Staphylococcus aureus et ses entérotoxines constituent un risque pour l’industrie alimentaire ainsi que pour les consommateurs. Environ la moitié des souches de S. aureus peuvent libérer des toxines menant à des symptômes de nausées, de diarrhées et de vomissements chez la personne ayant ingéré un produit contaminé. Une des solutions envisagées pour éliminer S. aureus et éviter la production d’entérotoxines, est l’utilisation d’un cocktail de phages. Au cours de ce projet de doctorat, trois objectifs ont été développés afin de poursuivre une stratégie de sélection d’un cocktail de phages anti-S. aureus. Tout d’abord, deux phages isolés du milieu laitier, adaptés à celui-ci et respectant des critères de sélection, ont été caractérisés. Ensuite, afin d’éviter un transfert de facteurs de virulence, des myophages anti-S. aureus ont été produits sur une souche de Staphylococcus xylosus, une espèce non-pathogène utilisée en transformation alimentaire et ont été caractérisés afin de confirmer leur identité lorsqu’amplifiés sur les deux espèces. D’un autre côté, l’efficacité contre une panoplie de souches de S. aureus isolées de sources distinctes, l’absence de gènes de virulence dans les génomes phagiques et la résistance à différentes conditions environnementales ont permis de sélectionner des phages différents. Ceux-ci ont fait l’objet de deux cocktails de phages efficaces menant à une réduction significative de la concentration de S. aureus dans des fromages de type Cheddar produits en laboratoire. De plus, ces phages n’ont pas déclenché une surproduction d’entérotoxines staphylococciques C, confirmant la sécurité de leur utilisation dans le milieu laitier. Enfin, la conservation des phages sous forme encapsulée et congelée dans des microbilles de gel d’alginate/calcium semble une approche à approfondir. Les phages staphylococciques virulents analysés dans cette thèse constituent d’excellents agents de biocontrôle étant non nocifs et infectant spécifiquement une espèce bactérienne donnée. Ayant confirmé l’efficacité de deux cocktails de phages, l’utilisation du produit phagique permettra de diminuer le risque d’apparition de souches bactériennes résistantes aux phages. De plus, entreprendre une mise à jour constante du cocktail phagique permettra de réduire la contamination causée par S. aureus, préservant ainsi l’innocuité et la qualité des aliments. / Staphylococcus aureus and its enterotoxins pose a risk to the food industry and for consumers. Approximately half of the S. aureus strains can release toxins leading to symptoms of nausea, diarrhea and vomiting to the person who ingests a contaminated product. One emerging solution to eliminating and preventing S. aureus enterotoxin production is the use of a phage cocktail. Through this doctoral project, three objectives were developed to pursue a strategy for selecting an anti-S. aureus phage cocktail based on well-defined criteria. First, a methodology was developed leading to the isolation and characterization of two phages from raw milk. Then, in order to avoid a transfer of virulence factors, anti-staphylococcal myophages were produced on a strain of Staphylococcus xylosus, a non-pathogenic species used in food processing. Their genomic identity when propagated separately on the two species was confirmed. Moreover, the host range of these phages was tested against a panel of S. aureus strains isolated from different sources. Their genome was analyzed to confirm the lack of virulence genes. In addition, their resistance to different environmental conditions was used to select different phages for application purposes. These data helped design two efficient phage cocktails leading to a significant drop of S. aureus concentration in small-scale laboratory-based Cheddar cheeses. In addition, they did not trigger the overproduction of staphylococcal enterotoxin C confirming the safety of their use in the dairy environment. Finally, in the aim of commercializing the product, conservation methods were investigated and the encapsulation and freeze of phages in micro-beads consisting of alginate/calcium gel particles appear promising. Staphylococcal virulent phages seem to be excellent biocontrol agents, being harmless and infecting specifically a given bacterial species. Having confirmed the efficacy of two phage cocktails, the use of the phage product could help decreasing the risk of emergence of phage resistant bacteria. Furthermore, undertaking a constant update of the phage cocktail could also help reducing contamination caused by S. aureus and thereby preserving safety and food quality.