Acute megakaryoblastic leukemia (AMKL) was first described by Von Boros and Karangi in 1931, was a result of developments in ultrastructural cytochemistry and immunologic phenotyping acute myeloid leukemia (AML) of megakaryocytic lineage have been diagnosed increasingly. The French-American-British (FAB) Co-operative Group established the criteria for the diagnosis and added this category as a distinct subtype of AML (M7) in 1985. The main subtypes of AML in the infants are M4, M5, and M7. One 25-day-old infant was referred to the hospital for further examination of white blood cell. Hepatosplenomegaly and anemia were physically examined, and he was diagnosed to be an AMKL case. Abnormal karyotype 46,XY,t(1;1)(p13;p36) was observed in this patient. This study aims to identify the AMKL potentially related genes on the breakpoints of Homo sapiens autosomal (HSA) 1p13 and 1p36 in this case by candidate gene approaches. Data-mining of the AMKL potentially related genes on breakpoints of HSA1p13 and 1p36 through NCBI Map Viewer Database, OMIM Morbid Map, and OMIM Gene Map were performed. We identified three candidate genes on HSA1p13 and 15 candidate genes on HSA 1p36. RBM15-MKL1 fusion on t(1;22)(p13;q13) was reported to be AMKL genes by Ma et al., Mercher et al., and the Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer. We anticipated RBM15 is also a related gene on HSA1p13 in this AMKL case, and compared the Gene Ontology terms between MKL1 and these 15 candidate genes on HSA1p36. SKI becomes our first candidate gene on 1p36 in this case. To identify candidate genes locating at HSA1p13 and 1p36, including RBM15 and SKI were screened at both cDNA and genomic DNA levels. According to these results, RBM15 and SKI are more likely to be candidate genes. Thus RBM15 and SKI may be the novel AMKL genes in t(1;1)(p13;p36) AMKL patients.

Acute myeloid leukemia (AML) is a genetically heterogeneous disease and represents about 20% of pediatric leukemias. Survival rates vary depending on subtypes but are particularly unfavorable for acute megakaryoblastic leukemia (AMKL), a rare subtype of AML that usually affects children under 3 years old (≤ 30% survival for certain subtypes of AMKL). In pediatrics, genetic rearrangement leading to the expression of a chimeric fusion gene are present in many cases and are considered initiator events in the development of leukemia. In AMKL cases, more than 70% of them exhibit such rearrangement. Several of these chimeric transcripts, such as NUP98::KDM5A and CBFA2T3::GLIS2, occur in a higher proportion of cases. The analysis of the transcriptome from pediatric leukemic cases allowed us to identify new chimeric fusion transcripts in pediatric leukemias. Specifically, we discovered BPTF as a new fusion partner of NUP98 in the case of acute megakaryoblastic leukemia (AMKL), and the ACIN1::NUTM1 fusion in B-cell lymphoid leukemias. These studies have refined the molecular classification of these leukemias and provided tools for diagnosis and disease monitoring. The hypothesis of my thesis is that the NUP98::KDM5A and CBFA2T3::GLIS2 fusions are oncogenic and their expression in normal human hematopoietic and progenitor cells leads to transformation into acute megakaryoblastic leukemia in immunodeficient recipient mice, allowing for the generation of renewable xenograft models. My work has contributed to the generation of AMKL models with NUP98::KDM5A (N5A) and CBFA2T3::GLIS2 (CG2) fusions. To do this, we optimized a pipeline for transducing these chimeric genes in CD34+ cells isolated from cord blood, followed by transplantation into immunodeficient mice. These xenograft models phenocopy the leukemia of patients from a morphological, immunophenotypic, and transcriptomic standpoint. These synthetic AMKL models can be serially transplanted into mice and have a high frequency of leukemic stem cells. I also contributed to the development of a unique patient-derived xenograft (PDX) model derived from primary cells of a patient with an NUP98::BPTF genotype AMKL leukemia. These synthetic and PDX models then served as substrates for my experiments and those of several members of our laboratory. My research has allowed us to identify and characterize new biomarkers specific to NUP98- rearranged and CBFA2T3::GLIS2 positive AMKL. Taking advantage of the biomass generated by these AMKL leukemia models, we conducted transcriptomic and proteomic studies of the membrane surface. These results were compared to normal cells isolated from cord blood to identify several surface proteins