Orientadora: Eliana Gertrudes Macedo Lemos / Banca: Ely Nahas / Banca: Maria José Valarini / Resumo: Os métodos tradicionais de isolamento e cultivo para análise da diversidade microbiana do meio ambiente são limitados, pois poucos microrganismos são cultiváveis. Grandes avanços na ecologia microbiana molecular ocorreram através da construção de bibliotecas metagenômicas, fornecendo análises dos microrganismos não-cultiváveis. O solo, que é o mais importante habitat para os microrganismos, principalmente procariotos, sofre contínuas alterações. Devido à prática agrícola intensiva, parte da diversidade de microrganismos do solo pode ser alterada, antes de se tornar conhecida. Este trabalho teve por objetivo estimar a diversidade das comunidades bacterianas pela extração direta de DNA do solo em duas áreas (área de agricultura intensiva e área de floresta nativa) no município de Guaíra-SP, ilustrando o impacto da agricultura na microbiota. Utilizando oligonucleotídeos iniciadores específicos e seqüenciamento parcial do gene 16S rDNA, fragmentos dos produtos de PCR (~1.5kb) foram clonados em vetor pGEMR-T e transformados em Escherichia coli, linhagem DH5a. Para cada biblioteca foram coletados e seqüenciados 240 clones. As seqüências obtidas foram submetidas à análise de similaridade com seqüências depositadas no banco de dados GenBank. As análises revelaram extensiva diversidade em ambos os solos, assim como características distintas das comunidades bacterianas, sendo que a área sob floresta apresentou maior diversidade em relação à área sob agricultura intensiva. Os resultados obtidos demonstram que as práticas agrícolas promoveram aumento quantitativo das comunidades bacterianas pertencentes aos filos Proteobacteria e Firmicutes, ao passo que causaram uma diminuição nas comunidades pertencentes aos filos Acidobacteria e Verrucomicrobia, corroborando estudos anteriores. / Abstract: Traditional methods of isolation and cultivation to analyze the microbial diversity of environment are very limited, because few microorganisms are cultivable. Advances in molecular microbial ecology has occurred through the construction of metagenomic libraries, providing analysis of uncultured microorganisms. The soil, which is the most important habitat to microorganisms, principally prokaryotes, suffers continuous alteration. Due to intensive agricultural practices, part of the diversity of the soil microbial diversity could be reduced, even before being known. The aim of this work was to assess the diversity of bacterial community, through direct extraction of DNA of microorganisms from two conditions soil, (intensive agriculture and native forest) Guaíra- SP, to show the impact of agriculture in bacterial community. Using specific primers and partial sequencing of 16S rDNA gene, fragments from PCR (~1.5kb) were cloned in a vector pGEMR-T and transformed into Escherichia coli, strain DH5a. To each library 240 clones were collected and sequenced. The sequences obtained were compared against the GenBank database. The analysis showed extensive diversity in both soils, as well as distinct characteristics of bacterial community. Also, the forest field showed greater diversity than the intensive agriculture. The results obtained showed that agricultural practices promote quantitative grow of bacterial community that inhere the phyla Proteobacteria and Firmicutes, as well as generate one diminution in communities inhere the phyla Acidobacteria and Verrucomicrobia, as previously reported. / Mestre

Submitted by Aureo Evangelista Santana Junior null (santanaaureo2@gmail.com) on 2018-11-13T12:24:24Z No. of bitstreams: 1 tese aureo repositorio.pdf: 2007737 bytes, checksum: 2abcca8b951f16655e8cbc4a7ab624bb (MD5) / Rejected by Neli Silvia Pereira null (nelisps@fcav.unesp.br), reason: Solicitamos que realize correções na submissão seguindo as orientações abaixo: 1- O agradecimento à CAPES deve ter a seguinte redação: O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 Agradecemos a compreensão. on 2018-11-14T15:53:30Z (GMT) / Submitted by Aureo Evangelista Santana Junior null (santanaaureo2@gmail.com) on 2018-11-19T22:01:42Z No. of bitstreams: 1 tese aureo repositorio.pdf: 2007800 bytes, checksum: d9f18214f4ad0fe7bf0633aa89df7418 (MD5) / Approved for entry into archive by Neli Silvia Pereira null (nelisps@fcav.unesp.br) on 2018-11-20T13:26:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 santana_junior_ae_dr_jabo.pdf: 2007800 bytes, checksum: d9f18214f4ad0fe7bf0633aa89df7418 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-20T13:26:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 santana_junior_ae_dr_jabo.pdf: 2007800 bytes, checksum: d9f18214f4ad0fe7bf0633aa89df7418 (MD5) Previous issue date: 2018-08-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A importância da recuperação de recursos da vinhaça de cana-de-açúcar para fins de produção de energia associado à sua destinação adequada é uma política pública atual para o setor sucroenergético. Os reatores anaeróbios horizontais de leito fixo (RAHLF) têm vantagens construtivas, econômicas, operacionais e de desempenho no tratamento de efluentes complexos, mas ainda não foram estudados com a vinhaça. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar quatro RAHLF, em série (R1, R2, R3 e R4) no tratamento da vinhaça, com carga orgânica volumétrica (COV) 5 até 45 g DQOtotal (L d)-1 no R1 e com o uso da recirculação do efluente do R4. Com os RAHLF em série ocorreu estabilidade e, após a primeira entressafra, a retomada do sistema de tratamento, com aumento gradual da COV até valores elevados, foi bem sucedida. A partida do sistema com COV elevada, na segunda entressafra, provocou acidificação dos reatores e com a manutenção da recirculação do efluente a alcalinidade e o pH foram novamente apropriados para a digestão anaeróbia, o sistema foi recuperado e alcançou estabilidade. As maiores remoções de DQOtotal e produções de metano ocorreram no R1 e R2; no entanto, o R3 e R4 contribuíram para melhorar a estabilidade do sistema e atingir eficiência (60%) e conversão (0,24 L CH4 (g DQO removida)-1) mais altas sob COV elevada. As produções volumétricas de metano aumentaram com a COV e foram máximas com 20,0 g