La spectroscopie de réflectance diffuse dans le domaine du visible est une technique paradoxalement rarement utilisée pour identifier les matériaux des couches picturales des oeuvres d'art. Quand elle est malgré tout mise en oeuvre, l'identification de pigments à partir de ce type de mesures repose toujours sur la comparaison avec une base de données spectrophotométriques de pigments de référence. Au sein du Centre de Recherche et de Restauration des Musées de France, la base de données est composée des spectres de réflectance de pigments purs, secs et en poudre. Une couche picturale est au contraire constituée de pigments parfois mélangés et dispersés dans un liant. Ces deux caractéristiques des couches picturales ont permis de distinguer deux axes de recherche pour le travail de thèse. I. La caractérisation des mélanges de pigments La modélisation de Kubelka-Munk s'est avérée pertinente pour la gamme usuelle des couleurs utilisées dans les oeuvres d'art, et ce même dans le cas extrême des mélanges dans lesquels un des composants est nettement minoritaire. Il est à présent possible, pour un mélange binaire, de déterminer les composants du mélange dans la majorité des cas par traitement numérique des mesures spectrophotométriques. Une fois la nature des composants déterminée, il est de plus systématiquement possible d'en retrouver les proportions relatives. Les résultats obtenus sur les échantillons modèles ont pu être adaptés au cas d'une oeuvre d'art : la Vierge d'Annonciation attribuée à Giovanni di Paolo. Dans ce tableau italien du XVe siècle, la couleur du visage est réalisée à partir d'un mélange de blanc de plomb et de vermillon a tempera. Les proportions relatives calculées de ces deux pigments sont en accord avec ce qui est observable au microscope optique sur des prélèvements et mesurable ensuite par traitement des images. II. L'influence du liant Des échantillons de couches picturales ont été réalisés par un artiste selon une recette traditionnelle. La concentration de pigments et le nombre de couches de matière picturales varient selon les échantillons. Ces derniers ont été étudiés parallèlement en spectrophotométrie, en diffractométrie des rayons X et en microfluorimétrie X. Les résultats obtenus par ces méthodes d'analyse concordent. La méthode de Rietveld d'affinement des diffractogrammes permet notamment d'aboutir à des valeurs de concentration de pigment dans le liant tout à fait en accord avec les résultats obtenus par la modélisation de la propagation de la lumière dans les milieux absorbants et diffusants utilisée pour interpréter les mesures spectrophotométriques. L'aboutissement de ce travail de thèse devrait permettre aux scientifiques de la conservation, aux historiens d'art et aux restaurateurs d'envisager la spectrophotométrie comme une technique d'analyse qualitative et quantitative, sans prélèvement, sans contact et réalisable in situ, qui fournit la nature et les proportions des différents constituants de la matière picturale.