specific to each leukemia genotype and shed light on new potential biomarkers. Furthermore, we confirmed the sensitivity of our AMKL models to JAK-STAT pathway inhibitors and performed synergy assays between JAK-STAT and the PI3K-AKT-mTOR pathway inhibitors. These experiments demonstrated the synergistic induction of apoptosis in our models upon the combine exposure to JAK-STAT and PI3K-AKT-mTOR pathway inhibitors. These works allowed us to identify potential therapeutic vulnerabilities of AMKL. Finally, since research on AMKL is affected by the limited number of patient samples, the human models and molecular data presented in this thesis constitute an invaluable resource to accelerate translational research for these high-risk leukemias. / La leucémie myéloïde aiguë (LMA) est une maladie hétérogène sur le plan génétique et représente environ 20% des leucémies pédiatriques. Les taux de survie varient selon les sous- types mais sont particulièrement défavorables pour les leucémies aiguës mégacaryoblastiques (AMKL), un sous-type rare de LMA touchant généralement les enfants de moins de 3 ans (≤ 30% de survie pour certains sous-types d’AMKL). En pédiatrie, les réarrangements génétiques entraînant l’expression d’un gène de fusion chimérique sont présentes dans un grand nombre de cas et sont considérées comme des événements initiateurs à l’origine de la leucémie. Chez les leucémies de type AMKL, c’est plus de 70% des cas qui présentent un tel réarrangement. Quelques-uns de ces transcrits chimériques, tels que NUP98::KDM5A et CBFA2T3::GLIS2, surviennent dans une plus grande proportion des cas. Dans le cadre de mes recherches, l’analyse du transcriptome de leucémies pédiatriques nous ont permis de mettre en évidence de nouveaux transcrits chimériques. Notamment, nous avons découvert BPTF comme étant un nouveau partenaire de fusion de NUP98 dans le cas d’une AMKL, ainsi que la fusion ACIN1::NUTM1 chez des leucémies lymphoïdes à cellules B. Ces travaux ont permis de raffiner la classification moléculaire de ces leucémies et propose de nouvelles approches pour le diagnostic et le suivi de la maladie. L’hypothèse de ma thèse est que les fusions NUP98::KDM5A et CBFA2T3::GLIS2 sont oncogéniques et leur expression chez des cellules souches hématopoïétiques et progénitrices humaines normales entraîne une transformation en leucémie aiguë mégacaryoblastique dans les souris receveuses immunodéficientes, permettant de générer des modèles de xénogreffe. Mes travaux ont contribué à la génération de modèles d’AMKL arborant les fusions NUP98::KDM5A ainsi que CBFA2T3::GLIS2. Pour ce faire, nous avons optimisé un processus de transduction de ces gènes chimériques chez des cellules CD34+ isolées de sang de cordon, suivi de transplantation chez la souris immunodéficiente. Ces modèles de xénogreffe récapitulent la leucémie des patients aux points de vue morphologique, immunophenotypique et transcriptomique. Ces modèles synthétiques d’AMKL peuvent être transplantés de manière sériée en souris et présentent une fréquence élevée de cellules souches leucémiques. De plus, nous avons aussi développé un modèle pdx unique (patient derived xenograft) dérivé des cellules primaires d’un patient atteint d’une leucémie AMKL présentant la fusions NUP98::BPTF. Ces modèles synthétiques et pdx ont ensuite servi de substrats à mes expériences ainsi que celles de plusieurs membres du laboratoire. Mes recherches ont permis d’identifier et de caractériser de nouveaux biomarqueurs spécifiques aux AMKL présentant un transcrit de NUP98 réarrangé et CBFA2T3::GLIS2. Tirant avantage de la biomasse générée par ces modèles de leucémie AMKL, nous avons fait des études transcriptomiques et protéomiques de la surface membranaire de nos modèles. Ces résultats furent comparés aux cellules normales isolées de sang de cordon afin d’identifier plusieurs protéines de surface spécifiques aux leucémies initiées par NUP98 réarrangé et CBFA2T3::GLIS2 afin de mettre en lumière de nouveaux biomarqueurs potentiels. De plus, nous avons aussi confirmé la sensibilité de nos modèles AMKL aux inhibiteurs de la voie JAK-STAT ainsi que démontré l’induction synergique de l’apoptose de nos modèles en présence des inhbitieurs combinés des voies JAK-STAT et PI3K-AKT-mTOR. Finalement, puisque la recherche sur les AMKL est ralentie par la quantité limitante d’échantillons de patient, les modèles humains et les données moléculaires présentés dans cette thèse constituent une ressource inestimable afin d’accélérer la recherche translationnelle pour ces leucémies à haut risque.

