Thèses (Ph.D.)--Université de Sherbrooke (Canada), 2002. / Titre de l'écran-titre (visionné le 15 août 2006). Publié aussi en version papier.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2001. / Bibliogr.: f. 193-234. Publié aussi en version électronique.

Les norovirus sont les principaux agents responsables de gastroentérites humaines non bactériennes dans le monde affectant tous les âges. Leur incidence croissante serait liée à leur capacité d’adhésion et de leur persistance dans la chaine alimentaire. Cependant, le mécanisme de cette adhésion demeure inconnu. L’objectif de ce doctorat était d’étudier et de caractériser les norovirus sur les plans structural, moléculaire et fonctionnel afin d’élucider leur mécanisme d’adhésion aux surfaces. Des prototypes «virus-like particle» (VLPs) de norovirus humains des génogroupes GI.1, GII.4 et du calivirus félin (FCV) ont été produits par culture cellulaire, purifiés par ultracentrifugation et caractérisés en fonction du pH, de la force ionique et de la température. Pour cette caractérisation, les charges électriques et les tailles des VLPs ont été analysées en utilisant un Zeta NanoSizer ZS. Les structures secondaires et tertiaires ainsi que leur stabilité ont été analysées par les techniques de dichroïsme circulaire et de fluorescence UV, respectivement. Les énergies de surfaces des VLPs et des surfaces inertes et alimentaires, de même que les énergies libres d’interaction interfaciale entre les VLPs et les surfaces ont été estimées après des mesures d’angle de contact au goniomètre. Enfin, des essais d’adhésion de VLPs de norovirus GII.4 ont permis de faire des corrélations entre les résultats de ces adhésions et les changements structuraux, moléculaires et fonctionnels. Les données ont révélé que l’adhésion des VLPs de GII.4 dépendrait plutôt des changements structuraux moléculaires et fonctionnels des VLPs de GII.4 que des propriétés thermodynamiques des surfaces. Les maxima d’adhésion observés au point isoélectrique avec des diminutions aux pH élevés et les augmentations avec la force ionique ont démontré respectivement, l’importance des interactions acide-bases (hydrophobes) et des forces de van der Waals dans le phénomène d’adhésion. Sur le polyéthylène et la laitue, l’adhésion semble être régie par les interactions hydrophobiques, tandis que sur l’acier inoxydable, elle est apparemment régie par les interactions de van der Waals. À basse température, elle semble reposer sur les résidus hydrophobes à la surface de la capside alors qu’à hautes températures, un déploiement de résidus hydrophobes internes après dénaturation des structures secondaires et tertiaires semble probable dans le phénomène. Le type d’interactions majoritairement impliquées (hydrophobiques) invite à l’utilisation d’agents chaotropiques pour une meilleure élimination des norovirus adhérés et leur contrôle dans le secteur agroalimentaire. / Human noroviruse has been the main cause of acute non-bacterial gastroenteritis in the world through all ages. Their growing incidence has been repeatedly associated with their ability to bind and persist on agrifood surfaces in food processing environments. However, the mechanism of their adhesion phenomenon remains unknown. This study was aimed at identifying structural, molecular and functional elements of human norovirus involved in their adhesion phenomenon. Prototypes as «virus-like particle» (VLPs) have been produced for human noroviruses GI.1 and GII.4 and feline calicivirus (FCV) using cell culture, purified by ultracentrifugation, and characterized with aspect to pH, ionic strength and temperature. In this characterization, their electrical charges and their size were analyzed using a Zeta NanoSizer ZS and their secondary and tertiary structures and stability were analyzed using circular dichroism and intrinsic fluorescence UV techniques, respectively. Their surface energies as well as surface energies of inert surfaces and fresh foods were estimated applying contact angle technic with a goniometer. The total interfacial free energy of interactions between the VLPs and the surfaces were estimated, and GII.4 VLPs adhesion assays perfomed in order to draw correlation between adhesion and structural, molecular and functional changes. Our results revealed that GII.4 VLPs adhesion was rather related to structural, molecular and functional changes than surface thermodynamic proprieties. Maxima observed at isoelectric point followed by decreases with pH and the increasing trend with increasing ionic strength indicate respectively the importance of acid base (hydrophobic) interactions and of van der Waals interactions in adhesion phenomenon. The adhesion on polyethylene and lettuce are seemingly related to hydrophobic interactions, while the adhesion on stainless steel is apparently controlled by van der Waals interactions. At low temperature, adsorption may rely on capsid external hydrophobic residues, while at high temperature, internal hydrophobic residues may plausibly play a part in the process upon denaturation of secondary and tertiary structures. The interactions mainly involved in GII.4 VLPs adsorption are hydrophobic and suggest the use of chaotropic agents to break efficiently adhesion mechanism and limit norovirus outbreaks.