DQOtotal (L d)-1 no R1, alcançando valor de 1,07 L CH4 (L d)-1 no sistema e biogás com 60 a 80% de CH4. Nestas condições verificaram-se concentrações similares de micro-organismos dos domínios Bacteria e Archaea (108 a 109 cópias do gene 16S rDNA/g SV) indicando situação favorável para o processo anaeróbio. Predominaram arquéias metanogências acetotróficas e mixotróficas da ordem Methanosarcinales (107 a 109 cópias do gene 16S rDNA/g SV) seguidas das hidrogenotróficas da ordem Methanomicrobiales (104 a 107 cópias do gene 16S rDNA/g SV) demonstrando que a produção de metano ocorreu por ambas as vias. Para realizar a metanogênese acetotrófica, as maiores concentrações de arquéias, no R1, R2 e R4, foram da família Methanosaetaceae (107 cópias do gene 16S rDNA/g SV). / The recovery importance of sugarcane vinasse resources for energy production associated with the proper destination is a current public policy for the sucroenergetic sector. Horizontal anaerobic reactors with fixed bed (HARFB) have constructive, economic, operational and performance advantages in the complex effluents treatment, but have not yet been studied with vinasse. Thus, the aim of this work was to evaluate the performance of four HARFB in series (R1, R2, R3 and R4) in the vinasse treatment, with organic loading rate (OLR) gradual increase 5 up to 45 gtotal COD (L d)-1 in R1 and effluent recirculation after R4 output. The HARFB in series showed stability and the resumption of the treatment system after first stopping offseason was successful with a gradual increase of OLR to high values. The restart of the system with high OLR, after second offseason stoping, caused acidification of the reactors and, with the effluent recirculation maintenance, alkalinity and pH were again appropriate for anaerobic digestion and the stability was recovered. The highest COD removals and methane productions occurred in R1 and R2; however, R3 and R4 contributed to improve system stability and achieve efficiency (60%) and conversion (0.24 L CH4 (g COD removed)-1) highest under high OLR. The volumetric methane production increased with OLR, reaching a value of 1.07 L CH4 (L d) -1 in the system and biogas with 60 to 80% of CH4, under highest OLR of 20.0 g DQOtotal (L d) -1 in R1. Under these conditions, similar concentrations of microorganisms of the Bacteria and Archaea domains (108 to 109 copies of the 16S rDNA / g VS gene) were found, which indicates a favorable situation for the anaerobic process. The methanogenic acetotrophic and mixotrophic archaeas were predominate - order Methanosarcinales (107 to 109 16S rDNA gene copies / g VS), followed by the hydrogenotrophic - order Methanomicrobiales (104 to 107 16S rDNA gene copies / g VS), demonstrating that the methane production occurred in both pathways. In order to perform acetotrophic methanogenesis, the highest concentrations of archaeas in R1, R2 and R4 were from the Methanosaetaceae family (107 16S rDNA gene copies / g VS).

Orientador: Roberto Alves de Oliveira / Resumo: A importância da recuperação de recursos da vinhaça de cana-de-açúcar para fins de produção de energia associado à sua destinação adequada é uma política pública atual para o setor sucroenergético. Os reatores anaeróbios horizontais de leito fixo (RAHLF) têm vantagens construtivas, econômicas, operacionais e de desempenho no tratamento de efluentes complexos, mas ainda não foram estudados com a vinhaça. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar quatro RAHLF, em série (R1, R2, R3 e R4) no tratamento da vinhaça, com carga orgânica volumétrica (COV) 5 até 45 g DQOtotal (L d)-1 no R1 e com o uso da recirculação do efluente do R4. Com os RAHLF em série ocorreu estabilidade e, após a primeira entressafra, a retomada do sistema de tratamento, com aumento gradual da COV até valores elevados, foi bem sucedida. A partida do sistema com COV elevada, na segunda entressafra, provocou acidificação dos reatores e com a manutenção da recirculação do efluente a alcalinidade e o pH foram novamente apropriados para a digestão anaeróbia, o sistema foi recuperado e alcançou estabilidade. As maiores remoções de DQOtotal e produções de metano ocorreram no R1 e R2; no entanto, o R3 e R4 contribuíram para melhorar a estabilidade do sistema e atingir eficiência (60%) e conversão (0,24 L CH4 (g DQO removida)-1) mais altas sob COV elevada. As produções volumétricas de metano aumentaram com a COV e foram máximas com 20,0 g DQOtotal (L d)-1 no R1, alcançando valor de 1,07 L CH4 (L d)-1 no sistema e bio... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

In Brazil, with the continued expansion of agriculture for supplying demands from international markets, progressive increases in emissions of green house gases are expected. The purpose of the project was hypothesized with three major approaches, 1) Strategies to mitigate methane emission in small ruminant production systems; 2) Identify tropical plants and individual bioactive compound against methanogenic propertie and 3) In vivo evaluation of the nutrients metabolism of Santa Ines sheep fed with tropical plants. For this, we have performed three experiments. The first study (Expt. 1) was designed to determine the in vitro effects of three tropical tannin rich plants such as Leucaena leucocephala (LL), Mimosa caesalpineafolia (MC), Schinus molle (SM) and one non-tannin rich plant Medicavo sativa (MS) for their anti-methanogenic properties when used with and without polyethylene glycol (PEG). All plants had significantly (P<0.05) influenced the degraded organic matter (TDOM) and degraded neutral detergent fiber (DNDF), especially LL, which had most influence on these parameters compared to other tannin containing plants. LL had positive response on antimethanogenic effects; its nutrient degradability was higher than that of other tannin containing plants. The second study (Expt. 2) was set to evaluate the effect of different organic extracts from the whole plant methanolic extract (MHE) of LL on in vitro gas production and to characterize the chemical constituents by using gas chromatography coupled with mass spectroscopy (GC-MS). Major abundant compounds present at the relative percentages of MHE were found to be stigmasterol trimethyl ester (TMS), neophytadiene, palmitic acid TMS, ?