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles / Malgré la pasteurisation obligatoire du lait de consommation et la mise en place de bonnes pratiques de fabrication et d'hygiène dans les usines de transformation laitière, certains microorganismes résistants à la chaleur ou issus de phénomènes de post-contamination peuvent se retrouver dans les produits laitiers transformés et s'y développer. En plus d'entraîner des pertes alimentaires et économiques en raison du non-respect des normes microbiologiques ou des diverses altérations occasionnées, les microorganismes associés aux produits laitiers non-conformes et/ou atypiques (PL-NC/AT) constituent une préoccupation majeure pour les industries laitières en raison de leur capacité potentielle à former des biofilms sur les surfaces et à résister à certains désinfectants et antibiotiques. Ce projet de recherche visait à isoler, identifier et caractériser les microorganismes provenant de PL-NC/AT afin de bâtir une collection microbienne documentée de référence. En collaboration avec plusieurs industries laitières et fromagères, 105 souches de bactéries, levures et moisissures problématiques, issues de différents PL-NC/AT (lait, crème, crème glacée et fromages), ont été isolées par culture et identifiées par MALDI-TOF ou séquençage. La caractérisation de cette diversité d'isolats a permis de mettre en évidence que la majorité de ces souches étaient sensibles à un traitement de chaleur équivalent à une pasteurisation, suggérant que ces microorganismes auraient été réintroduits dans les produits laitiers par post-contamination. Près de 25 souches bactériennes se sont d'ailleurs révélées être d'importantes productrices de biofilms en microplaques de 96 puits et 13 de ces souches ont démontré une résistance élevée à un traitement de 5 minutes à l'acide peracétique (100 ppm) et à l'hypochlorite de sodium (70 ppm) en microplaques MBEC. De plus, 56 isolats bactériens ont présenté une résistance contre l'ampicilline, la fosfomycine et/ou la ceftriaxone. Ces nouvelles connaissances pourront guider et mener à l'élaboration de mesures innovantes dans le contrôle et la prévention des contaminations microbiologiques dans l'industrie laitière. / Despite the mandatory pasteurization of fluid milk and the implementation of good manufacturing and hygiene practices in dairy processing plants, some heat-resistant microorganisms or other microorganisms resulting from post-pasteurization contamination can be found in processed dairy products. In addition to causing food and economic losses due to spoilage or non-compliance with microbiological standards, microorganisms associated with non-compliant and/or atypical dairy products (NC/AT-DP) are a major concern for dairy industries due to their potential ability to form biofilms and to resist to some disinfectants and antimicrobial agents. The objective of this project was to isolate, identify and characterize microorganisms from NC/AT-DP to create a documented microbial collection. In collaboration with several dairy and cheese industries, 105 strains of problematic bacteria, yeasts, and molds from various NC/AT-DP (milk, cream, ice cream and cheese) were isolated by culture and identified by MALDI-TOF or sequencing. The characterization of these isolates demonstrated that most of the strains were sensitive to a heat treatment equivalent to pasteurization, suggesting that these microorganisms would have been reintroduced into dairy products by post- pasteurization contamination. Nearly 25 bacterial strains have also shown to be moderate or strong biofilm-producers in 96-well microplates and 13 of these strains have demonstrated a high resistance to a 5-minute treatment with peracetic acid (100 ppm) and sodium hypochlorite (70 ppm) in MBEC microplates. In addition, 56 bacterial isolates showed resistance against ampicillin, fosfomycin and/or ceftriaxone. These results will guide and may lead to the development of new strategies to control and prevent microbiological contamination in the dairy sector.