La leishmaniose est une menace pour la santé d'environ 1 milliard d'individus globalement et son contrôle est précaire. L'un des points culminants de ce contrôle est le traitement des cas par la chimiothérapie. Seulement 4 composés sont actuellement recommandés pour traiter la leishmaniose. L'utilisation de ces composés est restreinte par leur coût, la complexité d'administration et par l'émergence de résistance. Il y a donc un besoin urgent de nouvelles molécules pour traiter la leishmaniose. L'étude de la résistance fourni une multitude d'informations qui peut permettre d'ajuster les traitements et le développement de nouvelles molécules. En effet l'étude de la résistance permet l'identification de marqueurs de résistance, de choisir les composantes d'une multithérapie de façon à contrer l'émergence de résistance et même de dévoiler les cibles thérapeutiques de certains composés. Dans le cadre de la présente thèse, deux méthodes génomiques pour faire l'étude de la résistance ont été utilisées, soit le séquençage de génomes de souches cliniques résistantes et l'application du Cos-Seq (un criblage génomique par gain de fonction) sur des molécules nouvelles ou repositionnées ayant une activité anti-Leishmania. Cela a permis l'identification de marqueurs de résistance, et de cibles thérapeutiques. Le séquençage de génomes de parasite résistants a mis en lumière une insertion de 2 nucléotides dans le gène de l'aquaglycéroporine AQP1. Des expériences d'édition de l'ADN ont validé AQP1 comme marqueur de la résistance à l'antimoine chez les souches cliniques. La technique de Cos-seq a été utilisé avec un composé GSK TCMDC 143295 et a mis en lumière la sous-unité régulatrice RPN1, une composante clé du protéasome. Le niveau de résistance observé suite à la transfection de RPN1, l'interaction drogue-RPN1 telle qu'observée par protection à la trypsine, et l'essentialité du gène RPN1 nous porte à croire qu'il s'agit de la cible thérapeutique de TCMDC 143295. L'approche Cos-seq a également été utilisée avec six drogues repositionnées et actives contre le Leishmania. Les résultats les plus probants sont les suivants. Nous avons réussi à isoler la cible de la terbinafine soit la squalene époxydase ERG1. Cette même époxydase conférait une hyper susceptibilité au kétoconazole. Nous avons isolé un cosmide enrichi avec une sélection avec la tafenaquine qui code pour une NAD synthase et qui pourrait s'avérer sa cible. Finalement nous avons isolé des cosmides, suite à une sélection avec le tamoxifène et l'allopurinol, qui codent respectivement pour des transporteurs ABC et des transporteurs membranaires. Des études supplémentaires détermineront si ces différents gènes enrichis lors du crible sont des cibles ou des mécanismes de résistance. Bien que de plus amples expérimentations seront nécessaire afin de consolider les informations recueillies dans la présente thèse, elles sont tout de même déjà des pistes solides pour mieux orienter le développement ou l'amélioration de nouvelles molécules ainsi que l'approche de traitement des leishmanioses. Cela démontre une fois de plus l'utilité d'étudier la résistance pour permettre une meilleure approche du contrôle de la leishmaniose.