-Linolenic acid TMS and 2, 3, 5, 6-Tetra-M-Anisylbenzene. The effects of additions of different extracts in terms of nutrient degradability (TDOM and DNDF) were increased by all extracts. This study explained that the hexane extract from whole plant MHE was effective against methanogenic activity. The objective of the third study (Expt. 3) was to study the effect of LL plant leaves on rumen fermentation, apparent nutrient digestibility, nitrogen balance and methane production in Santa Ines sheep. The animals were divided in three groups in which they were fed with (i) 88% Tifton 85-hay (Cynodon dactylon) and 12% soyabean meal (Control group, n=4); (ii) 28% Tifton 85-hay (Cynodon dactylon) and 72% LL plus 20 ml solution containing 10g/day/animal of PEG (With PEG group - WPEG, n=6); (iii) 28% Tifton 85-hay (Cynodon dactylon) and 72% LL plus 20 ml of distilled water (Without PEG group- WOPEG, n=6). Nutrient intake (dry matter, organic matter, acid detergent fiber, lignin and crude protein) were higher in WPEG and WOPEG compared to the control group, except neutral detergent fiber intake. Apparent digestibilities and nitrogen metabolism had non-significant effects between the treatments. However, CH4 emissions were significantly lower in WPEG and WOPEG than the control. Furthermore, expressions of microbial populations of methanogens in WPEG had lower tendency than that of WOPEG and control. The most salient findings of this study were that, using plant rich in tannin in diets of small ruminants, we can get more benefits in terms of replacing the source of protein in the diet (food safety) and reduced production of enteric CH4 (animal production) / No Brasil, com expansão da agricultura para suprir as exigências dos mercados internacionais, são esperados aumentos progressivos nas emissões de gases do efeito estufa. O objetivo do projeto foi hipotetisado com três abordagens principais, 1) estratégias para mitigar emissões de metano em sistemas de produção de pequenos ruminantes; 2) identificar plantas tropicais com compostos bioativos com propriedades anti metanogénicas e 3) avaliação in vivo do metabolismo de nutrientes em ovelhas Santa Inês alimentadas com planta taninífera. Para isso, foram efetuados três experimentos. O primeiro estudo (Expt 1) foi concebido para estudar os efeitos in vitro de plantas tropicais ricas em tanino como Leucaena leucocephala (LL), Mimosa caesalpineafolia (MC) e Schinus molle (SM) e uma planta não taninífera, Medicavo sativa (MS) quanto às propriedades anti-metanogénicas quando usadas com e sem polietileno glicol (PEG). Todas as plantas significativamente (P < 0.05) influenciaram na matéria orgânica degradada (MOD) e na fibra em detergente neutro degradada (FDND), especialmente a LL, que teve maior influência sobre estes parâmetros, em comparação com as outras plantas que contém tanino LL teve resposta positiva sobre os efeitos de antimethanogênicos e a degradabilidade dos nutrientes foi maior do que a das outras plantas que contém tanino. O segundo estudo (Expt 2) foi definido para avaliar o efeito de diferentes extratos orgânicos a partir do extrato metanólico da planta (EMP) de LL na produção de gás in vitro e caracterizar os constituintes químicos usando cromatografia gasosa acoplada com espectroscopia de massa (GC-MS). Os compostos mais abundantemente encontrados, em termos de percentagens relativas do EMP, foram o éster de trimetil estigmasterol, neofitadina, ácido palmítico, ácido ?-linolênico e 2, 3, 5, 6-Tetra-M-anizil -benzeno. Os efeitos de adições dos diferentes extratos orgânicos, em termos de degradabilidade de nutriente (MOD e NDFD) foram aumentados para todos os extratos. Este estudo explicou que o extrato de hexano a partir do EMP foi eficaz na atividade anti metanogênicas em modificar a degradação ruminal de nutrientes. O objetivo do terceiro estudo (Expt 3) foi estudar o efeito das folhas da planta LL na fermentação ruminal, digestibilidade aparente de nutrientes, balanço de nitrogênio e produção de metano em ovinos Santa Inês. Os animais foram divididos em três grupos em que eles foram alimentados com (i) 88% feno de Tifton-85 (Cynodon dactylon) e 12% de farelo de soja (Grupo controle, n = 4); (ii) 28% feno de Tifton-85 (Cynodon dactylon) e 72% LL mais 20 ml solução contendo 10g/dia/animal de PEG (grupo com PEG - CPEG, n = 6); (iii) 28% feno de Tifton-85 (Cynodon dactylon) e 72% LL mais 20 ml de água destilada (sem PEG-grupo-SPEG, n = 6). A ingestão de nutrientes (matéria seca, matéria orgânica, fibra em detergente ácido, lignina e proteína bruta) foram maiores no grupos CPEG e SPEG em relação ao grupo controle, exceto a ingestão de fibra em detergente neutro. As digestibilidades aparentes e o metabolismo do nitrogênio não apresentaram efeitos significativos entre os tratamentos. No entanto, as emissões de CH4 foram significativamente inferiores nos grupos CPEG e SPEG em comparação com o grupo controle. Além disso, as expressões de populações microbianas de metanogênicas no grupo CPEG apresentaram tendência menor do que nos grupos SPEG e controle. As conclusões mais salientes do presente estudo foram que, usando planta rica em tanino em dietas de pequenos ruminantes, poderemos ter mais benefícios em termos de substituição da fonte de proteína da dieta (segurança alimentar) e redução da produção de CH4 entérico