Thèse en cotutelle : Université Laval, Québec, Canada et Université de Lille, Lille, France / L'industrie laitière revêt une importance primordiale au sein du secteur agroalimentaire, constituant 20% de l'ensemble des industries agroalimentaires. Le fromage, en tant que produit phare de la transformation du lait, occupe une position prédominante, particulièrement en France et au Québec. La demande croissante des consommateurs pour des produits naturels et sains, associée à la nécessité de prolonger la durée de conservation des fromages, pousse les professionnels du secteur à adopter des pratiques de « clean label » et à développer des techniques de biopréservation, pour préserver la qualité des produits tout en répondant aux préoccupations sanitaires et de naturalité. Les écosystèmes fromagers abritent une grande diversité microbienne, qui participe à leur typicité, et représentent une opportunité de découvrir des candidats potentiels pour la biopréservation. L'isolement de souches possédant une activité antimicrobienne dans le fromage devient de plus en plus intéressant, notamment pour l'inhibition des microorganismes d'altération et/ou pathogènes. Dans ce projet, deux fromages artisanaux français, le Carré du Vinage et la Bourle Roncquoise, et deux fromages québécois, un cheddar et un fromage à croûte lavée, ont été sélectionnés. La caractérisation globale du microbiote des fromages français a été réalisée en utilisant des méthodes moléculaires, afin de déterminer leur typicité et leur diversité microbiologique. Grâce à un isolement systématique des microorganismes de ces fromages, un total de 830 isolats bactériens et fongiques ont pu être caractérisés pour leurs activités antimicrobiennes sur gélose double couche. L'activité antifongique a été testée contre trois levures et quatre moisissures indésirables et l'activité antibactérienne, contre neuf bactéries pathogènes ou d'altération. Les 36 isolats fromagers ayant démontré une capacité d'inhibition vis-à-vis des différents contaminants ont été identifiés par séquençage du gène de l'ARNr 16S (bactéries) ou des régions ITS (Internal Transcribed Spacer) (levures). Parmi ces isolats, les levures *Metschnikowia pulcherrima* LMA-2038 du Carré du Vinage, et *Trichosporon asahii* LMA-810 de la Rose Blanche ont montré des activités à la fois antifongiques (contre *Yarrowia lipolytica*, *Rhodotorula mucilaginosa*, *Cladosporium cladosporioides* et *Penicillium commune*) et antibactériennes (contre *Listeria innocua* et *Clostridium tyrobutyricum*). Leur potentiel comme agent de biopréservation a été testé dans des fromages modèles. Leur ajout a significativement diminué la croissance des deux levures contaminantes *Y. lipolytica* et *R. mucilaginosa*. Des tests de caractérisation des potentiels composés antimicrobiens ont été réalisés afin de mieux comprendre la nature des molécules impliquées dans ces activités antagonistes. Ces travaux confirment que les fromages sont des réservoirs potentiels de souches antimicrobiennes qui pourraient servir comme agent de biopréservation et participer au développement d'outils pour répondre au « clean label ». / The dairy industry is a major sector of the agri-food industry, representing 20% of the total agri-food industry. Cheese, as the primary product of milk transformation, holds a significant position, particularly in France and Quebec. The increasing consumer demand for natural and healthy products, coupled with the need to extend the shelf life of cheeses, is driving industry professionals to adopt "clean label" practices and develop biopreservation techniques to preserve product quality while addressing health and naturalness concerns. Cheese ecosystems host a diverse microbial population that contributes to their typicity and offer an opportunity to discover potential candidates for biopreservation. The isolation of strains with antimicrobial activity from cheese has become increasingly interesting, especially for inhibiting spoilage and/or pathogenic microorganisms. In this project, two artisanal French cheeses and two Quebec cheeses were selected. The overall characterization of the microbiota in French cheeses was conducted using molecular methods to visualize their uniqueness and microbial diversity. Through systematic isolation of microorganisms from these cheeses, a total of 830 isolates comprised of bacteria, yeasts, and molds were characterized for their antimicrobial activities on double-layer agar. Antifungal activity was tested against three undesirable yeasts and four molds, while antibacterial activity was tested against nine pathogenic or spoilage bacteria. Among these, 36 cheese isolates demonstrating inhibition capacity against various contaminants were identified by DNA sequencing of the 16S rRNA (bacteria) or ITS (yeasts) regions. Among them, the yeasts *Metschnikowia pulcherrima* LMA-2038 from "Carré du Vinage" and *Trichosporon asahii* LMA-810 from "Rose Blanche" exhibited both antifungal activity (against *Yarrowia lipolytica*, *Rhodotorula mucilaginosa*, *Cladosporium cladosporioides*, and Penicillium commune) and antibacterial activity (against *Listeria innocua* and *Clostridium tyrobutyricum*). Their potential as biopreservation agents was tested in model cheeses, significantly reducing the growth of the two contaminating yeasts, *Y lipolytica* and *R. mucilaginosa*. Characterization tests of potential biopreservation compounds were conducted to better understand the nature of the molecules involved in these antagonistic activities. These findings confirm that cheeses are potential reservoirs of antimicrobial strains that could serve as biopreservation agents and contribute to the development of tools to meet the "clean label" requirements.