Titre de l'écran-titre (visionné le 15 mai 2023) / Cette recherche est financée par le programme CREATE du SMAART-CRSNG et la stratégie Sentinelle Nord de l'Université Laval. Ce projet vise à mettre au point un prototype de biocapteur multi détection utilisé pour surveiller la croissance des bactéries ainsi que les paramètres de croissance de leur environnement, notamment le pH et la température, dans divers environnements et dans des endroits éloignés comme le Grand-Nord canadien. La mesure de l'activité des micro-organismes, comme les bactéries, à très basse température peut être extrêmement difficile en raison de leur faible métabolisme et de leur taux de croissance beaucoup plus lent. En effet, la surveillance de leurs fonctions nécessite des outils de haute précision. En outre, lorsque la température ou le pH du milieu de croissance dépasse la plage optimale, la croissance du micro-organisme est entravée. Par conséquent, il est essentiel de surveiller les paramètres environnementaux et les facteurs écologiques, tels que le pH et la température, car ils ont un impact direct sur la croissance bactérienne. Un autre élément essentiel pour améliorer la sensibilité des mesures est la conception et le dimensionnement optimaux des électrodes de détection. La réduction de la taille des électrodes de détection peut permettre une détection à haut débit dans les applications microbiologiques, et permettre des mesures avec un échantillonnage de volume minuscule. Enfin, un système à micro-échelle léger et peu coûteux permet un transport facile dans les régions éloignées. Nous avons donc conçu et fabriqué un nouveau biocapteur multimodal de haute précision, de faible puissance et de poids léger, afin de mesurer la croissance les colonies de bactéries sur le terrain, tout en relevant tous les défis critiques mentionnés ci-dessus. Comme première contribution, pour augmenter la sensibilité des mesures, non seulement le matériau des électrodes mais aussi leur mise à l'échelle et leur miniaturisation sont abordés et évalués. Le prototype utilise plusieurs électrodes à l'échelle microscopique intégrées dans une seule zone de détection pour mesurer avec précision les changements d'impédance, de pH et de température ambiante causés par les activités microbiennes. Cette conception unique comprend des électrodes interdigitées plaquées or (AuIDE), des électrodes de pH à base d'oxyde d'iridium (IrO₂) et des électrodes de détecteur de résistance-température (RTD) en or en forme de serpent sur une seule zone de détection. Plusieurs géométries d'électrodes sont conçues et mises en œuvre de manière optimale sur un circuit imprimé flexible standard, et sont comparées pour évaluer l'effet d'une zone de détection donnée sur la sensibilité du biocapteur à l'aide de diverses techniques de mesure et de circuits personnalisés. Le circuit imprimé de l'électrode est connecté à un circuit imprimé personnalisé contenant les circuits de détection pour la mesure de l'impédance, du pH et de la température. Dans la deuxième contribution, pour une détection d'impédance entièrement intégrée, un amplificateur à verrouillage CMOS (LIA) personnalisé est conçu et fabriqué dans une technologie CMOS de 0,18 µm pour surveiller la croissance bactérienne dans divers environnements à l'aide d'une technique de mesure d'impédance multifréquence. En termes de conception de circuit, un nouvel amplificateur de transimpédance capacitif (CTIA) entièrement différentiel, à faible bruit, avec Chopper stabilisation et S/H dans l'étage de sortie pour maximiser le SNR, est inclus dans la conception LIA proposée. Les autres composants principaux du LIA sont un filtre passe-bande avec des fréquences centrales sélectionnables de 1, 2, 4 et 10 kHz, un amplificateur de gain programmable (PGA) qui offre six gains variables allant de 6 dB à 67 dB pour ajuster le gain dans une plage raisonnable pour détecter le signal d'entrée sans saturer le système, un mélangeur, et un filtre passe-bas avec une largeur de bande de 40 Hz. La sensibilité globale du LIA est de 240 mV/nA avec un courant détectable minimal de 1 pA, un bruit référencé à l'entrée de 58 pA/Hz et une consommation d'énergie totale de 817,56 µW. Comparé à d'autres solutions de la littérature, ce nouveau système donne un dispositif très précis, à faible bruit et à faible consommation d'énergie pour surveiller l'activité microbienne à de faibles concentrations