vetores não se integram ao genoma da planta hospedeira e não são herdáveis. Os vetores consistem de vírus modificados capazes de espalhar-se por todos os tecidos da planta tratadasem causar doença e levando à expressão de genes de interesse sem a necessidade de obtenção de plantas transgênicas. Este trabalho tevecomo objetivo transferir a resistência aV. inaequalis, conferida pelo gene Vf2, para as cultivares de macieira Fuji e Gala, utilizando-seplasmídeos vegetais baseado nos vírus TYLCV (Tomato Yellow Leaf Curl Virus). O gene de resistência Vf2 derivado de Malus floribunda 821 foi clonado nosvetores de expressão e injetadoem plantas de macieira das cultivares Maxi Gala e Fuji Suprema.O DNA plasmidial foi detectado sistemicamente nas plantas tratadas e este se manteve estável durante os8 meses de testes. A expressão do gene Vf2 foi quantificada por RT-qPCR e diversas plantas apresentaram níveis elevados de expressão deste gene de resistência. Estas plantas foram desafiadas com esporos de V. inaequalis e a maioria das plantas tratadas apresentou fenótipo resistente à sarna. A introgressão recombinante baseada em plasmídeos vegetais demonstrou ser eficaz em transferir material genético de forma sistêmica nas duas cultivares de macieira testadas. O vetor plasmidial foi detectado nas plantas tratadas durante todo o período(8 meses) avaliado neste estudo, e a expressão do gene de resistência foi detectada em diversos indivíduos. Nosso estudo reforça a aplicabilidade desta técnica em plantas lenhosas perenes e abre a possibilidade para a introgressão rápida de outras características de interesse derivadas da expressão heteróloga de genes com potencial biotecnológico. / Apple (Malus x domestica) is an important crop among temperate fruit trees, and Brazil features among the world’s biggest apple producers. The apple scab, caused by the ascomycete fungus Venturia inaequalis, is a major disease of the culture. The two most consumed cultivars in Brazil, Fuji and Gala, are highly susceptible to apple scab. The Vf gene, derived from clone 821 of the wild species Malus floribunda, is capable of conferring resistance to the scab disease. The genetic improvement process of apple by introgression of new genes derived from germplasm is lenghty due to long generation time and self-incompatibility. Historically the recombinant introgression of genes in plantshas been based on genetic transformation emplyingAgrobacterium tumefaciens. However, new techniques have been developed and are revolutionizing plantfunctional genomics such as virus-derived plant episomalplasmids.These vectors do not integrate in to thehost plant genome and are not inheritable. The vectors consist of a modified virus capable of spreading to all tissues of thetreated plant without causing disease and leading to the systemic expression of the gene of interest without the need of obtaining transgenic plants.This workaimed to transfer the resistance against V. inaequalis, granted by the Vf2 gene, to Fuji and Gala apple suceptible cultivars, by using plant plasmids based on TYLCV (Tomato Yellow Leaf Curl virus).The resistance gene Vf2 derived from Malus floribunda 821 was cloned on expression vectors and injectedto Maxi Gala and Fuji Supremaplants.The plasmid DNA was systemically detected on treated plants and remained stable for at least8 months.The expression of theVfgene was quantified by RT-qPCR and several plants presented high levels of Vf2expression. These plants were challenged by spores of V. inaequalis and the majority of the treated plants displayed scab resistant phenotypes.The Vf2introgression based on plant plasmidswas shown to be effective on transferring genetic material sistemically to the apple cultivars tested. The plasmids weredetected on treated plants during the whole evaluated time of this study (8 months), and the resistance gene expression was detected on several individuals. Our study reinforces the applicability of such technique in woody perennial plants and givesthe possibility for fast introgression of other characteristics of interest dependent on genes with diverse biotechnological potential.

