La cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) es sin dudas, una técnica madura, ampliamente usada en laboratorios analíticos, especialmente en el modo de fase inversa. Existe, no obstante, una demanda creciente de métodos rápidos de separación y cuantificación de analitos mediante HPLC, especialmente en laboratorios que deben implementar rutinas de análisis. La disminución en los tiempos de análisis puede lograrse usando columnas más cortas y trabajando a altos caudales, a expensas de la capacidad resolutiva del sistema. Para mantener una capacidad de resolución dada se reduce el tamaño de las partículas de relleno, lo cual limita la longitud de la columna y la velocidad lineal que es posible usar para mantener una caída de presión soportable por un sistema de bomba típico de un equipo HPLC. Estas limitaciones han dado lugar a numerosas investigaciones que permitieron mejoras instrumentales y el desarrollo de nuevos materiales. Entre las mejoras instrumentales se destaca la aparición de una nueva generación de equipos que poseen bombas capaces de proveer fase móvil a caudales razonables y a presiones de más de 1000 atm. Estos instrumentos, que se conocen como U-HPLC o UPLC por “ultra-high pressure liquid chromatography” poseen un costo sumamente elevado, convirtiéndose en poco accesibles en muchos laboratorios. Los estudios y desarrollos de diferentes materiales han dado lugar a las columnas monolíticas en las que una sola pieza altamente porosa (monolito) de material silíceo o polimérico constituye la matriz de la fase estacionaria en reemplazo de las típicas partículas porosas empleadas para desarrollar fases estacionarias. La estructura de este monolito posee una porosidad superior al 80% (en comparación al 60-65% de porosidad total de las columnas basadas en partículas porosas), lo que implica mayores permeabilidades del lecho y, en consecuencia, que se pueda aumentar la velocidad de fase móvil sin que se produzcan grandes caídas de presión. Por otra parte, su estructura macroporosa permite el flujo convectivo de solvente, por lo que el transporte de material hasta la superficie estacionaria resulta más eficiente que el mecanismo difusivo, produciendo menores resistencias a la transferencia de material, esto es, la pérdida de eficiencia a altos caudales no es tan significativa. Otro tipo de material particulado recientemente desarrollado consiste en esferas de sílice compacta (no porosa) de menos de 2 micras cubiertas de una superficie porosa de un espesor de aproximadamente 0,5 micras. Las partículas poseen un diámetro total de algo más de 2,5 micrones. Este material constituye el relleno de la columna cromatográfica, teniendo la ventaja de que la resistencia que ejerce a la aplicación de caudales normales es mucho menor que la de partículas menores a 2 micras. Por otra parte, el hecho de que el intercambio entre las fases ocurra sólo en la “cáscara” porosa, disminuye sensiblemente la resistencia a la transferencia de materia, por lo que las eficiencias serían similares a las de partículas de tamaños inferiores a 2 micrones. Una estrategia diferente en relación con la posibilidad de reducir tiempos de análisis empleando instrumentos convencionales consiste en emplear partículas de sílice de diámetro reducido y simultáneamente aumentar la temperatura de la columna. La consecuencia hidrodinámica es una disminución en la viscosidad del eluyente, con la consecuente disminución en la caída de presión desarrollada, y el aumento en los coeficientes de difusión de los analitos, lo que implica mejoras en la transferencia de materia en fase móvil. Esta estrategia ha sido estudiada en relación con columnas rellenas con material particulado y también con columnas monolíticas a base de sílice. Un objetivo de este trabajo ha sido el de avanzar hacia el desarrollo de metodologías cromatográficas que tiendan a la miniaturización, esto es, métodos de cromatografía de líquidos en los que se reduzcan significativamente los volúmenes de solventes y de muestra a inyectar, y al aumento de la velocidad de análisis, esto es, a reducir tiempos de análisis por muestra, pero empleando instrumentos de cromatografía convencionales con mínimas modificaciones. Entendemos que la disponibilidad de instrumentos de UPLC para lograr estos objetivos no es frecuente en la mayoría de los laboratorios, por lo que es nuestro interés la búsqueda de alternativas más accesibles al desarrollo de métodos rápidos y en escala de micro-LC. En relación con la aplicación de estas metodologías a muestras reales se estudió la separación y análisis de aminoácidos derivatizados con cloruro de FMOC (cloroformiato de 9-fluorenilmetilo), con el fin de tener un método robusto y de bajo costo de análisis de los aminoácidos citrulina, arginina, prolina, glutamina, ácido glutámico y ornitina en fluido plasmático. La posible transferencia del método a laboratorios de rutina implica que los métodos a desarrollar sean robustos y generales, esto es, que el derivado pueda detectarse por uv-visible y por fluorescencia, que el proceso pueda automatizarse, y que se empleen reactivos fácilmente manipulables. Importancia de medir la concentración de citrulina en plasma. En el intestino delgado se produce la absorción de nutrientes y las transformaciones metabólicas en las que el epitelio intestinal cumple un papel fundamental. Entre ellas ocurre la transformación de glutamina en citrulina, la cual es adsorbida hacia el plasma. Los niveles de citrulina circulantes dependen principalmente de la capacidad del intestino en producirla a partir de sus precursores, por lo que se ha propuesto emplear a esta sustancia como un indicador de la funcionalidad enterocitaria. Distintas condiciones que alteren la fisiología de la mucosa intestinal serían potencialmente reflejadas en alteraciones en los niveles de citrulina plasmática. Se ha propuesto en la literatura evaluar los niveles de citrulina plasmática como marcador específico de disfunción intestinal (al igual que se usa creatinina como marcador de disfunción renal o las enzimas TGO/TGP para anomalías a nivel hepático). Sin embargo, hasta el momento no existe acuerdo al respecto dado los resultados informados del dosaje de citrulina en distintas patologías en las que se compromete el tejido intestinal. La determinación de citrulina en plasma desproteinizado se puede realizar por CEC, CE, mediante HPLC, empleando columnas de fase inversa y derivatización pre- o post-columna del grupo amino para su detección. Muchos de estos métodos, poseen procedimientos experimentales complejos. Como reactivos derivatizantes se pueden emplear diversos compuestos, siendo el o-ftaldehído en combinación con 2-mercaptoetanol el descripto con mayor frecuencia. Si bien esta reacción de derivatización es rápida, los derivados formados no son estables, lo que convierte al método en poco robusto. En este trabajo se propuso estudiar la derivatización con FMOC-Cl. El uso de este agente derivatizante permite llevar a cabo reacciones rápidas de condensación con el grupo amino para dar el correspondiente carbamato, a temperatura ambiente; y los derivados obtenidos son estables. Por fluorescencia pueden detectarse niveles de analito de fmol y también, aunque con mayores límites de detección, pueden cuantificarse por absorción UV.