en mesurant l'impédance résultant des métabolites ioniques libérés. Pour relever le troisième défi critique, les circuits de lecture des capteurs de pH et de température sont fabriqués à l'aide de composants disponibles dans le commerce. Un circuit de mesure du pH est conçu en utilisant un amplificateur opérationnel avec un courant de polarisation d'entrée très faible. De plus, un circuit en pont de Wheatstone avec un réseau de résistances est conçu pour mesurer la température en se reliant à l'électrode de température RTD comme une valeur de résistance inconnue. Le microcontrôleur 8 bits reçoit le signal filtré, amplifié et numérise et traite les données du capteur. Le prototype a été utilisé avec succès pour effectuer des mesures de croissance bactérienne in vitro. Dans l'ensemble, il s'agit du premier système qui fournit un biocapteur multimodal de haute précision, à faible consommation d'énergie, à faible coût, à faible bruit, léger et non invasif pour la surveillance de la culture bactérienne. Ce système peut faire des mesures dans un très petit volume grâce à un microsystème de mesure d'impédance intégré. Ainsi, il peut être utilisé pour la surveillance des paramètres environnementaux, y compris le pH et la température, en utilisant des électrodes et des capteurs de haute précision conçus et fabriqués de manière optimale. / This research is funded by the SMAART-NSERC CREATE Program and the Sentinel North Strategy at Université Laval. This project aimed to develop a multi-sensing biosensor prototype used for monitoring bacterial growth as well as their environmental growth parameters, including pH and temperature, in diverse environments and remote locations such as Canada's north. Measuring the activity of microorganisms, such as bacteria, at very low temperatures can be extremely challenging due to their low metabolism and much slower growth rate. Indeed, monitoring their functions requires high-precision tools. Furthermore, when the temperature or pH of the growth medium goes beyond the optimal range, the microorganism's growth is hindered. As a result, monitoring the environmental parameters and ecological factors, such as pH and temperature, is critical because they directly impact bacterial growth. Another critical component for improving measurement sensitivity is the optimal design and scaling of sensing electrodes. Sensing electrode downsizing can enable high-throughput sensing in microbiology applications, and enable measurements with tiny volume sampling. Finally, a light-weight and inexpensive microscale system would allow easy transportation in remote areas. We, therefore, designed and fabricated a novel multimodal high-precision, low-power, and light-weight biosensor to interface with bacteria colonies while addressing all the critical challenges mentioned above. As the first contribution, to increase the sensitivity of measurements, not only the material of the electrodes but also their scaling and miniaturization are addressed and evaluated. The prototype uses multiple microscale electrodes integrated into a single sensing area to precisely measure impedance, pH, and ambient temperature changes caused by microbial activities. This unique design includes the optimally designed gold-plated interdigitated electrodes (AuIDEs), Iridium oxide (IrO₂)-based pH electrodes, and the snaked-shape gold resistance-temperature detector (RTD) electrodes on a single sensing area. Multiple electrode geometries are optimally designed and implemented on a standard flexible PCB and are compared to evaluate the effect of a given sensing area on the sensitivity of the biosensor employing various measurement techniques and customized circuits. The electrode's PCB is connected to a custom-designed PCB containing the sensing circuits for impedance, pH, and temperature measurement. As the second contribution, for fully integrated impedance sensing, a custom CMOS lock-in amplifier (LIA) is designed and fabricated in a 0.18 µm CMOS technology to perform bacterial growth monitoring in diverse environments using a multi-frequency impedance measurement technique. In terms of circuit design, a novel fully differential, low-noise capacitive transimpedance amplifier (CTIA) with chopper stabilization and S/H in the output stage to maximize SNR is included in the proposed LIA design. The other major components of the LIA are a band-pass filter with