Sedimento do reservatório hipereutrófico de Salto Grande, localizado na cidade de Americana, São Paulo, foi cultivado em condições anaeróbias em meio mineral adicionado de compostos orgânicos (ácidos voláteis e álcoois) com a finalidade de favorecer a metanogênese do sistema. Com a produção de 70% de metano o sedimento foi utilizado para o teste de degradação anaeróbica do TCE. Os testes foram realizados sob atmosfera de N2/CO2 (70:30%) em frascos reatores a 25ºC e agitação constante de 150 rpm. Os frascos reatores foram preparados com meio mineral, acrescido de fontes orgânicas (5 mM de ácidos acético, fórmico e butírico, mas 2,5 mM de ácido lático e 5 mM de etanol e metanol) e inoculado com 5 g de sólidos totais voláteis por litro. Foram preparados frascos com 12 e 6 mg de tricloroetileno por litro. Dois tipos de controles foram preparados, um sem tricoroetileno e outro sem inóculo. Análise da diversidade microbiana utilizando a metodologia do DGGE - Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante - foram feitas com amostras dos frascos reatores no final do experimento. O DNA da comunidade foi extraído de acordo com o protocolo descrito por TSAI & OLSON (1991) e fragmentos do DNAr 16S foram amplificados com \"primers\" do Domínio Archaea e Bacteria. Os resultados dos testes de degradação do TCE demonstraram a remoção biótica de 68% e 66% nos reatores contendo 6 e 12 mg TCE/L, respectivamente, depois de 56 dias de incubação. No final do experimento morfologias similares aos gêneros Methanosarcina e Methanosaeta estavam presentes. A análise da diversidade microbiana não revelou uma significativa na comunidade após a adição do TCE, demonstrando que a microbiota enriquecida proveniente do reservatório de Salto Grande foi resistente à concentração do TCE estudada podendo ser responsável pelo processo de degradação sob metanogênese. / Sediments from the supereutrophic reservoir of Salto Grande, City of Americana, São Paulo State, Brazil, were cultivated under anaerobic conditions in a mineral medium added of organic compounds (volatile fatty acids and alcohols) in order to produce methane. Under 70% of methane production, sediment samples were used for tests of TCE anaerobic degradation. The tests were carried out under N2/CO2 (70:30%) atmosphere in reactor flasks, at 25°C, and constant shaking at 150 rpm. The reactor flasks were prepared with mineral medium, added with organic sources [5 mM of acetic, formic and butyric acids, plus 2.5 mM of lactic acid and 5 mM of ethanol and methanol each], and inoculated with 5 g of STV/L of the sediments. Amounts of 6 and 12 mg/L of TCE concentrations were evaluated. Two types of control reactors were prepared, without TCE and without sediments. Diversity analyses using the DGGE - Denaturing Gradient Gel Eletrophoresis - technique were done with samples from the reactor flasks at the end of the experiment. The community DNA was extracted as described by TSAl & OLSON (1991) and fragments of the 16SDNAr were magnified using the PCR methodology, with Bacteria and Archaea domain primers. The results showed degradation of 40% of TCE at concentrations of 6 mg/L and 12 mg/L after 13 days of incubation time, and complete organic acids removal with 40% of methane in the atmosphere. A second addition of 9 mM of the former organic acids indicated and 4.5 mM of lactic acid resulted in 90% of TCE removal, with 50% of methane, after 56 days of incubation time. Morphologies similar to the genera Methanosarcina, Methanosaeta and Methanospirillum were verified. The microbial diversity analysis did not reveal significant differences among Bacteria and Archaea domains under TCE additions. It was possible to assume that the enriched microbiota from the Salto Grande reservoir was resistant to the concentrations of TCE studied and can be responsible for the degradation processes under methanogenesis.

Bifenilas policloradas (PCBs) são compostos de difícil degradação presentes na composição de ascarel, muito utilizado como fluidos dielétricos e isolantes. Neste contexto, a presente pesquisa teve como objetivo avaliar a diversidade de microrganismos em biofilmes de reatores anaeróbios na presença de PCB empregando Métodos de Microbiologia de Anaeróbios Estritos e de Biologia Molecular. Em reator anaeróbio horizontal de leito fixo (RAHLF), alimentado com etanol, formiato, Triton X-100 (0,1%) e ascarel (1 mL/L), operado com tempo de detenção hidráulica (TDH) de 24 horas, foi retirado a comunidade microbiana do biofilme da espuma de poliuretano. Os grupos microbianos encontrados por meio da clonagem e sequenciamento do gene RNAr 16S para o domínio Bacteria foram relacionados aos filos Thermogae, Proteobacteria (Brachymonas petroleovorans, 100% de similaridade e Methylobacillus, 98% de similaridade), Firmicutes (Clostridium, 97% de similaridade, Syntrophomonas, 100% de similaridade e Sporomusa com 100% de similaridade), Synegistetes (Synergistes, 98% de similaridade), Spirochaetes (Leptonema illini, 98% de similaridade), Aminanaerobia, Deferribacteres, Chlorobi, Chloroflexi e Armatimonadetes. Além disso, como nesse biofilme foram identificadas bactérias redutoras de ferro, procedeu-se a sua quantificação por meio da técnica de tubos múltiplos (NMP, Número Mais Provável) obtendo 5,26 x \'10 POT.12\' NMP/g STV de bactérias redutoras de ferro. Ensaio em batelada foi realizado separadamente sob duas condições: (1) metanogênica e (2) ferro redutora. Em ambas as condições foram adicionadas aroclor 1260 (PCB). Os reatores, sob condição metanogênica, foram alimentados com meio de cultivo Angelidaki e substratos orgânicos (formiato e etanol), além de aroclor 1260 (0,2 \'mü\'g/L). Para simular a condição redutora de ferro foi acrescido ao meio de cultura Angelidaki, EDTA férrico (1,86 g/L). A produção de metano, na presença de aroclor 1260 foi de 3,8 x \'10 POT.-4\' mmol \'CH IND.4\'/g STV. A presença de bactérias ferro redutoras foi confirmada indiretamente pela taxa média de redução férrica (90%) nos reatores em batelada, após 60 dias de operação. Por meio de PCR/DGGE, elaborou-se um dendograma das amostras deste ensaio em batelada (metanogênico e redutor de ferro) comparativamente com as do reator RAHLF (biofilme presente na parede do reator e no material suporte). Os reatores em batelada apresentaram similaridade entre si de 79% e 92% para os domínios Bacteria e Archaea, respectivamente. As amostras do reator RAHLF foram 80% (Bacteria) e 96% (Archaea) similares. A existência de bactérias degradadoras de PCB, bem como, bactérias redutoras de ferro no biofilme anaeróbio contribuiu com informações sobre o consórcio microbiano e sua diversidade. / Polychlorinated biphenyls (PCBs) are compounds of difficult degradation, a component of askarel, which were used widely as coolants and lubricants. Hence, this study evaluated the diversity of microorganisms in the presence of PCBs in anaerobic reactors. For such, methods as Strict Anaerobic Microbiology and Molecular Biology were employed. The microbial community of the biofilm, developed in a fixed horizontal bed anaerobic reactor (RAHLF), was