A macieira (Malus x domestica) é uma das mais importantes frutíferas do mundo, e sua produção tem destaque na região sul do Brasil. Comparações entre padrões de expressão gênica de diferentes variedades constituem uma estratégia de alto valor científico para seu melhoramento genético. Contudo, a acurácia das análises é dependente de genes de referência estáveis para a normalização dos dados. A escolha de controles inapropriados pode resultar em determinações estatísticas e conclusões incorretas. Pelo presente trabalho, teve-se como objetivo selecionar os melhores genes-referência para estudos de expressão gênica em macieiras, via reação em cadeia da DNA polimerase quantitativa precedida de transcrição reversa (RT-qPCR). A expressão de 21 genes, incluindo tradicionais “housekeeping genes” ou genes sugeridos como constitutivos por dados de microarranjos disponíveis na literatura, foram avaliados em diferentes tecidos vegetativos e reprodutivos da cultivar ‘Gala’ de macieira. Para todos os genes, as combinações de primers testadas permitiram amplificações específicas e curvas de eficiência apropriadas. A estabilidade dos genes foi determinada por dois diferentes algoritmos estatísticos, geNorm e NormFinder. Os resultados permitiram concluir que, para os tecidos e condições avaliadas, EF1β, MDH, SAND, THFS e WD40 são os melhores genes normalizadores para quantificação relativa da abundância de transcritos de interesse em diferentes tecidos-alvos de macieira. A expressão de PAL foi utilizada para validação dos controles selecionados. Combinações específicas de dois ou três genes-referência demonstraram ser suficientes para a normalização dos dados em cada conjunto de amostras analisado. Finalmente, a expressão do gene MDP0000232313 ou MdDAM6, potencial gene MADS-box associado à dormência em macieira, foi avaliada em gemas da cultivar ‘Fuji Standard’, amostradas durante o ciclo vegetativo e de dormência das plantas ao longo do ano 2009. As análises foram conduzidas via RT-qPCR e de forma relativa aos genes EF1β e WD40. Observou-se um nível basal de expressão de MdDAM6 durante o verão e um aumento de cerca de 10 vezes no inverno, refletindo sua possível função no estabelecimento e/ou manutenção do estado endodormente das gemas de macieira, uma vez que este tenha sido estabelecido. / Apple (Malus x domestica) is one of the most important fruit tree crop in the world, and its production is prominent in southern Brazil. Comparisons among profiles of gene expression from different cultivars are valuable scientific tools for apple genetic breeding. However, the accuracy of the analyses is dependent on the evaluation of stable reference genes for data normalization. The inappropriate choice of controls may result in statistical significance undue or incorrect conclusions. In the present work, the objective was to select the best reference genes for gene expression studies by reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) in apple trees. The expression of 21 genes, including traditional housekeeping or genes suggested as constitutive by microarray data available in the literature, was evaluated in different vegetative and reproductive tissues of the apple ‘Gala’ cultivar. For all genes, tested combinations of primers allowed specific amplification and suitable efficiency curves. The stability of the genes was determined by two different statistical algorithms, geNorm and NormFinder. The results allowed us to conclude that, for tissues and conditions evaluated, EF1β, MDH, SAND, THFS and WD40 are the best normalizing genes for relative quantification of interest transcript abundance in different target tissues of apple. PAL expression was used to validate the selected normalizers. Specific combinations of two or three reference genes were shown to be sufficient to normalize each apple sample set analyzed. Finally, the MDP0000232313 or MdDAM6 gene expression, a potential MADS-box gene associated with dormancy in apple, was evaluated in buds of the apple 'Fuji' cultivar, sampled in the vegetative and dormant cycle of plants during the year of 2009. The analysis was performed by RT-qPCR and quantified in relation to the EF1β and WD40 normalizing genes. It a basal level of expression was observed during summer and a ten fold increase during winter, reflecting its possible function associated with the establishment and/or maintenance of the endodormant state of apple buds, once it has been established.