Dans presque tous les environnements, les microorganismes cohabitent avec d'autres microorganismes. Cette coexistence donne lieu à des interactions qui peuvent jouer un rôle crucial dans l'altération et la préservation des produits laitiers. Cependant, ces interactions microbiennes et leurs rôles dans la détérioration des produits laitiers restent mal connus. De plus, le manque de méthodes expérimentales à haut débit limite notre capacité à explorer les interactions microbiennes pour des applications alimentaires. L'objectif de ces travaux était de développer de nouvelles approches systémiques pour caractériser des cultures d'intérêt laitier ainsi que leurs interactions écologiques et fonctionnelles. Pour ce faire, des méthodes à haut débit ont été développées à l'aide d'une plateforme automatisée et de l'analyse d'image pour cartographier les interactions microbiennes de l'environnement laitier. Les résultats de ces travaux ont démontré que les approches de culture à haut débit sont robustes pour quantifier les interactions microbiennes écologiques et fonctionnelles. Il a été montré que les interactions microbiennes pouvaient engendrer de la résilience chez les bactéries lactiques face au stress. À grande échelle, et dans un contexte de diversité microbienne élevée, il a été démontré que les interactions microbiennes dépendent largement des souches et ne peuvent être généralisées. Un total de 1142 interactions bidirectionnelles entre des microorganismes de l'environnement laitier a été cartographié. La directionnalité, la force et les types d'interactions écologiques variaient en fonction de l'origine d'isolement des souches. Tandis que la coopération prédominait parmi les microorganismes isolés du fromage, l'exploitation demeurait le type d'interaction privilégié chez les microorganismes issus du lait cru. Les souches coopérantes avaient, en moyenne, des comportements écologiques plus similaires que les souches concurrentes, ce qui suggère l'existence de cliques microbiennes. De plus, certaines souches ayant la capacité d'influencer la croissance globale de la communauté microbienne ont été identifiées. Par ailleurs, un nouveau phénotype d'interaction a été rapporté pour la première fois entre *Pseudomonas aeruginosa* AN63 et *Lactococcus cremoris* ATCC 19257, cette dernière produisant un pigment rose rouge lorsqu'elle est en interaction avec *Pseudomonas aeruginosa* AN63. De manière globale, ces résultats offrent un portrait inédit des relations sociales entre les microorganismes de l'environnement laitier. Le jumelage des profils écologiques et fonctionnels apporte une nouvelle perspective au criblage des cultures d'intérêt pour les produits laitiers. La méthode développée et le jeu de données attenant ouvrent de nouvelles perspectives sur l'identification de combinaisons de souches ayant des comportements souhaitables pour diverses applications et d'éviter celles qui pourraient entraîner des problèmes de qualité. Par exemple, des consortiums de cultures bio-protectrices capables de prolonger naturellement la durée de conservation des produits laitiers pourraient être développés. À long terme, les résultats de cette étude pourraient contribuer à la réduction du gaspillage alimentaire. / In almost all environments, microorganisms coexist with other microorganisms. This coexistence leads to interactions that can play a crucial role in both the spoilage and preservation of dairy products. However, these microbial interactions and their roles in the deterioration of dairy products remain poorly understood. Furthermore, the lack of high-throughput experimental methods limits our ability to explore microbial interactions for food applications. The objective of this study was to develop new systemic approaches to characterize dairy-related cultures, as well as their ecological and functional interactions. To achieve this, high-throughput methods were developed using an automated platform and image analysis to map microbial interactions in the dairy environment. The results of this work demonstrated that high-throughput culturing approaches are robust for quantifying ecological and functional microbial interactions. It was shown that microbial interactions can confer resilience to lactic acid bacteria under stress. On a large scale, and in a context of high microbial diversity, microbial interactions were found to be largely strain-dependent and cannot be generalized. A total of 1142 bidirectional interactions between microorganisms from the dairy environment were mapped. The directionality, strength, and types of ecological interactions varied depending on the strains' isolation sources. While cooperation predominated among microorganisms isolated from cheese, exploitation remained the preferred type of interaction for microorganisms from raw milk. Cooperative strains exhibited, on average, more similar ecological behaviors than competitive strains, suggesting the existence of microbial cliques. Additionally, some strains capable of influencing the overall growth of the microbial community were identified. Furthermore, a new interaction phenotype was reported for the first time between *Pseudomonas aeruginosa* AN63 and *Lactococcus cremoris* ATCC 19257, the latter producing a red-pink pigment when interacting with *Pseudomonas aeruginosa* AN63. Overall, these results provide a novel perspective on the social relationships between microorganisms in the dairy environment. The developed method and the accompanying dataset open new avenues for identifying combinations of strains with desirable behaviors for various applications, while avoiding those that could lead to quality issues. For instance, bio-protective culture consortia capable of naturally extending the shelf life of dairy products could be developed. In the long term, the findings of this study could contribute to reducing food waste.