studied using the technique of cloning and sequencing of RNAr 16S gene for the Bacteria domain. The reactor had immobilized cells in polyurethane foam with ethanol and formate as a carbon source, Triton X-100 (0.1%) and polychlorinated biphenyls (1 mL/L), and operated with 24 hours HRT. The microbial groups found in this biofilm were related to phyla Thermogae, Proteobacteria (Brachymonas petroleovorans, 100% similarity and Methylobacillus, 98% similarity), Firmicutes (Clostridium, 97% similarity Syntrophomonas, and 100% similarity with Sporomusa 100% similarity), Synegistetes (Synergistes, 98% similarity), Spirochaetes (Leptonema Illini, 98% similarity), Aminanaerobia, Deferribacteres, Chlorobi, Chloroflexi and Armatimonadetes. Furthermore, as bacteria that reduce iron were found, we proceeded the quantification by the multiple tube method (MPN) for this group, obtaining 5.26 x \'10 POT.12\' MPN/g STV of iron-reducing bacteria. The batch reactors evaluated the growth of microorganisms in two condictions: (1) methanogenic e (2) iron reduction, both had the presence of PCBs (Aroclor 1260). The reactor, under methanogenic condition, was fed with synthetic substrate Angelidaki, ethanol and formate, used as carbon source, and aroclor 1260 (0.2 \'mü\'g /L). To simulate the condition of iron reducing, the same synthetic substrate was supplemented with ferric EDTA (1.86 g/L). The production of methane in the presence of aroclor 1260, was 3.8 x \'10 POT.-4\' mmol \'CH IND.4\'/g STV. The presence of iron reducing bacteria, after 60 days, was confirmed indirectly by the average rate of iron ferric reduction (90%). Filogenetics analysis (PCR/DGGE) compared the samples of this batch reactor - methanogenic and reduction of iron ferric -, with the samples of RAHLF - the biofilm in the reactor wall and the support material. The two condictions in batch reactors showed similarity of 79% and 92% respectively for the Bacteria and Archaea domain. Therefore, both samples of RAHLF showed 80% (Bacteria) and 96% (Archaea) of similarity. In other words, more similarity were presented due configuration of the reactor as well as the type of PCB added. As a result, the existence of PCBs degrading bacteria and iron-reducing bacteria in anaerobic biofilm, provided informations about the microbial consortium and its diversity in the presence of PCB.

Sedimento do reservatório hipereutrófico de Salto Grande, localizado na cidade de Americana, São Paulo, foi cultivado em condições anaeróbias em meio mineral adicionado de compostos orgânicos (ácidos voláteis e álcoois) com a finalidade de favorecer a metanogênese do sistema. Com a produção de 70% de metano o sedimento foi utilizado para o teste de degradação anaeróbica do TCE. Os testes foram realizados sob atmosfera de N2/CO2 (70:30%) em frascos reatores a 25ºC e agitação constante de 150 rpm. Os frascos reatores foram preparados com meio mineral, acrescido de fontes orgânicas (5 mM de ácidos acético, fórmico e butírico, mas 2,5 mM de ácido lático e 5 mM de etanol e metanol) e inoculado com 5 g de sólidos totais voláteis por litro. Foram preparados frascos com 12 e 6 mg de tricloroetileno por litro. Dois tipos de controles foram preparados, um sem tricoroetileno e outro sem inóculo. Análise da diversidade microbiana utilizando a metodologia do DGGE - Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante - foram feitas com amostras dos frascos reatores no final do experimento. O DNA da comunidade foi extraído de acordo com o protocolo descrito por TSAI & OLSON (1991) e fragmentos do DNAr 16S foram amplificados com \"primers\" do Domínio Archaea e Bacteria. Os resultados dos testes de degradação do TCE demonstraram a remoção biótica de 68% e 66% nos reatores contendo 6 e 12 mg TCE/L, respectivamente, depois de 56 dias de incubação. No final do experimento morfologias similares aos gêneros Methanosarcina e Methanosaeta estavam presentes. A análise da diversidade microbiana não revelou uma significativa na comunidade após a adição do TCE, demonstrando que a microbiota enriquecida proveniente do reservatório de Salto Grande foi resistente à concentração do TCE estudada podendo ser responsável pelo processo de degradação sob metanogênese. / Sediments from the supereutrophic reservoir of Salto Grande, City of Americana, São Paulo State, Brazil, were cultivated under anaerobic conditions in a mineral medium added of organic compounds (volatile fatty acids and alcohols) in order to produce methane. Under 70% of methane production, sediment samples were used for tests of TCE anaerobic degradation. The tests were carried out under N2/CO2 (70:30%) atmosphere in reactor flasks, at 25°C, and constant shaking at 150 rpm. The reactor flasks were prepared with mineral medium, added with organic sources [5 mM of acetic, formic and butyric acids, plus 2.5 mM of lactic acid and 5 mM of ethanol and methanol each], and inoculated with 5 g of STV/L of the sediments. Amounts of 6 and 12 mg/L of TCE concentrations were evaluated. Two types of control reactors were prepared, without TCE and without sediments. Diversity analyses using the DGGE - Denaturing Gradient Gel Eletrophoresis - technique were done with samples from the reactor flasks at the end of the experiment. The community DNA was extracted as described by TSAl & OLSON (1991) and fragments of the 16SDNAr were magnified using the PCR methodology, with Bacteria and Archaea domain primers. The results showed degradation of 40% of TCE at concentrations of 6 mg/L and 12 mg/L after 13 days of incubation time, and complete organic acids removal with 40% of methane in the atmosphere. A second addition of 9 mM of the former organic acids indicated and 4.5 mM of lactic acid resulted in 90% of TCE removal, with 50% of methane, after 56 days of incubation time. Morphologies similar to the genera Methanosarcina, Methanosaeta and Methanospirillum were verified. The microbial diversity analysis did not reveal significant differences among Bacteria and Archaea domains under TCE additions. It was possible to assume that the enriched microbiota from the Salto Grande reservoir was resistant to the concentrations of TCE studied and can be responsible for the degradation processes under methanogenesis.

