Submitted by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2017-11-08T12:07:50Z No. of bitstreams: 1 LeanePerimRodriguesDissertacao2017.pdf: 2016012 bytes, checksum: e7e5d2c10971d922d61bf00b6b50f5da (MD5) / Approved for entry into archive by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2017-11-08T12:08:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 LeanePerimRodriguesDissertacao2017.pdf: 2016012 bytes, checksum: e7e5d2c10971d922d61bf00b6b50f5da (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-08T12:08:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LeanePerimRodriguesDissertacao2017.pdf: 2016012 bytes, checksum: e7e5d2c10971d922d61bf00b6b50f5da (MD5) Previous issue date: 2017-03-20 / Myelofibrosis is a hematological disease inserted in the group of myeloproliferative neoplasias. It has as main characteristic fibrosis of the bone marrow, consequence of a variety of histological changes presented in the medullary microenvironment. The pathophysiology of myelofibrosis involves the activation of signal transduction pathways and nowadays several mutations such as JAK2V617F, CalR and MPL have been associated with this process. Recent studies have shown that microvesicles produced by body cells may be associated with the cellular communication process. These microvesicles carry in their content proteins, lipids and RNA capable of regulating diverse cellular processes. The literature shows that several miRNAs present in the microvesucular content can regulate the hematopoiesis of normal stem cells and also of compromised progenitors, having an important role in the pathogenesis of some acquired hematological neoplasias such as myeloproliferative diseases. With the objective of investigating the presence of specific miRNAs in microvesicles excreted in the peripheral blood plasma of patients with myelofibrosis, microvesicles were isolated from the plasma by ultracentrifugation and by means of molecular biology techniques it was possible to validate the presence of these microbes. Real-time PCR assays were performed to evaluate the expression of specific miRNAs (miR-146b, miR-221, miR-143 and miR-150) in the microvesic contents. In order to analyze the functional activity of MVs, the cell migration assay was performed, aiming at the progression of pathology and tumor invasiveness. The results show that there is no increase in the microvesicular concentration in peripheral blood when comparing the group of patients with the control group. The data found show that miR-146b and miR-150 are differentially expressed in patients with myelofibrosis, being little expressed. However, miR-221 and miR-143 didn???t show amplification in the technique, which leads to the conclusion that these miRNAs are specific to the medullary microenvironment or aren???t released in the microvesicular content. Regarding the migration test, the result shows that there was no influence of the microvesicles in the process of cell proliferation and migration and it can be considered that the microvesicles isolated in our study may not present this role because they are not exclusively of the bone marrow environment. As future prospects, assays with microvesicles removed from the bone marrow can be performed. / A Mielofibrose ?? uma doen??a hematol??gica inserida no grupo de neoplasias mieloproliferativas. Possui como principal caracter??stica a fibrose da medula ??ssea, consequ??ncia de uma variedade de mudan??as histol??gicas apresentadas no microambiente medular. A fisiopatog??nese da Mielofibrose envolve a ativa????o de vias de transdu????o de sinais e nos ??ltimos anos v??rias muta????es como a JAK2V617F, a CalR e a MPL foram associadas a doen??a. Estudos recentes demonstraram que microves??culas produzidas por c??lulas do organismo podem estar associadas ao processo de comunica????o celular. Estas microves??culas transportam em seu conte??do prote??nas, lip??dios e RNA capazes de regular variados processos celulares. A literatura mostra que diversos miRNAs presentes no conte??do microvesucular podem regular a hematopoiese de c??lulas-tronco normais e tamb??m de progenitores comprometidos, tendo um papel importante na patog??nese de algumas neoplasias hematol??gicas adquiridas como as doen??as mieloproliferativas. Com objetivo de investigar a presen??a de miRNAs espec??ficos em microves??culas excretadas no plasma de sangue perif??rico de pacientes portadores de mielofibrose, microves??culas foram isoladas do plasma por m??todo de ultracentrifuga????o e por meio de t??cnicas de biologia molecular foi poss??vel confirmar a presen??a destas. Ensaios com PCR em tempo real foram realizados afim de avaliar a express??o de miRNAs espec??ficos (miR-146b, miR-221, miR-143 e miR-150) no conte??do das microves??culas e para analisar a atividade funcional das M.Vs foi realizado o ensaio de migra????o celular que visa avaliar progress??o da patologia e a invasividade tumoral. Os resultados obtidos mostram que n??o h?? aumento da concentra????o microvesicular em sangue perif??rico quando