Regulación de las metalotioneínas durante el estrés y la inflamación, y su influencia durante la respuesta inflamatoria.Las metalotioneínas (MTs) son unas proteínas de bajo peso molecular (6-7 kDa) con capacidad para ligar metales pesados como el Zn y el Cu. En los roedores existen cuatro isoformas diferentes denominadas MT-I, -II, -III y IV. Las MT-I y MT-II se expresan prácticamente en todos los tejidos del organismo y son inducibles por metales pesados, agentes oxidantes, hormonas, la inflamación y el estrés. Por el contrario, la MT-III y la MT-IV tienen una distribución mucho más restringida, localizándose fundamentalmente en el sistema nervioso central (SNC) y el epitelio escamoso estratificado respectivamente y no responden a ninguno de los tratamientos que afectan a las MT-I+II. No se conocen con certeza las funciones de las MTs, aunque se supone que intervienen en la homeostasis del Zn y del Cu y en la detoxificación de los mismos cuando alcanzan concentraciones elevadas. Además se acepta que son antioxidantes celulares ya que tienen gran afinidad por el radical hidroxilo. Recientemente, el descubrimiento de la MT-III ha abierto nuevas perspectivas acerca de las funciones de las MTs. Inicialmente la MT-III fue descrita como un factor inhibidor del crecimiento neuronal (GIF) potencialmente implicado en la patología de la enfermedad de Alzheimer. Este descubrimiento desencadenó multitud de estudios sobre las MTs cerebrales, observándose que tanto la MT-III como las MT-I+II se inducen durante enfermedades del SNC y diversos modelos de lesión. Se ha especulado que las MTs podrían participar en la patogenia y/o protección durante enfermedades neurodegenerativas o lesiones. No obstante, no existe confirmación experimental acerca de este punto y es escaso el conocimiento de temas como la regulación de las MTs cerebrales que son de vital importancia para entender las funciones de estas proteínas. El objetivo de esta tesis ha sido el estudio de la regulación de las MTs cerebrales y hepáticas, especialmente durante situaciones de inflamación, y de las posibles funciones de estas proteínas en el SNC.Como se ha comentado, la inflamación es una de las principales situaciones fisiológicas en las que se induce la síntesis de las MTs. Las citoquinas son los principales mediadores celulares durante la inflamación y previamente se había observado que algunos de estos agentes, como la IL-6 y el TNF-a, son capaces de modular la expresión de las MTs. Hemos estudiado el papel que estas dos citoquinas juegan en la regulación de las MTs cerebrales y hepáticas en situaciones de inflamación y de estrés. Para ello hemos utilizado animales que expresan de manera sostenida estas citoquinas en el SNC y animales Knockout (KO) para las mismas. La expresión crónica de la IL-6 en el SNC provoca inducción de la expresión de MT-I+II y MT-III en aquellas áreas en las que se detecta un incremento de las concentraciones de IL-6, sugiriendo que esta citoquina es un regulador fisiológico de las MTs cerebrales. De hecho los resultados obtenidos en los animales KO indican que la IL-6 participaría en la inducción de las MT-I+II cerebrales durante la inflamación, aunque no durante el estrés. A nivel hepático hemos observado que la IL-6 es un factor fundamental en el control de las MTs de este órgano durante la inflamación, actuando posiblemente a través del factor de transcripción Stat3. Al contrario que en el cerebro, la IL-6 si que interviene en la inducción de las MTs hepáticas durante el estrés, aunque solamente afecta durante las 4 primeras horas, posteriormente otros factores regulan la expresión de estas proteínas. Al igual que ocurre con la IL-6, la expresión sostenida del TNF-a en el SNC causa un incremento en la expresión de las MTs cerebrales y parece intervenir en el control de las MT-I+II durante la inflamación. Por consiguiente tanto la IL-6 como el TNF-a son elementos clave en la regulación de las MT-I+II.Teniendo en cuenta estos resultados nos propusimos estudiar el posible papel que las MT-I+II pudiesen jugar en situaciones de lesión cerebral en las cuales se produce inflamación y por tanto es posible que estas proteínas tengan cierta relevancia. En concreto escogimos dos modelos, la criolesión y la provocación de convulsiones mediante la administración intraperitoneal de ácido kaínico (KA). Como era de esperar las MT-I+II se inducen notablemente en las zonas lesionadas, por el contrario la MT-III no se ve afectada o incrementa ligeramente su expresión. La IL-6 parece ser un factor clave en el control de la respuesta de las MT-I+II, al menos durante la criolesión. Además el Zn también está implicado en esta respuesta, ya que la deficiencia de este metal disminuye la inducción de las MT-I+II durante la criolesión. Las discrepancias en la regulación de las MT-I+II y la MT-III sugieren que estas isoformas tienen funciones diferentes, al menos en este contexto. Teniendo en cuenta los resultados anteriores, parece probable que las MT-I+II, y no la MT-III, tengan un papel relevante durante una lesión. Para estudiar la contribución de las MT-I+II en situaciones de lesión hemos valorado la respuesta a lesiones cerebrales en animales con deficiencia de MT-I+II (inducida por un déficit nutricional de Zn o en animales KO para las mismas). La deficiencia de MT-I+II provoca una mayor susceptibilidad a las lesiones, observándose en los animales KO respecto a los controles un mayor tiempo de cicatrización y más convulsiones tras la criolesión y la administración de KA respectivamente. A nivel histopatológico la deficiencia de MT-I+II provoca una alteración en la respuesta glial a la lesión (mayor astrocitosis y menor microgliosis) que va acompañada de un incremento de la muerte celular por apoptosis y un mayor estrés oxidativo. Otro efecto importante es un incremento de la concentración de Zn libre tras la lesión en los animales deficientes para las MT-I+II. Estos