Orientador: Roberto Alves Oliveira / Resumo: A co-digestão de água residuária da bovinocultura leiteira (ARBL) e água residuária do beneficiamento do café (ARC) em reatores anaeróbios de fluxo ascendente com manta de lodos (UASB, R1 e R2), em série, é inédita e importante para o desenvolvimento dos setores envolvidos. Foram utilizadas proporções de 100:0; 85:15, 70:30 e 50:50 de ARBL:ARC no afluente dos reatores UASB e aplicados tempo de detenção hidráulica (TDH) de 2 (R1) e 4 (R2) dias. Isto proporcionou cargas orgânicas volumétricas (COV) de 11,9 (valor médio obtido nos testes 1 e 2, sem adição de ARC); 12,9 (teste 3); 14,0 (teste 4) e 21,3 (teste 5) g DQOtotal (L d)-1 no R1. As maiores produções volumétricas de metano, de até 0,89 L CH4 (L reator d)-1 foram obtidas com COV de 14,0 g DQO (L d)-1. As concentrações médias de fenóis totais no afluente variaram entre 6 e 132 mg L-1 e as eficiências médias de remoção nos reatores UASB, em dois estágios, foram de 35 a 52% com concentração de 50 mg L-1 para efluente do R2 após adição de ARC que contém elevadas concentrações de fenóis totais e apresentam toxicidade ao tratamento anaeróbio podendo afetar a estabilidade do processo. O sistema foi eficiente para remoção de ovos de helmintos. Os Domínios Bacteria e Archaea, as Ordens Methanobacteriales, Methanomicrobiales e Methanosarcinales e as Famílias Methanosaetaceae e Methanosarcinaceae se apresentaram de forma sincrônica e equilibrada na co-digestão anaeróbia dos resíduos estudados. / Abstract: The co-digestion of dairy manure wastewater (DMW) and coffee processing wastewater (CPW) in up flow anaerobic sludge blanket (UASB, R1 and R2) in series is unprecedented and important for the development of the sectors involved. Proportions of 100: 0; 85:15, 70:30 and 50:50 DMW:CPW were used in the UASB reactors influent and applied hydraulic retention time (HRT) of 2 (R1) and 4 (R2) days. This provided organic loading rate (OLR) of 11.9 (mean value obtained in tests 1 and 2, without addition of CPW); 12.9 (test 3); 14.0 (test 4) and 21.3 (test 5) g CODtotal (L d) -1 on R1. The highest volumetric methane yields of up to 0.89 L CH4 (L reactor d) -1 were obtained with OLR of 14.0 g COD (L d) -1. The mean concentrations of total phenols in the affluent ranged from 6-132 mg L-1 and the mean removal efficiencies in two-stage UASB reactors were 35-52% with 50 mg L-1 concentration for R2 effluent after addition of ARC containing high concentrations of total phenols and toxicity to anaerobic treatment may affect process stability. The system was efficient for removal of helminth eggs. The Bacteria and Archaea Domains, the Methanobacteriales, Methanomicrobiales and Methanosarcinales Orders, and the Methanosaetaceae and Methanosarcinaceae families were presented in a synchronic and balanced manner in the anaerobic co-digestion of the residues studied. / Mestre

In Brazil, with the continued expansion of agriculture for supplying demands from international markets, progressive increases in emissions of green house gases are expected. The purpose of the project was hypothesized with three major approaches, 1) Strategies to mitigate methane emission in small ruminant production systems; 2) Identify tropical plants and individual bioactive compound against methanogenic propertie and 3) In vivo evaluation of the nutrients metabolism of Santa Ines sheep fed with tropical plants. For this, we have performed three experiments. The first study (Expt. 1) was designed to determine the in vitro effects of three tropical tannin rich plants such as Leucaena leucocephala (LL), Mimosa caesalpineafolia (MC), Schinus molle (SM) and one non-tannin rich plant Medicavo sativa (MS) for their anti-methanogenic properties when used with and without polyethylene glycol (PEG). All plants had significantly (P<0.05) influenced the degraded organic matter (TDOM) and degraded neutral detergent fiber (DNDF), especially LL, which had most influence on these parameters compared to other tannin containing plants. LL had positive response on antimethanogenic effects; its nutrient degradability was higher than that of other tannin containing plants. The second study (Expt. 2) was set to evaluate the effect of different organic extracts from the whole plant methanolic extract (MHE) of LL on in vitro gas production and to characterize the chemical constituents by using gas chromatography coupled with mass spectroscopy (GC-MS). Major abundant compounds present at the relative percentages of MHE were found to be stigmasterol trimethyl ester (TMS), neophytadiene, palmitic acid TMS, ?