Les fromages abritent des consortiums microbiens complexes où les ferments lactiques et d'affinage contribuent au développement de qualités organoleptiques optimales. Le microbiote naturel, non inoculé délibérément, participe également à la typicité des fromages. Le lait et les environnements de transformation sont des sources potentielles pour le microbiote naturel, mais les actions de nettoyage et d'assainissement peuvent affecter ce microbiote bénéfique. Malgré des recherches portées sur le microbiote de laits, d'environnements de transformation et de fromages, il est difficile de déterminer le degré de contribution de ces sources ainsi que les variations microbiologiques saisonnières du lait sur le microbiote naturel. Dans la littérature, l'efficacité des traitements d'assainissement a surtout été mesurée sur les microorganismes indésirables tels que les agents d'altérations ou pathogènes. Pour mieux comprendre l'origine du microbiote naturel de quatre fromages cheddar et de quatre fromages à croûte lavée, leurs profils microbiens, ainsi que ceux de leurs environnements et des laits, ont été caractérisés à l'automne 2021 et à l'été 2022. Les résultats ont montré que les ferments *Lactococcus* spp. et *Streptococcus* spp., ainsi que les cultures d'affinage prédominaient dans les fromages cheddars affinés. Le microbiote naturel comportait des bactéries lactiques (Non-Starters Lactic Acid Bacteria [NSLAB]), notamment le genre *Lacticaseibacillus* provenant du lait. De plus, les ferments lactiques utilisés lors de la transformation ont été détectés dans les échantillons de la salle de production, suggérant un transfert des ferments du fromage vers l'environnement de transformation. Pour les fromages à croûte lavée, les ferments *Lactococcus* spp. et *Streptococcus* spp. prédominaient aussi dans la pâte, tandis que les cultures d'affinages *Staphylococcus* spp., *Glutamicibacter* spp. et *Brevibacterium* spp. prédominaient sur la croûte. Parmi les mycètes, la culture d'affinage *Geotrichum* spp. était majoritaire à la fois dans la pâte et sur la croûte. Le microbiote bactérien naturel de la croûte était composé de bactéries halophiles ou psychrotrophes provenant de la saumure et de la chambre d'affinage. Le mycobiote naturel incluait principalement *Penicillium* spp. et *Yarrowia* spp., également issus de la chambre d'affinage. Finalement, la sensibilité de sept souches bactériennes participant à l'affinage des fromages à croûte lavée face à l'acide peracétique et au chlore a été mesurée. Les essais quantitatifs en suspension ont montré que l'acide peracétique avait un effet bactéricide plus important que l'hypochlorite de sodium. De plus, des différences significatives de sensibilité étaient observées entre les souches face à l'hypochlorite de sodium, *Cobetia marina* (LMA-1370) et *Corynebacterium casei* (LMA-1345) étant les plus sensibles, et *Staphylococcus equorum* (LMA-1258) la moins sensible. Cette étude améliore la compréhension des sources du microbiote naturel des fromages cheddar et à croûte lavée du terroir québécois. Elle met en lumière l'importance du microbiote environnemental, en particulier dans les chambres d'affinage, et les défis liés aux pratiques d'assainissement. Enfin, les résultats ont été partagés avec les fromageries partenaires, leur fournissant ainsi un outil précieux pour mieux comprendre le microbiote de leurs installations. / Cheeses contain complex microbial consortia, where starters and ripening cultures ensure optimal organoleptic qualities. Natural microbiota not deliberately inoculated also contributes to cheese typicity. The milk and processing environments are potential sources of natural microbiota, but cleaning and sanitizing actions can affect this beneficial microbiota. Despite research into the microbiota of milks, processing environments and cheeses, it is difficult to determine the degree to which sources of positive contamination and seasonal microbiological variations in milk contribute to the natural microbiota. Lastly, the effectiveness of sanitation treatments has mainly been