selectable center frequencies of 1, 2, 4, and 10 kHz, a programmable gain amplifier (PGA) that offers six variable gains ranging from 6 dB to 67 dB to adjust the gain within a reasonable range to detect the input signal without saturating the system, a mixer, and a low-pass filter with a bandwidth of 40 Hz. The overall sensitivity of the LIA is 240 mV/nA with a minimum detectable current of 1 pA, input-referred noise of 58 pA/Hz, and a total power consumption of 817.56 µW. Compared to other solutions in the literature, this novel system results in a highly precise, low-noise, and low-power consumption device for monitoring microbial activity at low concentrations by measuring the impedance as a result of released ionic metabolites. To address the third critical challenge, the reading circuits of the pH and temperature sensors are fabricated using off-the-shelf components. A pH measuring circuit is designed using an operational amplifier with a very low input-bias-current. Furthermore, a Wheatstone bridge circuit with a network of resistors is designed to measure temperature by linking to the RTD temperature electrode as an unknown resistor value. The 12-bit microcontroller receives the filtered and boosted signal and digitizes and processes the sensor's data. The prototype was successfully used to perform bacterial growth measurements in vitro. Overall, this is the novel system that provides a high-precision, low-power consumption, low-cost, low-noise, lightweight, and non-invasive multimodal biosensor for bacterial culture monitoring at very small volume through a custom integrated impedance measurement microsystem, as well as environmental parameter monitoring, including pH and temperature, employing optimally designed and fabricated electrodes and high-precision sensors.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles / Malgré la pasteurisation obligatoire du lait de consommation et la mise en place de bonnes pratiques de fabrication et d'hygiène dans les usines de transformation laitière, certains microorganismes résistants à la chaleur ou issus de phénomènes de post-contamination peuvent se retrouver dans les produits laitiers transformés et s'y développer. En plus d'entraîner des pertes alimentaires et économiques en raison du non-respect des normes microbiologiques ou des diverses altérations occasionnées, les microorganismes associés aux produits laitiers non-conformes et/ou atypiques (PL-NC/AT) constituent une préoccupation majeure pour les industries laitières en raison de leur capacité potentielle à former des biofilms sur les surfaces et à résister à certains désinfectants et antibiotiques. Ce projet de recherche visait à isoler, identifier et caractériser les microorganismes provenant de PL-NC/AT afin de bâtir une collection microbienne documentée de référence. En collaboration avec plusieurs industries laitières et fromagères, 105 souches de bactéries, levures et moisissures problématiques, issues de différents PL-NC/AT (lait, crème, crème glacée et fromages), ont été isolées par culture et identifiées par MALDI-TOF ou séquençage. La caractérisation de cette diversité d'isolats a permis de mettre en évidence que la majorité de ces souches étaient sensibles à un traitement de chaleur équivalent à une pasteurisation, suggérant que ces microorganismes auraient été réintroduits dans les produits laitiers par post-contamination. Près de 25 souches bactériennes se sont d'ailleurs révélées être d'importantes productrices de biofilms en microplaques de 96 puits et 13 de ces souches ont démontré une résistance élevée à un traitement de 5 minutes à l'acide peracétique (100 ppm) et à l'hypochlorite de sodium (70 ppm) en microplaques MBEC. De plus, 56 isolats bactériens ont présenté une résistance contre l'ampicilline, la fosfomycine et/ou la ceftriaxone. Ces nouvelles connaissances pourront guider et mener à l'élaboration de mesures innovantes dans le contrôle et la prévention des contaminations microbiologiques dans l'industrie laitière. / Despite the mandatory pasteurization of fluid milk and the implementation of good manufacturing and hygiene practices in dairy processing plants, some heat-resistant microorganisms or other microorganisms resulting from post-pasteurization contamination can be found in processed dairy products. In addition to causing food and economic losses due to spoilage or non-compliance with microbiological