A macieira (Malus × domestica) possui importância mundial entre as frutíferas de clima temperado, e o Brasil se destaca entre os maiores produtores mundiais de maçã.À sarna da macieira, causada pelo fungo ascomiceto Venturia inaequalis, é uma das principais doenças nessa cultura. As duas cultivares mais consumidas no Brasil, Fuji e Gala, são altamente suscetíveis à sarna. O gene Vf2, derivado do clone 821 da espécie silvestre Malus floribunda, é capaz de conferir resistência à doença. O processo de melhoramento genético da macieira e a introgressão de novos genes derivados de germoplasma é um processo demorado e difícil devido ao longo tempo de geração das plantas e à autoincompatibilidade à autopolinização em Malus.Historicamente a introgressão recombinante de genes em vegetais baseou-se na transformação genética via Agrobacterium tumefaciens. Porém, novas técnicasestão sendo estabelecidas e vem revolucionado o campo da genômica funcional em plantas como a utilização de DNA epissomal em plasmídeos vegetais derivados de vírus. Estes vetores não se integram ao genoma da planta hospedeira e não são herdáveis. Os vetores consistem de vírus modificados capazes de espalhar-se por todos os tecidos da planta tratadasem causar doença e levando à expressão de genes de interesse sem a necessidade de obtenção de plantas transgênicas. Este trabalho tevecomo objetivo transferir a resistência aV. inaequalis, conferida pelo gene Vf2, para as cultivares de macieira Fuji e Gala, utilizando-seplasmídeos vegetais baseado nos vírus TYLCV (Tomato Yellow Leaf Curl Virus). O gene de resistência Vf2 derivado de Malus floribunda 821 foi clonado nosvetores de expressão e injetadoem plantas de macieira das cultivares Maxi Gala e Fuji Suprema.O DNA plasmidial foi detectado sistemicamente nas plantas tratadas e este se manteve estável durante os8 meses de testes. A expressão do gene Vf2 foi quantificada por RT-qPCR e diversas plantas apresentaram níveis elevados de expressão deste gene de resistência. Estas plantas foram desafiadas com esporos de V. inaequalis e a maioria das plantas tratadas apresentou fenótipo resistente à sarna. A introgressão recombinante baseada em plasmídeos vegetais demonstrou ser eficaz em transferir material genético de forma sistêmica nas duas cultivares de macieira testadas. O vetor plasmidial foi detectado nas plantas tratadas durante todo o período(8 meses) avaliado neste estudo, e a expressão do gene de resistência foi detectada em diversos indivíduos. Nosso estudo reforça a aplicabilidade desta técnica em plantas lenhosas perenes e abre a possibilidade para a introgressão rápida de outras características de interesse derivadas da expressão heteróloga de genes com potencial biotecnológico. / Apple (Malus x domestica) is an important crop among temperate fruit trees, and Brazil features among the world’s biggest apple producers. The apple scab, caused by the ascomycete fungus Venturia inaequalis, is a major disease of the culture. The two most consumed cultivars in Brazil, Fuji and Gala, are highly susceptible to apple scab. The Vf gene, derived from clone 821 of the wild species Malus floribunda, is capable of conferring resistance to the scab disease. The genetic improvement process of apple by introgression of new genes derived from germplasm is lenghty due to long generation time and self-incompatibility. Historically the recombinant introgression of genes in plantshas been based on genetic transformation emplyingAgrobacterium tumefaciens. However, new techniques have been developed and are revolutionizing plantfunctional genomics such as virus-derived plant episomalplasmids.These vectors do not integrate in to thehost plant genome and are not inheritable. The vectors consist of a modified virus capable of spreading to all tissues of thetreated plant without causing disease and leading to the systemic expression of the gene of interest without the need of obtaining transgenic plants.This workaimed to transfer the resistance against V. inaequalis, granted by the Vf2 gene, to Fuji and Gala apple suceptible cultivars, by using plant plasmids based on TYLCV (Tomato Yellow Leaf Curl virus).The resistance gene Vf2 derived from Malus floribunda 821 was cloned on expression vectors and injectedto Maxi Gala and Fuji Supremaplants.The plasmid DNA was systemically detected on treated plants and remained stable for at least8 months.The expression of theVfgene was quantified by RT-qPCR and several plants presented high levels of Vf2expression. These plants were challenged by spores of V. inaequalis and the majority of the treated plants displayed scab resistant phenotypes.The Vf2introgression based on plant plasmidswas shown to be effective on transferring genetic material sistemically to the apple cultivars tested. The plasmids weredetected on treated plants during the whole evaluated time of this study (8 months), and the resistance gene expression was detected on several individuals. Our study reinforces the applicability of such technique in woody perennial plants and givesthe possibility for fast introgression of other characteristics of interest dependent on genes with diverse biotechnological potential.