resultados sugieren que las MT-I+II podrían jugar un papel destacado en la defensa frente al daño tisular, probablemente gracias a su acción como antioxidantes celulares y su capacidad para ligar metales. / Regulation of metalothionein during stress and inflammation and its role in the inflammatory responseMetalothioneins (MTs) are a family of low molecular weight (6-7 kDa) heavy metal-binding proteins. In rodents, there are four isoforms, namely MT-I, -II, -III and -IV. MT-I and MT-II are expressed in virtually all tissues and are induced by heavy metals, oxidants, hormones, inflammation and stress. Instead, MT-III and MT-IV are localized mainly in the central nervous system (CNS) and stratified squamous epithelia respectively and are not affected by the treatments stated above. The functions of MTs are unknowns, although has been proposed that MT-I+II participates in the Zn and Cu homeostasis and in the detoxification of heavy metal when they raise elevated concentrations. Moreover, is commonly accepted that MT-I+II are cellular antioxidants, because they bind with high affinity some free radicals, in particular the hydroxyl radical. Recently, the discovery of MT-III has open new perspectives about the functions of MTs. Initially, MT-II was supposed to be a neuronal growth inhibitory factor (GIF) potentially implicated in the pathology of Alzheimer disease. This discovery was followed by a myriad of papers about brain MTs, describing alterations in the expression of MT-III and also MT-I+II during neurodegenerative diseases and different brain lesion models. It has speculated that MTs could participate in the pathogenia and/or protection of the tissue during neurodegenerative diseases and lesions. However, there are not experimental confirmations about the role stated above, and the knowledge about important themes for understands the possible roles of brain MTs, as the regulation of these proteins, is scarce. The objectives of the present thesis have been the study of the regulation of brain and liver MTs, especially during the inflammation, and the study of the possible roles of these proteins in the CNS.As stated above, the inflammation is an important inducer of the MTs synthesis. The cytokines are the main cellular regulators during inflammation and previously has been observed that some of these agents, e.g. IL-6 and TNF-a, are capable of modulate the expression of MT-I+II. We have evaluated the role of IL-6 and TNF-a in the regulation of brain and liver MTs during inflammation and stress. To raise this objective we have used animals that shown continuous expression of IL-6 and TNF-a in the CNS and animals Knockout (KO) for these two cytokines. The chronic expression of IL-6 in the CNS causes induction of the expression of MT-I+II and MT-II in the areas in which de concentration if IL-6 is continuously high. These results suggest that IL-6 is a physiologic inducer of the synthesis of brain MTs. In the other hand, KO mice for IL-6 shown less induction of brain MT-I+II in response to inflammation. However the levels of brain MT-I+II during stress where not affected by Il-6 deficiency. In the liver we have observed that IL-6 is a major factor in the regulation of MTs during inflammation. Probably, the action of IL-6 under MT-I+II expression is canalized by activating the transcription factor Stat3. Also, IL-6 affects the expression of liver MTs during stress but only in the initial response, since then other factors regulate the expression of MTs. Like IL-6, TNF-a _has a potent effect on brain MT-I+II expression when the levels of this cytokines are keeping continuously elevated. TNF-a seems to be an important factor controlling the expression of cerebral MT-I+II during inflammation but not during stress. Taken together, these results suggest that IL-6 and TNF-a _are essential factors in the regulation of MT-I+II.Then we studied the possible roles of MT-I+II during brain lesions in which inflammation is present and then is possible that MTs could play important roles. We chose two lesion models, the criolesion and convulsions caused by the intraperitoneal administration of kainic acid (KA). As expected, MT-I+II are greatly induced in the lesioned areas, instead MT-III remain unaffected by the treatments. The IL-6 is a major factor implicated in the control of the response of MT-I+II almost during the criolesion. Other factors are implicated in the control of MT-I+II, and Zn is one of them because Zn deficiency attenuates de induction of MT-I+II during criolesion. The differences observed in the regulation of MT-I+II and MT-III during lesions suggests that these isosforms have differentiated functions almost in the lesion context. In the view of these results seems probably that MT-I+II but not MT-III plays an important role during lesions. We have undertaken experiments to evaluate the contribution of MT-I+II in the brain response to lesions. We have used to this purpose animals with MT-I+II deficiency induced by nutritional Zn deficiency and MT-I+II-KO mice, in which we have evaluated the response to brain lesions. The Mt-I+II deficiency cause a increased susceptibility to lesion, in concrete the healing time is grater in MT-I+II mice than controls and the numbers of convulsions after KA treatment is bigger in MT-I+II KO than in control mice. At the histopathological level, the deficiency of MT-I+II cause an alteration in the glial response (increased astrocitosis and reduced microgliosis) accompanied by an increment in the number of cells that undergo apoptosis and an increases in the oxidative stress. Other important effect is the increment in the level of free Zn detected in the MT-I+II deficient animals compared with controls. These results suggest that MT-I+II may play an important role in the response against tissular injuries, probably acting as antioxidant proteins and/or quelating the excess of heavy metals.