A otimização e padronização de métodos moleculares são fundamentais para evitar distorções nos resultados causadas por processamento de ácidos nucleicos da abundância relativa de micro-organismos de uma amostra. Nos estudos sobre identificação microbiana, a etapa de validação é, na maioria dos casos, negligenciada. As principais etapas em que podem ocorrer vieses capazes de alterar a informação sobre a composição da comunidade microbiana são a extração e a RT-PCR. O rRNA é a molécula ideal para identificar os micro-organismos metabolicamente ativos por estar em maior quantidade dentro da célula. A inexistência de um protocolo de extração de RNA gold standard e de kits comerciais específicos para cada tipo de amostra ambiental pode comprometer as etapas posteriores à extração. O protocolo de extração de RNA adaptado neste trabalho mostrou alta eficácia na lise celular e na remoção de contaminantes co-extraidos, garantindo a integridade e a qualidade do rRNA extraído de amostras contendo altas concentrações de contaminantes. Devido as diferentes características químicas das amostras ambientais, o uso deste protocolo adaptado pode preservar a informação sobre os indivíduos metabolicamente ativos de uma comunidade microbiana. Foram utilizados consórcios artificiais na validação da etapa de PCR. O efeito sinérgico do uso de aditivos, da Taq polimerase de alto rendimento, do programa de sub-ciclagem e da limitação do programa de amplificação em 10 ciclos, mantiveram a proporção dos moldes dos consórcios analisados próximo ao esperado. Após a padronização da técnica de ARDRA, foi definido que há necessidade de entre 500 e 550 UFC para uma cobertura completa da diversidade de lodo ativado. O uso de enzimas combinadas MspI/HaeIII e HhaI/RsaI em uma mesma reação double digest proporcionou a separação dos clones de lodo ativado utilizando menos etapas de ARDRA. E o critério de corte em 3% do total agrupamentos, possibilitou selecionar os perfis mais representativos sem a perda de grupos importantes para a análise das bibliotecas. Foi concluído que, o uso de um protocolo inadequado de extração de RNA de amostras complexas pode gerar extratos contendo contaminantes co-extraidos que interferem na atividade da Taq polimerase e nas enzimas de restrição. Após o sequenciamento de nova geração, foi observado que o uso de diferentes iniciadores de PCR e do pré-processamento manual para os dados obtidos, foram essenciais para ampliar a cobertura observada para a amostra de lodo e melhorar a resolução dos resultados e a profundidade de identificação taxonômica, respectivamente. / The optimization and standardization of molecular methods are fundamental to avoid distortions in the results caused by nucleic acid processing of the relative abundance of microorganisms in a sample. In the studies on microbial identification, the validation step is, in most cases, neglected. The main steps in which biases capable of altering the composition of the microbial community can occur are extraction and RT-PCR. The rRNA is the ideal molecule to identify metabolically active microorganisms because they are in the greatest amount within the cell. The lack of a gold standard RNA extraction protocol and specific commercial kits for each type of environmental sample may compromise the post-extraction steps. The RNA extraction protocol adapted in this work showed high efficacy in cell lysis and in the removal of co-extracted contaminants, guaranteeing the integrity and quality of the rRNA extracted from samples containing high concentrations of contaminants. Due to the different chemical characteristics of the environmental samples, the use of this adapted protocol can preserve the information about the metabolically active individuals of a microbial community. Artificial consortia were used to validate the PCR step. The synergistic effect of the use of additives, the high yield Taq polymerase, the sub-cycling program and the limitation of the amplification program in 10 cycles, kept the proportion of the molds of the consortia analyzed close to the expected. After standardization of the ARDRA technique, it was defined that there is a need for between 500 and 550 CFU for a complete coverage of the diversity of activated sludge. The use of MspI / HaeIII and HhaI / RsaI combined enzymes in the same double digest reaction provided the separation of activated sludge clones using fewer ARDRA steps. And the criterion of cut in 3% of the total groupings, allowed to select the most representative profiles without the loss of important groups for the analysis of the libraries. It was concluded that the use of an inadequate RNA extraction protocol from complex samples can generate extracts containing co-extracted contaminants that interfere with Taq polymerase activity and restriction enzymes. After the sequencing of the new generation, it was observed that the use of different PCR primers and manual preprocessing for the obtained data were essential to increase the coverage observed for the sludge sample and to improve the resolution of the results and the depth of taxonomic identification, respectively.