A macieira (Malus x domestica Borkh.), uma das frutíferas mais importantes das regiões de clima temperado, é caracterizada pela cessação de crescimento visível durante o inverno, processo este chamado de dormência. A dormência de gemas permite que a planta sobreviva às baixas temperaturas e é determinante para a eficiência na produção de maçãs. Entender o processo de dormência, assim como seus mecanismos de controle, tornou-se fundamental para contornar as perdas na produção, seja por meio de técnicas de manejo ou pela geração de variedades comerciais melhor adaptadas às regiões de cultivo. A enzima galactinol sintase (GolS) catalisa a primeira etapa da via de síntese de oligossacarídeos da família da rafinose, cujo acúmulo em resposta a estresses abióticos é fato bem conhecido. Em trabalho anterior, nosso grupo mostrou um acúmulo de transcritos constrastante de quatro genes MdGolS durante o inverno, sugerindo-se uma possível função adaptativa desses genes durante a dormência de gemas em macieira. Pelo presente trabalho, tem-se como objetivo quantificar o acúmulo de quatro proteínas MdGolS em gemas apicais da macieira Fuji Standard visando confirmar os perfis transcricionais previamente obtidos. Anticorpos policlonais capazes de reconhecer as quatro MdGolS foram separadamente produzidos para emprego na técnica de Western blot Análise por Dot blot permitiu-nos mostrar que os quatro conjuntos de anticorpos são específicos para o seu respectivo peptídeo, sem reações cruzadas. Cinco protocolos de extração de proteínas foram testados e otimizados para a obtenção de maiores quantidades de proteínas de gemas fechadas de macieira. Dois desses extratos foram escolhidos para realizar a técnica de Western blot. Proteínas totais foram quantificadas pelo método de Bradford e 20 μg foi considerada a quantidade mais adequada para os ensaios. O anticorpo MdGolS1 permitiu a detecção de sinais em ambos os extratos, mas nenhum no tamanho esperado para a respectiva proteína, isto é, com aproximadamente 38 kDa. Os anticorpos MdGolS2, MdGolS3 e MdGolS4 não permitiram detectar quaisquer sinais ou, ainda, sinais fracos que não puderam ser relacionados com o perfil transcricional previamente obtido. Estratégias alternativas, em nível proteico, para validar os níveis aumentados de transcritos de GolS anteriormente observados são discutidas. / Apple tree (Malus x domestica Borkh), one of the world’s most important fruit crops in temperate regions, is characterized by the cessation of visible growth during winter, a process called dormancy. Bud dormancy allows plant survival under low temperatures and it is crucial for the efficiency of apple production. The knowledge about the dormancy process, as well as its control mechanisms, became an essential approach to circumvent production losses either through management techniques or by the generation of new commercial varieties better adapted to each regional cultivation environment. The galactinol synthase (GolS) enzyme catalyzes the first step in the synthesis pathway of the raffinose family of oligosaccharides, whose accumulation in response to abiotic stress is well known. A previous work of our group allowed us to show contrasting transcript levels of four MdGolS during winter, suggesting a possible adaptative role for some of these genes during bud dormancy. The present work aims to quantify MdGolS protein accumulation in apical buds of the Fuji Standard apple tree cultivar in order to verify and associate with transcriptional profiles previously obtained. Polyclonal antibodies that recognize the four MdGolS produced to perform Western blot assays. Dot blot analysis revealed that the four sets of antibodies were specific to their respective peptides, without cross-reactions. Five protein extraction protocols were tested and optimized for obtaining greater amounts of proteins from apple apical buds. Two of these extracts were chosen to perform Western blot assays. Total protein was quantified using the Bradford method and 20 μg was found to be the most adequate for the assay. MdGolS1 antibody allowed the detection of signals in both extracts, but none in the expected protein mass, i.e., approximately 38 kDa. MdGolS2, MdGolS3 and MdGolS4 antibodies allowed us to detect only weak or no signals, that could not be correlated to the transcript profile previously obtained. Alternative strategies to validate the previously observed increased GolS transcript levels at the protein level are discussed.