measured on undesirable microorganisms, such as spoilage agents or pathogens. To better understand the origin of the natural microbiota of four cheddar cheeses and four washed-rind cheeses, their microbial profiles, along with those of their environments and the milk, were characterized in fall 2021 and summer 2022. The results showed that *Lactococcus* and *Streptococcus* starters, and adjunct cultures, predominated in mature cheddar cheeses. The natural microbiota included Non-Starter Lactic Acid Bacteria (NSLAB), particularly the *Lacticaseibacillus* genus from milk. In addition, starters used during processing were detected in samples from the production room, suggesting a transfer of starters from the cheese to the processing environment. For smear-ripened cheeses, the starters *Lactococcus* spp. and *Streptococcus* spp. predominated in the core, while the ripening cultures *Staphylococcus* spp., *Glutamicibacter* spp. and *Brevibacterium* spp. predominated on the rind. Among fungi, the ripening culture *Geotrichum* predominated both in the core and on the rind. The natural bacterial microbiota of the rind was composed of halophilic and psychrotrophic bacteria originating from the brine and the ripening room. Natural mycobiota included mainly *Penicillium* spp. and *Yarrowia* spp., also from the ripening room. Finally, the sensitivity of seven bacterial strains involved in the ripening of smear-ripened cheeses to peracetic acid and sodium hypochlorite was measured. Quantitative suspension tests showed that peracetic acid had a greater bactericidal effect than sodium hypochlorite. In addition, significant differences in sensitivity were observed between strains to sodium hypochlorite, with *Cobetia marina* (LMA-1370) and *Corynebacterium casei* (LMA-1345) as the most sensitive, and *Staphylococcus equorum* (LMA-1258) as the least sensitive. This study improves our understanding of the sources of the natural microbiota of Quebec cheddar and smear-ripened cheeses. It highlights the importance of environmental microbiota, particularly in ripening rooms, and the challenges associated with sanitation practices. Finally, the results were shared with the partner cheese dairies, providing them with a valuable tool for better understanding the microbiota in their facilities.

Une analyse microbiologique détaillée a été réalisée sur 111 échantillons provenant de lait cru de vache de fromageries artisanales du Québec. Parmi les analyses effectuées, on note le compte des bactéries mésophiles, des bactéries psychrophiles, des coliformes, de Staphylococcus aureus et une analyse détaillée des levures et moisissures (L&M). Les échantillons provenaient de 13 fromageries et ont été récoltés pendant sept mois, entre février et octobre 2009. Un effet de terroir, de race, de production biologique et de lieu géographique a aussi été mesuré. Au total, 505 isolats de L&M ont été prélevés du lait cru ainsi que 103 isolats de L&M ont été prélevés de fromages en cours d'affinage. Après analyse, 82 espèces de L&M ont été identifiées. Pour quatre fromageries, une analyse plus détaillée a été réalisée au niveau des L&M. Chacune des quatre fromageries a montré un profil de L&M unique, tant au niveau quantitatif qu'au niveau des espèces dominantes. Une analyse génétique a été réalisée sur 13 isolats appartenant à l'espèce Issatchenkia orientalis et provenant d'échantillons de laits crus ou de fromages. Les isolats ont été différenciés à l'aide du «Multilocus sequence typing» (MLST). Une persistance des souches dans le temps a pu être observée pour une même fromagerie, tandis qu'il y avait une diversité observable parmi les six fromageries analysées. Finalement, différentes capacités technologiques ont été mesurées sur six isolats appartenant à l'espèce Galactomyces geotrichum et comparées à une souche industrielle de la même espèce. La vitesse de croissance, la tolérance au sel, la protéolyse, la lipolyse et l'utilisation du lactate ont été mesurés afin de déterminer si les souches isolées du lait de terroir ont un potentiel d'application industrielle.