comparado o grupo de pacientes com o grupo controle. Os dados encontrados mostram que o miR-146b e o miR-150 apresentam-se diferencialmente expressos em pacientes com mielofibrose, com pouca express??o. J?? o miR-221 e o miR-143 n??o apresentaram detec????o na t??cnica, o que o que leva a concluir que estes miRNAs s??o pr??prios do microambiente medular ou n??o s??o liberados no conte??do microvesicular. Quanto a ensaio de migra????o o resultado mostra que n??o houve influ??ncia das microves??culas no processo de prolifera????o e migra????o celular e pode ser considerado que as microves??culas isoladas em nosso estudo podem n??o apresentar este papel por n??o serem exclusivamente do ambiente medular. Como perspectivas futuras, ensaios com microves??culas retiradas da medula ??ssea poder??o ser realizados.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-06-30 / Objetivos: Descrever as alteracoes cromossomicas em policitemia vera (PV), trombocitemia essencial (TE) e mielofibrose primaria (MF). Verificar se a taxa de anormalidades cromossomicas e ampliada pela FISH nos casos com cariotipo normal e ausencia de metafases. Detectar a incidencia da mutacao JAK2 V617F em PV, TE e MF; de mutacoes no exon 12 do JAK2 em PV e de mutacoes MPL W515K/L em TE e MF. Correlacionar as alteracoes citogeneticas e moleculares encontradas com o grau de fibrose medular nos casos de MF; numero de leucocitos, plaquetas, hemoglobinas; e idade, ao diagnostico, em todos pacientes. Metodo: O estudo foi realizado em 20 casos de PV, 17 de TE e 21 de MF. O cariotipo por banda G foi realizado em amostras de medula ossea, semeadas em cultura de curta duracao (24h), sem mitogenos e processadas de forma habitual (Chauffaille, 2006). Parte da amostra (1mL) foi destinada a FISH, com sondas para as regioes: 20q12, 20q13.12, 13q14.3, 13qter (subtelomerica), 8p11.1-q11.1 (ƒ¿-satellite) e 9q12 (satellite III). A pesquisa das mutacoes JAK2V617F e MPL W515K/L foi realizada em DNA de sangue periferico, por PCR em tempo real, utilizando-se o kit JAK2 MutaScreenTM (Ipsogen). A pesquisa de mutacoes no exon 12 do JAK2 foi realizada por sequenciamento direto. Resultados: As alteracoes cromossomicas foram observadas em 11,8% das PV, 17,6% das MF e nenhuma das TE, nao havendo relacao entre dados clinicos avaliados e alteracoes cromossomicas. As anormalidades cromossomicas nao foram ampliadas pela FISH. JAK2 V617F foi observada em 90% das PV, 42,8% das MF e 47% das TE. Os pacientes com PV JAK2 V617F negativos apresentaram menores niveis de plaquetas em relacao aos PV V617F positivos (p<0,0001). MF V617F positivos apresentaram maiores graus de fibrose do que os V617F negativos (p=0,003). Nao foi detectada a presenca de mutacoes no exon 12 do JAK2 em pacientes com PV. MPL W515L foi observada em um caso de MF e em um de TE. Nao foi encontrada a mutacao MPL W515K nos pacientes com TE e MF. A paciente com TE MPL W515L positivo nao apresentou quadro clinico diferente dos demais pacientes com TE, enquanto que a paciente com MF MPL W515L positivo apresentou quadro clinico mais agressivo quando comparada aos demais pacientes com MF. O numero de alteracoes clonais nao mostrou diferenca quanto aos dados clinicos avaliados. Conclusoes: Os diferentes tipos de alteracoes clonais em neoplasias mieloproliferativas exaltam seus diferentes mecanismos fisiopatogenicos, auxiliando no diagnostico e compreensao da biologia destas doencas. Este estudo permitiu a caracterizacao citogenetica e molecular de PV, MF e TE. / Introcuction: Polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET) and myelofibrosis (MF) are clonal disorders of hematopoietic stem cell and clinical and biological aspects have in common that hinder their diagnosis, however, cytogenetic and molecular studies represent important tools to assist in this procedure. Therefore, the investigation of the presence of JAK2 V617F, mutations in exon 12 of JAK2, MPL W515K of MPLW515L and cytogenetic alterations per karyotype and FISH can provide a more detailed view for the diagnosis and prognosis of these diseases. In this study such cytogenetic and molecular changes were correlated with degree of fibrosis in cases of MF, the number of leukocytes, platelets, hemoglobin and age at diagnosis in PV, ET and MF Method: The karyotype by G-band was performed on samples of bone marrow, grown in culture for short duration (24h) without mitogens and processed as usual (Chauffaille, 2006). The sample (1 ml) was intended to FISH with probes for the regions: 20q12, 20q13.12, 13q14.3, 13qter, 8p11.1-q11.1 and 9q12. The investigation of JAK2 V617F and MPL W515K/L mutations was performed on DNA from peripheral blood by real time PCR, using the kit MutaScreenTM JAK2 (IPSOGEN). The search for mutations in exon 12 of JAK2 was performed by direct sequencing. Results: Chromosomal abnormalities were observed in 11.8% of PV, 17.6% of MF and none of the ET, no relation between clinical data and assessed chromosomal alterations. Chromosomal abnormalities were not amplified by FISH. JAK2 V617F was observed in 