A macieira (Malus x domestica Borkh.) é uma frutífera de clima temperado que possui grande importância econômica mundialmente, sendo sua produtividade intimamente relacionada à saída do processo de dormência hibernal. Este processo pode ser definido como a incapacidade da planta iniciar o crescimento meristemático mesmo sob condições favoráveis e os mecanismos de controle molecular da dormência em macieiras ainda são pouco compreendidos. O objetivo do presente trabalho foi investigar o perfil gênico diferencial entre cultivares de macieiras contrastantes para requerimento de frio. As cultivares selecionadas foram Gala e sua mutante espontânea Castel Gala, as quais apresentam alto e baixo requerimento de frio, respectivamente. A técnica de hibridização supressiva subtrativa (SSH) permitiu a identificação de 28 genes candidatos à regulação da dormência. Análises de RT-qPCR foram realizadas visando a validação da expressão diferencial dos genes selecionados, assim como caracterizá-los transcricionalmente em três cultivares distintas durante um ciclo de crescimento e de dormência. Dos 28 genes candidatos, 17 apresentaram o mesmo perfil diferencial identificado por SSH. Um acúmulo sazonal de transcritos durante o inverno foi identificado para alguns genes e as cultivares de maior requerimento de frio apresentaram acúmulo de transcritos por mais tempo. Este perfil permitiu-nos sugerir que estes genes podem estar atuando na regulação dos processos de dormência e de aclimatação ao frio. Dos 17 genes validados, aqueles codificadores de proteínas DAM, desidrinas, GAST1, LTI65, NAC, histonas variantes H2A.Z e RAP2.12 apresentaram os maiores contrastes transcricionais entre as cultivares analisadas durante o inverno e constituem-se como fortes candidatos a participantes do processo de progressão da dormência em macieiras. Finalmente, a família de genes codificadores de desidrinas de macieira teve seus membros identificados e caracterizados transcricionalmente. Análises in silico permitiram a identificação de oito modelos gênicos preditos de desidrinas no genoma de macieira. As cadeias peptídicas deduzidas foram classificadas conforme a presença dos segmentos conservados YnSKn. Um perfil sazonal de regulação da expressão foi identificado, com a presença de um pico de acúmulo de transcritos durante o inverno, o que sugere a presença de um mecanismo similar de regulação entre genes de desidrinas de macieira. / Apple tree (Malus x domestica Borkh.) is a temperate fruit crop of great economic importance worldwide and its productivity is related with the release from a bud dormancy process. This process is defined as the plant inability to initiate growth from meristems under favorable conditions and molecular information about dormancy control in apple trees is limited. The aim of the present work was to investigate the differential gene expression profiles between apple tree cultivars contrasting in chilling requirement for breaking dormancy. The selected apple cultivars were Gala and its derived bud sport Castel Gala, which displays high and low chilling requirement, respectively. A suppression subtractive hybridization (SSH) assay yielded 28 candidate genes putatively associated to dormancy cycling. RT-qPCR analyses were performed in order to validate the differential expression profiles and also to transcriptionally characterize the selected genes in three distinct apple tree cultivars during a growth to dormancy cycle. Among the 28 candidate genes, 17 confirmed the differential expression profile predicted by SSH. A seasonal transcript accumulation during the winter was identified to some genes, with high chilling requirement cultivars presenting higher levels of transcripts. This profile allowed us to suggest that these genes may be acting on dormancy regulation and cold acclimation. Out of the 17 candidate genes, those coding for DAM, dehydrins, GAST1, LTI65, NAC, histone variants H2A.Z and RAP2.12 displayed major differences in gene expression between cultivars through the winter and are strong candidates to play key roles on dormancy progression in apple trees. Finally, we identified and transcriptionally characterized the dehydrin gene family in apple trees. In silico analyses allowed us to identify eight predicted gene models for dehydrins in the apple genome. Deduced polypeptides were classified according to the presence of the conserved YnSKn segments. A seasonal regulation of gene expression was observed, with higher transcript accumulation during the winter. This data suggests that a similar mechanism of transcript regulation is acting through the apple dehydrin genes.

Ce mémoire fait une étude détaillée de la modélisation du nombre de réclamations en assurance automobile à l'aide des systèmes bonus-malus, méthode de tarification a posteriori utilisée par les actuaires pour déterminer la prime des assurés en fonction de leur expérience sinistre. Deux approches de calibration des systèmes bonus-malus sont proposées dans le cadre du mémoire. L'estimation des primes relatives d'un système bonus-malus selon l'approche classique passe par deux étapes distinctes : l'estimation des paramètres d'une distribution de l'hétérogénéité lors de la tarification a priori, et ensuite l'approximation de l'hétérogénéité par un système bonus-malus. Une nouvelle approche d'estimation d'un système bonus-malus en une seule étape est développée, en utilisant des outils statistiques. Cette approche statistique permet d'estimer les relativités bonus-malus directement à l'aide des modèles de régression en utilisant la méthode du maximum de vraisemblance. Des critères statistiques classiques permettent ainsi de sélectionner le meilleur système bonus-malus alors que des métriques moins précises devraient être utilisées lors d'une calibration classique. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Nombre de réclamations, Tarification a priori, Tarification a posteriori, Systèmes bonus-malus, Hétérogénéité, Modèles de régression, Maximum de vraisemblance.