-Linolenic acid TMS and 2, 3, 5, 6-Tetra-M-Anisylbenzene. The effects of additions of different extracts in terms of nutrient degradability (TDOM and DNDF) were increased by all extracts. This study explained that the hexane extract from whole plant MHE was effective against methanogenic activity. The objective of the third study (Expt. 3) was to study the effect of LL plant leaves on rumen fermentation, apparent nutrient digestibility, nitrogen balance and methane production in Santa Ines sheep. The animals were divided in three groups in which they were fed with (i) 88% Tifton 85-hay (Cynodon dactylon) and 12% soyabean meal (Control group, n=4); (ii) 28% Tifton 85-hay (Cynodon dactylon) and 72% LL plus 20 ml solution containing 10g/day/animal of PEG (With PEG group - WPEG, n=6); (iii) 28% Tifton 85-hay (Cynodon dactylon) and 72% LL plus 20 ml of distilled water (Without PEG group- WOPEG, n=6). Nutrient intake (dry matter, organic matter, acid detergent fiber, lignin and crude protein) were higher in WPEG and WOPEG compared to the control group, except neutral detergent fiber intake. Apparent digestibilities and nitrogen metabolism had non-significant effects between the treatments. However, CH4 emissions were significantly lower in WPEG and WOPEG than the control. Furthermore, expressions of microbial populations of methanogens in WPEG had lower tendency than that of WOPEG and control. The most salient findings of this study were that, using plant rich in tannin in diets of small ruminants, we can get more benefits in terms of replacing the source of protein in the diet (food safety) and reduced production of enteric CH4 (animal production) / No Brasil, com expansão da agricultura para suprir as exigências dos mercados internacionais, são esperados aumentos progressivos nas emissões de gases do efeito estufa. O objetivo do projeto foi hipotetisado com três abordagens principais, 1) estratégias para mitigar emissões de metano em sistemas de produção de pequenos ruminantes; 2) identificar plantas tropicais com compostos bioativos com propriedades anti metanogénicas e 3) avaliação in vivo do metabolismo de nutrientes em ovelhas Santa Inês alimentadas com planta taninífera. Para isso, foram efetuados três experimentos. O primeiro estudo (Expt 1) foi concebido para estudar os efeitos in vitro de plantas tropicais ricas em tanino como Leucaena leucocephala (LL), Mimosa caesalpineafolia (MC) e Schinus molle (SM) e uma planta não taninífera, Medicavo sativa (MS) quanto às propriedades anti-metanogénicas quando usadas com e sem polietileno glicol (PEG). Todas as plantas significativamente (P < 0.05) influenciaram na matéria orgânica degradada (MOD) e na fibra em detergente neutro degradada (FDND), especialmente a LL, que teve maior influência sobre estes parâmetros, em comparação com as outras plantas que contém tanino LL teve resposta positiva sobre os efeitos de antimethanogênicos e a degradabilidade dos nutrientes foi maior do que a das outras plantas que contém tanino. O segundo estudo (Expt 2) foi definido para avaliar o efeito de diferentes extratos orgânicos a partir do extrato metanólico da planta (EMP) de LL na produção de gás in vitro e caracterizar os constituintes químicos usando cromatografia gasosa acoplada com espectroscopia de massa (GC-MS). Os compostos mais abundantemente encontrados, em termos de percentagens relativas do EMP, foram o éster de trimetil estigmasterol, neofitadina, ácido palmítico, ácido ?-linolênico e 2, 3, 5, 6-Tetra-M-anizil -benzeno. Os efeitos de adições dos diferentes extratos orgânicos, em termos de degradabilidade de nutriente (MOD e NDFD) foram aumentados para todos os extratos. Este estudo explicou que o extrato de hexano a partir do EMP foi eficaz na atividade anti metanogênicas em modificar a degradação ruminal de nutrientes. O objetivo do terceiro estudo (Expt 3) foi estudar o efeito das folhas da planta LL na fermentação ruminal, digestibilidade aparente de nutrientes, balanço de nitrogênio e produção de metano em ovinos Santa Inês. Os animais foram divididos em três grupos em que eles foram alimentados com (i) 88% feno de Tifton-85 (Cynodon dactylon) e 12% de farelo de soja (Grupo controle, n = 4); (ii) 28% feno de Tifton-85 (Cynodon dactylon) e 72% LL mais 20 ml solução contendo 10g/dia/animal de PEG (grupo com PEG - CPEG, n = 6); (iii) 28% feno de Tifton-85 (Cynodon dactylon) e 72% LL mais 20 ml de água destilada (sem PEG-grupo-SPEG, n = 6). A ingestão de nutrientes (matéria seca, matéria orgânica, fibra em detergente ácido, lignina e proteína bruta) foram maiores no grupos CPEG e SPEG em relação ao grupo controle, exceto a ingestão de fibra em detergente neutro. As digestibilidades aparentes e o metabolismo do nitrogênio não apresentaram efeitos significativos entre os tratamentos. No entanto, as emissões de CH4 foram significativamente inferiores nos grupos CPEG e SPEG em comparação com o grupo controle. Além disso, as expressões de populações microbianas de metanogênicas no grupo CPEG apresentaram tendência menor do que nos grupos SPEG e controle. As conclusões mais salientes do presente estudo foram que, usando planta rica em tanino em dietas de pequenos ruminantes, poderemos ter mais benefícios em termos de substituição da fonte de proteína da dieta (segurança alimentar) e redução da produção de CH4 entérico