La leucémie aiguë mégacaryocytaire (LAM7) est un sous-type rare de leucémie myéloïde aiguë (LMA). Son incidence est plus élevée chez les nouveau-nés et les jeunes enfants de moins de trois ans et elle est associée à un taux de survie globale faible et à un risque accru de rechute. Des gènes de fusion oncogéniques, récurrents et mutuellement exclusifs, sont considérés comme étant des évènements transformants dans les LAM7 pédiatriques et ils sont détectés dans plus de 70% des cas, tels que CBFA2T3::GLIS2 (CG2), NUP98::KDM5A et les réarrangements de KMT2A. De nouvelles thérapies ciblées sont urgemment requises pour améliorer les résultats des traitements. Cependant, la recherche dans le domaine est retardée par la rareté des échantillons primaires de patient causée par la faible incidence de la maladie et la myélofibrose fréquente de la moelle osseuse qui rend les prélèvements difficiles chez les patients. Nous avons surmonté la limitante du nombre d’échantillons restreints pour la recherche en développant avec succès des modèles synthétiques de LAM7 pédiatriques exprimant les gènes de fusion oncogéniques pertinents. Nous avons utilisé des cellules souches et progénitrices hématopoiétiques humaines CD34+ isolées de sang de cordon, transduites avec des particules lentivirales codant pour la fusion CG2 et générant six modèles synthétiques distincts de xénogreffes en souris immunodéficientes. Ces modèles reproduisent fidèlement la maladie humaine en termes d’expression génique, d’immunophénotype, d’ontogénie et de vulnérabilités thérapeutiques. Ces derniers peuvent être maintenus en culture optimisée in vitro et transplantés de façon sériée dans les souris, procurant un substrat essentiel pour effectuer des cribles pharmacologiques à haut débit de grande envergure pour identifier de nouveaux composés thérapeutiques. Au cours de ce projet, j’ai piloté un crible pharmacologique de grande envergure avec près de 12,000 composés, incluant 2,000 molécules approuvées par la FDA, contribuant à démontrer que les échantillons LAM7 sont vulnérables à la perte de fonction génétique (knock-down) et à l’inhibition pharmacologique du facteur pro-survie BCL-XL par le BH3 mimétique navitoclax ou le dégradeur protéosomal DT2216. Par ailleurs, les échantillons LAM7 exprimant la fusion CG2 sont hautement sensibles aux inducteurs de l’apoptose classifiés comme les mimétiques de SMAC, tel que le LCL-161, une nouvelle piste inexplorée dans les LAM7. J’ai aussi étudié les rôles de facteurs pro-survie sélectionnés de la famille BCL2 dans les échantillons de LAM7 et LMA, révélant que la dépendance aux différentes protéines pro-survie est spécifique au génotype et au sous-type de LMA. Finalement, j’ai investigué le potentiel synergique de combinaisons de composés comme différents BH3 mimétiques ou des inhibiteurs de BCL-XL jumelés à de faibles doses de cytarabine. J’ai démontré que ces combinaisons étaient hautement efficaces et elles pourraient offrir de nouvelles alternatives pour le traitement des LMA pédiatriques de haute fatalité. En résumé, la génération de nouveau modèles humains de LAM7 de haute fatalité a fait progresser la recherche translationnelle et nous a permis de bénéficier d’une source inestimable d’échantillons pour réaliser des cribles pharmacologiques à grande échelle qui ont révélé de nouvelles vulnérabilités thérapeutiques pour développer des thérapies ciblées. / Acute megakaryoblastic leukemia (AMKL) is a rare subtype of acute myeloid leukemia (AML). It has the highest incidence in neonates and infants below three years of age and is associated with poor overall survival and high chance of relapse. Recurrent and mutually exclusive oncogenic fusions are considered to be the transforming event in pediatric AMKL and are detected in over 70% of cases, such as CBFA2T3::GLIS2 (CG2), NUP98::KDM5A and rearrangements of KMT2A. Novel and targeted therapies are urgently needed to improve treatment outcomes, however research in this field is hampered by the rarity of primary patient samples which is a result of the low disease incidence and common myelofibrosis in the bone marrow of patients that makes sample collection difficult. We overcame the limitation of restricted sample material for research by successfully engineering synthetic models of pediatric AMKL with the relevant oncogenic driver fusions. We used human CD34+ haematopoietic stem and progenitor cells collected from cord blood and transformed them with lentiviral particles carrying the CG2 fusion, thus generating six distinct synthetic models xenografted in immunodeficient mice that phenocopy the human disease in terms of gene expression, immunophenotype, ontogeny and therapeutic vulnerabilities. These models can be maintained in optimised in vitro cultures and serially transplant in mice, which provided us with essential material for conducting large scale high-throughput chemical screens to identify novel compounds for therapy. Moreover in this project, I conducted a large chemical screen with around 12,000 compounds, including 2,000 FDA-approved molecules, which highlighted that AMKL samples are vulnerable towards genetic knock-down and pharmacological inhibition of pro-survival factor BCL-XL by BH3 mimetic navitoclax or proteasomal degrader DT2216. In addition, AMKL samples with the CG2 fusion were highly susceptible to inducers of apoptosis classified as SMAC mimetics, namely LCL-161, a novel and yet unexplored finding in AMKL. I further investigated the role of selected pro-survival factors of the BCL2 family in samples of AMKL and AML and uncovered that the reliance on different pro-survival proteins is geno- and subtype-specific in AML. Furthermore, I investigated the potential of synergistic drug combinations with different BH3 mimetics or BCL-XL inhibition with low-dose cytarabine, and demonstrated that those combinations are highly effective and could provide novel options for the treatment of high-fatality pediatric AML. In summary, the generation of novel human models of high-fatality AMKL advanced translational research and provided us with invaluable sample material for large chemical screens that highlighted novel therapeutic vulnerabilities for targeted therapies.