standards, microorganisms associated with non-compliant and/or atypical dairy products (NC/AT-DP) are a major concern for dairy industries due to their potential ability to form biofilms and to resist to some disinfectants and antimicrobial agents. The objective of this project was to isolate, identify and characterize microorganisms from NC/AT-DP to create a documented microbial collection. In collaboration with several dairy and cheese industries, 105 strains of problematic bacteria, yeasts, and molds from various NC/AT-DP (milk, cream, ice cream and cheese) were isolated by culture and identified by MALDI-TOF or sequencing. The characterization of these isolates demonstrated that most of the strains were sensitive to a heat treatment equivalent to pasteurization, suggesting that these microorganisms would have been reintroduced into dairy products by post- pasteurization contamination. Nearly 25 bacterial strains have also shown to be moderate or strong biofilm-producers in 96-well microplates and 13 of these strains have demonstrated a high resistance to a 5-minute treatment with peracetic acid (100 ppm) and sodium hypochlorite (70 ppm) in MBEC microplates. In addition, 56 bacterial isolates showed resistance against ampicillin, fosfomycin and/or ceftriaxone. These results will guide and may lead to the development of new strategies to control and prevent microbiological contamination in the dairy sector.

Les microbes ou micro-organismes sont les producteurs primaires des services écosystémiques pour les cycles biogéochimiques de la terre et les systèmes biologiques. Les xénobiotiques marquent une nouvelle ère anthropogénique « l’anthropocène », et ils représentent une source de sélection artificielle de la structure et de la composition de la biodiversité microbienne. Par conséquent, les perturbations anthropogéniques sont néfastes pour les systèmes microbiens et induisent des changements adaptatifs ou des dommages dans leurs répertoires génotypiques. L’assemblage des communautés microbiennes durant la résistance et la résilience est gouverné par des processus éco-évolutifs. Ce travail découle de l’intersection transdisciplinaire de l’écotoxicologie, l’écologie microbienne, la métagénomique et la bioinformatique. L’objectif de ce travail consiste à étudier les signatures adaptatives de la résistance et de la résilience microbienne selon deux modèles. Le premier est environnemental (E) composé d’un bassin versant lacustre contaminé par des métaux lourds. Le deuxième modèle est hôte-associé (HA), constitué d’un système expérimental d’exposition de la Perchaude (Perca flavescens) au chlorure de cadmium selon deux régimes constant et graduel. Trois nouveautés résument les travaux de cette thèse de doctorat. Premièrement, le phénomène de découplage taxon-fonction a été démontré pour la première fois, dans le système E sous un gradient sélectif de pollution, et au sein du microbiote cutané dans le système HA durant sa période de résilience. Deuxièmement, des altérations significatives de la diversité taxonomiques et fonctionnelles mettent en évidence des signatures adaptatives du résistome et de l’érosion des fonctions métaboliques dans le système E. Quant au système HA, le stress métallique a augmenté la prévalence significative de souches pathogènes et des opportunistes avec une dysbiose cutanée de la perchaude accompagnée par une réduction de sa capacité de résistance à une colonisation bactérienne massive. Troisièmement, la modélisation de l’assemblage bactérien de microbiote du système HA montre des rôles confondus de l’ontogenèse et de la force de sélection durant la période de résistance. La persistance des effets à long terme de la sélection durant le stade de résilience a été expliquée par une augmentation inattendue de la bioaccumulation du cadmium dans les tissus hépatiques de l’hôte. En conclusion, nos travaux montrent que l’adaptation des répertoires métagénomiques peut être décelée par le phénomène de redondance fonctionnelle observée à l’échelle de découplage taxon-fonction, ce qui reflète potentiellement une stratégie adaptative par transfert horizontal de gènes partagés entre les communautés microbiennes environnementales sous perturbation graduelle. Dans le système HA, l’assemblage de microbiote montre un gradient de processus neutres et non neutres. Enfin, la dérive taxonomique serait une force écologique non négligeable