Bifenilas policloradas (PCBs) são compostos de difícil degradação presentes na composição de ascarel, muito utilizado como fluidos dielétricos e isolantes. Neste contexto, a presente pesquisa teve como objetivo avaliar a diversidade de microrganismos em biofilmes de reatores anaeróbios na presença de PCB empregando Métodos de Microbiologia de Anaeróbios Estritos e de Biologia Molecular. Em reator anaeróbio horizontal de leito fixo (RAHLF), alimentado com etanol, formiato, Triton X-100 (0,1%) e ascarel (1 mL/L), operado com tempo de detenção hidráulica (TDH) de 24 horas, foi retirado a comunidade microbiana do biofilme da espuma de poliuretano. Os grupos microbianos encontrados por meio da clonagem e sequenciamento do gene RNAr 16S para o domínio Bacteria foram relacionados aos filos Thermogae, Proteobacteria (Brachymonas petroleovorans, 100% de similaridade e Methylobacillus, 98% de similaridade), Firmicutes (Clostridium, 97% de similaridade, Syntrophomonas, 100% de similaridade e Sporomusa com 100% de similaridade), Synegistetes (Synergistes, 98% de similaridade), Spirochaetes (Leptonema illini, 98% de similaridade), Aminanaerobia, Deferribacteres, Chlorobi, Chloroflexi e Armatimonadetes. Além disso, como nesse biofilme foram identificadas bactérias redutoras de ferro, procedeu-se a sua quantificação por meio da técnica de tubos múltiplos (NMP, Número Mais Provável) obtendo 5,26 x \'10 POT.12\' NMP/g STV de bactérias redutoras de ferro. Ensaio em batelada foi realizado separadamente sob duas condições: (1) metanogênica e (2) ferro redutora. Em ambas as condições foram adicionadas aroclor 1260 (PCB). Os reatores, sob condição metanogênica, foram alimentados com meio de cultivo Angelidaki e substratos orgânicos (formiato e etanol), além de aroclor 1260 (0,2 \'mü\'g/L). Para simular a condição redutora de ferro foi acrescido ao meio de cultura Angelidaki, EDTA férrico (1,86 g/L). A produção de metano, na presença de aroclor 1260 foi de 3,8 x \'10 POT.-4\' mmol \'CH IND.4\'/g STV. A presença de bactérias ferro redutoras foi confirmada indiretamente pela taxa média de redução férrica (90%) nos reatores em batelada, após 60 dias de operação. Por meio de PCR/DGGE, elaborou-se um dendograma das amostras deste ensaio em batelada (metanogênico e redutor de ferro) comparativamente com as do reator RAHLF (biofilme presente na parede do reator e no material suporte). Os reatores em batelada apresentaram similaridade entre si de 79% e 92% para os domínios Bacteria e Archaea, respectivamente. As amostras do reator RAHLF foram 80% (Bacteria) e 96% (Archaea) similares. A existência de bactérias degradadoras de PCB, bem como, bactérias redutoras de ferro no biofilme anaeróbio contribuiu com informações sobre o consórcio microbiano e sua diversidade. / Polychlorinated biphenyls (PCBs) are compounds of difficult degradation, a component of askarel, which were used widely as coolants and lubricants. Hence, this study evaluated the diversity of microorganisms in the presence of PCBs in anaerobic reactors. For such, methods as Strict Anaerobic Microbiology and Molecular Biology were employed. The microbial community of the biofilm, developed in a fixed horizontal bed anaerobic reactor (RAHLF), was studied using the technique of cloning and sequencing of RNAr 16S gene for the Bacteria domain. The reactor had immobilized cells in polyurethane foam with ethanol and formate as a carbon source, Triton X-100 (0.1%) and polychlorinated biphenyls (1 mL/L), and operated with 24 hours HRT. The microbial groups found in this biofilm were related to phyla Thermogae, Proteobacteria (Brachymonas petroleovorans, 100% similarity and Methylobacillus, 98% similarity), Firmicutes (Clostridium, 97% similarity Syntrophomonas, and 100% similarity with Sporomusa 100% similarity), Synegistetes (Synergistes, 98% similarity), Spirochaetes (Leptonema Illini, 98% similarity), Aminanaerobia, Deferribacteres, Chlorobi, Chloroflexi and Armatimonadetes. Furthermore, as bacteria that reduce iron were found, we proceeded the quantification by the multiple tube method (MPN) for this group, obtaining 5.26 x \'10 POT.12\' MPN/g STV of iron-reducing bacteria. The batch reactors evaluated the growth of microorganisms in two condictions: (1) methanogenic e (2) iron reduction, both had the presence of PCBs (Aroclor 1260). The reactor, under methanogenic condition, was fed with synthetic substrate Angelidaki, ethanol and formate, used as carbon source, and aroclor 1260 (0.2 \'mü\'g /L). To simulate the condition of iron reducing, the same synthetic substrate was supplemented with ferric EDTA (1.86 g/L). The production of methane in the presence of aroclor 1260, was 3.8 x \'10 POT.-4\' mmol \'CH IND.4\'/g STV. The presence of iron reducing bacteria, after 60 days, was confirmed indirectly by the average rate of iron ferric reduction (90%). Filogenetics analysis (PCR/DGGE) compared the samples of this batch reactor - methanogenic and reduction of iron ferric -, with the samples of RAHLF - the biofilm in the reactor wall and the support material. The two condictions in batch reactors showed similarity of 79% and 92% respectively for the Bacteria and Archaea domain. Therefore, both samples of RAHLF showed 80% (Bacteria) and 96% (Archaea) of similarity. In other words, more similarity were presented due configuration of the reactor as well as the type of PCB added. As a result, the existence of PCBs degrading bacteria and iron-reducing bacteria in anaerobic biofilm, provided informations about the microbial consortium and its diversity in the presence of PCB.