In yhis work we will make two Bonus-Malus systems with the same transition rules, but with different a priori criteria (dependent from personal characteristics and from automobile charakteristics), will review components of a model, will analyze the stationarity of a mean premium and coefficient of variation, elasticity and optimization.

A macieira (Malus x domestica Borkh.) é uma frutífera de clima temperado que possui grande importância econômica mundialmente, sendo sua produtividade intimamente relacionada à saída do processo de dormência hibernal. Este processo pode ser definido como a incapacidade da planta iniciar o crescimento meristemático mesmo sob condições favoráveis e os mecanismos de controle molecular da dormência em macieiras ainda são pouco compreendidos. O objetivo do presente trabalho foi investigar o perfil gênico diferencial entre cultivares de macieiras contrastantes para requerimento de frio. As cultivares selecionadas foram Gala e sua mutante espontânea Castel Gala, as quais apresentam alto e baixo requerimento de frio, respectivamente. A técnica de hibridização supressiva subtrativa (SSH) permitiu a identificação de 28 genes candidatos à regulação da dormência. Análises de RT-qPCR foram realizadas visando a validação da expressão diferencial dos genes selecionados, assim como caracterizá-los transcricionalmente em três cultivares distintas durante um ciclo de crescimento e de dormência. Dos 28 genes candidatos, 17 apresentaram o mesmo perfil diferencial identificado por SSH. Um acúmulo sazonal de transcritos durante o inverno foi identificado para alguns genes e as cultivares de maior requerimento de frio apresentaram acúmulo de transcritos por mais tempo. Este perfil permitiu-nos sugerir que estes genes podem estar atuando na regulação dos processos de dormência e de aclimatação ao frio. Dos 17 genes validados, aqueles codificadores de proteínas DAM, desidrinas, GAST1, LTI65, NAC, histonas variantes H2A.Z e RAP2.12 apresentaram os maiores contrastes transcricionais entre as cultivares analisadas durante o inverno e constituem-se como fortes candidatos a participantes do processo de progressão da dormência em macieiras. Finalmente, a família de genes codificadores de desidrinas de macieira teve seus membros identificados e caracterizados transcricionalmente. Análises in silico permitiram a identificação de oito modelos gênicos preditos de desidrinas no genoma de macieira. As cadeias peptídicas deduzidas foram classificadas conforme a presença dos segmentos conservados YnSKn. Um perfil sazonal de regulação da expressão foi identificado, com a presença de um pico de acúmulo de transcritos durante o inverno, o que sugere a presença de um mecanismo similar de regulação entre genes de desidrinas de macieira. / Apple tree (Malus x domestica Borkh.) is a temperate fruit crop of great economic importance worldwide and its productivity is related with the release from a bud dormancy process. This process is defined as the plant inability to initiate growth from meristems under favorable conditions and molecular information about dormancy control in apple trees is limited. The aim of the present work was to investigate the differential gene expression profiles between apple tree cultivars contrasting in chilling requirement for breaking dormancy. The selected apple cultivars were Gala and its derived bud sport Castel Gala, which displays high and low chilling requirement, respectively. A suppression subtractive hybridization (SSH) assay yielded 28 candidate genes putatively associated to dormancy cycling. RT-qPCR analyses were performed in order to validate the differential expression profiles and also to transcriptionally characterize the selected genes in three distinct apple tree cultivars during a growth to dormancy cycle. Among the 28 candidate genes, 17 confirmed the differential expression profile predicted by SSH. A seasonal transcript accumulation during the winter was identified to some genes, with high chilling requirement cultivars presenting higher levels of transcripts. This profile allowed us to suggest that these genes may be acting on dormancy regulation and cold acclimation. Out of the 17 candidate genes, those coding for DAM, dehydrins, GAST1, LTI65, NAC, histone variants H2A.Z and RAP2.12 displayed major differences in gene expression between cultivars through the winter and are strong candidates to play key roles on dormancy progression in apple trees. Finally, we identified and transcriptionally characterized the dehydrin gene family in apple trees. In silico analyses allowed us to identify eight predicted gene models for dehydrins in the apple genome. Deduced polypeptides were classified according to the presence of the conserved YnSKn segments. A seasonal regulation of gene expression was observed, with higher transcript accumulation during the winter. This data suggests that a similar mechanism of transcript regulation is acting through the apple dehydrin genes.