plus importante dans le système environnemental que dans le système intestinal durant et après la perturbation. / Microbes or microorganisms are the primary producers of ecosystem services for biogeochemical cycles of the earth and biological systems. Xenobiotics mark a new anthropogenic era, "the Anthropocene," and they represent a source of artificial selection of the structure and composition of microbial biodiversity. As a result, anthropogenic disturbances are detrimental to microbial systems and induce adaptive changes or damage in their metagenomic repertories. During resistance and recovery, the ecological processes governing the assembly of microbial communities cannot be dissociated from those of microbial evolution. This work stems from the transdisciplinary intersection of ecotoxicology, microbial ecology, metagenomics and bioinformatics. The main goal is to understand the adaptive signatures of microbial resistance and resilience in two models. The first is environmental (E) composed of a lake-bound watershed contaminated by heavy metals. The second model is hostassociated (HA), consisting of an experimental system of perch (Perca flavescens) intoxicated with cadmium using two steady and gradual regimes. Three novelties summarize the work of this doctoral thesis. Firstly, the phenomenon of taxon-function decoupling has been demonstrated for the first time, in the E system under selective pollution gradient, and second, within the cutaneous microbiota in the HA system during its recovery stage. Third, the microbiota assembly modelling in the HA system suggested mixed effects of ontogenesis, and selective pressure during the period of resistance and recovery. The increase in cadmium bioaccumulation in liver tissues of perch can argue the persistence of the long-term effects of selection during the recovery stage. In conclusion, our work showed that the adaptation of microbial metagenomic repertories could be revealed through functional and taxonomic redundancy patterns observed at the scale of taxon-function decoupling. The gap between functional and taxonomic diversity reflects an adaptive strategy by horizontal gene transfer among environmental communities microbial under gradual disruption In the HA system, the microbiota assembly shows a gradient of neutral and non-neutral processes. Finally, the taxonomic drift is a significant ecological force, more effective in the environmental system than in the intestinal system during and after the disruption.

Titre de l'écran-titre (visionné le 25 septembre 2023) / Les infections causées par des pathogènes fongiques sont un problème de santé publique inquiétant. Le taux de mortalité des patients avec une infection fongique invasive dépasse souvent 50%, et ce, même s'ils sont traités. Des études ont estimé que plus de décès sont causés chaque année par les maladies fongiques que par la tuberculose et la malaria. Malgré cela, les infections fongiques ont été très peu étudiées comparativement aux autres types de maladies infectieuses. Les antifongiques tels que les azoles sont essentiels pour traiter les mycoses. Cependant, l'évolution de la résistance met en péril notre capacité à traiter les patients infectés. Plusieurs mutations dans la cible moléculaire des azoles, Erg11, sont connues pour conférer la résistance. Pourtant, nos connaissances actuelles ne sont pas suffisantes pour être utilisées en clinique afin d'assister le choix de traitement et pour aider à développer de nouveaux médicaments. Nous avons construit un système pour étudier des variants d'ERG11 de pathogènes fongiques comme Candida albicans dans la levure modèle Saccharomyces cerevisiae. Nous avons remplacé le promoteur natif d'ERG11 de S. cerevisiae (ScERG11) avec un promoteur répressible à la doxycycline afin de supprimer l'expression du gène. Nous avons confirmé qu'ERG11 de C. albicans (CaERG11) complémente la fonction de ScERG11. Nous montrons également que des mutations de résistance telles que G464S dans CaERG11 peuvent être reconstituées dans notre système. De plus, en utilisant une approche de type Deep Mutational Scanning, nous avons construit une librairie exhaustive de CaERG11 comprenant presque 8000 mutants. Finalement, nous avons utilisé notre système pour caractériser des mutations dans CaERG11. Nous avons découvert de nouvelles mutations de résistance au fluconazole tout en décrivant des mutations déjà reportées dans la littérature. Ultimement, nous caractériserons systématiquement les mutations dans CaERG11 qui confèrent la résistance aux azoles et évaluerons leur impact sur la fonction de la protéine. / Infections caused by fungal pathogens are a concerning public health problem. The mortality rate of patients with an invasive fungal infection often exceeds 50%, even when they are treated. Studies estimated that more than 1.7 million deaths are caused by fungal disease each year, which is more than tuberculosis or malaria. Despite this, fungal infections have been understudied in comparison to other types of infectious diseases. Antifungals such as azoles are crucial medications to treat mycosis. However, the evolution of resistance to these molecules jeopardizes our ability to treat infected patients. Many mutations in the azole target Erg11 are known to confer resistance. Yet, our current knowledge is not sufficient to be used in clinics to assist the choice of treatment and to help in the development of new drugs. We built a system to study ERG11 variants of fungal pathogens like Candida albicans in the model yeast Saccharomyces cerevisiae. We replaced the native ERG11 promoter of S. cerevisiae (ScERG11) with a doxycycline repressible promoter to suppress the expression of the gene. We confirmed that ERG11 of C. albicans (CaERG11) complements the function of ScERG11. We also show that the resistance phenotypes due to mutations such as G464S in CaERG11 can be reconstituted in our system. Furthermore, using a Deep Mutational Scanning approach, we constructed an exhaustive library of nearly 8000 variants in CaERG11 and validated its completeness by high throughput sequencing. Finally, we confirmed that our system can be used to characterize azole resistance mutations. We screened the CaERG11 library with fluconazole and isolated resistant variants. We discovered new resistance mutations while describing mutants already reported in the literature. Ultimately, our system will be used to systematically characterize azole resistance mutations in ERG11 and to evaluate the impact of mutations on the protein function.

Depuis la découverte des sources hydrothermales en 1977, un petit nombre d'études ont permis l'isolement et la caractérisation de micro-organismes pouvant résister à de hautes pressions et températures. Parmi ceux-ci, Pyrococcus yayanosii, une archée hyperthermophile de l'ordre des Thermococcales est issue du site Ashadze (dorsale medio-atlantique) à 4100 m de profondeur. Cette espèce représente le premier organisme à la fois hyperthermophile et piézophile strict décrit à ce jour. Elle ne peut en effet se diviser à des pressions inférieures à 20 MPa et sa pression optimale de croissance est de 52 MPa. Afin d'étudier les mécanismes que met en oeuvre cette espèce pour se développer sous hautes pressions, des expériences de transcriptomique (puces à ADN) et protéomique (LC-MS/MS) ont été entreprises à différentes pressions notamment sub- et supraoptimales. La distinction entre les effets « stress » et « adaptations » à la pression a été effectué en comparant les résultats obtenus chez une autre Thermoccocale proche, Pyrococcus furiosus, qui est piézosensible. La détermination des pressions sub et supra optimales a été préalablement effectuée sur une large gamme de pression hydrostatique. Des analyses génomiques ont aussi été effectuées sur les Thermococcales en général et ses deux espèces en particulier et montrent des différences importantes au niveau des voies de biosynthèse des acides aminés ainsi que des transporteurs membranaires. Les analyses transcriptomiques et protéomiquesmontrent que P. yayanosii joue essentiellement sur ses mécanismes de production d'énergie (métabolisme del'hydrogène), de mobilité (chimiotactisme), de traduction (protéines ribosomales) ainsi que sur ses mécanismes de défense (CRISPR/cas). P. furiosus met en place des mécanismes se basant aussi sur la traduction et la mobilité (archaellum). Il semble que ces derniers puissent ainsi être considérés comme des réponses aux stress, alors que la modulation énergétique uniquement présente chez P. yayanosii soit plus un « shift » métabolique permettant à la cellule de s'adapter aux différentes conditions de pression de son environnement. / No

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2004. / Bibliogr.: f. [172]-233. Publié aussi en version électronique.