90% of PV, 42.8% of MF and 47% of ET. Patients with JAK2 V617F negative PV showed lower levels of platelets in relation to V617F positive PV (p <0.0001). MF V617F negative and MPL W515L positive showed higher degrees of fibrosis than V617F negative (p =0.003). Was not detected the presence of mutations in exon 12 of JAK2 in PV patients. MPL W515L was observed in a case of MF and a TE. No MPL W515K mutation was found in patients with ET and MF. The ET patient MPL W515L positive showed no clinical different from other patients with ET, whereas the patient with MF MPL W515L showed positive clinical more aggressive when compared to other patients with MF. The number of clonal abnormalities showed no difference in the clinical data evaluated. Conclusions: Different types of clonal abnormalities in myeloproliferative neoplasms exalt their different pathophysiological mechanism, aiding in the diagnosis and understanding of the biology of these diseases. This study allowed the cytogenetics and molecular characterization of PV, MF and ET. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

As neoplasias mieloproliferativas (NMP) são doenças hematológicas caracterizadas pela proliferação aumentada e acúmulo de células mieloides maduras de uma ou mais séries hematopoéticas: granulocítica, eritrocítica, megacariocítica ou mastocítica. Os pacientes com NMP podem apresentar mutações como a JAK2V617F, MPL e CALR, cujas descrições foram fundamentais para o início da elucidação da fisiopatologia das NMP. As células neoplásicas das NMP apresentam resistência à apoptose e proliferação celular exacerbada. Sabe-se ainda que essas doenças são consideradas oncoinflamatórias e pré-leucêmicas. Apesar de todos esses conhecimentos sobre os mecanismos moleculares e celulares envolvidos na patogênese das NMP, não há até a presente data tratamentos eficazes que curam ou alteram a história natural de progressão dessas desordens para LMA. Pelo exposto, foi aqui investigada a potencial participação dos membros da via de sinalização Hippo na fisiopatologia das NMP BCR-ABL1 negativas mais frequentes, a policitemia vera (PV), trombocitemia essencial (TE) e mielofibrose primária (MF). A via de sinalização Hippo foi descrita como supressora de tumor e é uma das responsáveis pela regulação da proliferação, diferenciação e morte celular. Foi analisada, ainda nesse estudo, a correlação dos níveis de expressão dos genes da via Hippo com o perfil de citocinas plasmáticas dos pacientes com PV, TE e MF, a associação com o \"status mutacional\" e com a expressão dos genes que regulam a apoptose celular pela via intrínseca. Os principais achados nos pacientes com PV foram a diminuição da expressão dos genes supressores de tumor LATS2, MST1 e MST2 acompanhada pela presença de elevada concentração de citocinas pró-inflamatórias e fenótipo de resistência a apoptose. Na TE, os dados relevantes foram a detecção da diminuição da expressão dos genes supressores de tumor LATS1, LATS2 MST1 e SAV1, e o observação da relação entre alta expressão dos genes SAV1 e MOB1B e a mutação da CALR. Em MF destaca-se a redução da expressão dos genes SAV1 e TAZ da via de sinalização Hippo e do gene AURKB do ciclo celular. Em conclusão, os dados indicam que a diminuição da expressão dos genes supressores de tumor da via Hippo contribui para a fisiopatologia e para o fenótipo de resistência das células neoplásicas à apoptose das NMP. / Myeloproliferative neoplasms (MPN) are hematological disorders characterized by increased proliferation of mature myeloids cells of one or more hematopoietic series: granulocytic, erythrocytic, megakaryocytic or mastocytic. Patients with MPN may present mutations such as JAK2V617F, MPL and CALR, which were essential descriptions for the beginning of pathophysiological elucidation of MPN. The NMP neoplastic cells show resistance to apoptosis and exacerbated cell proliferation. It is known that these entities are considered also oncoinflamatory and pre-leukaemic. Despite all this knowledge about the molecular and cellular mechanisms involved in the pathogenesis of MPN, there are no effective treatments that cure or alter the natural history of progression of these disorders to AML. For the above, a participatory potential of the Hippo signaling pathway members in the pathophysiology of the most frequent negative BCR-ABL1 MPN, the polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET) and primary myelofibrosis (PMF) were investigated. The Hippo signaling pathway has been described as tumor suppressor and is responsible for the regulation of proliferation, differentiation and cell death. The correlation analysis of the expression levels of the Hippo pathway genes with the plasma cytokine profile of patients with PV, ET and PMF, the association with the mutational status and the expression of the genes that regulate intrinsic cellular apoptosis were performed. The main findings in patients with PV were decreased expression of the tumor suppressor genes LATS2, MST1 and MST2 accompanied by the presence of high concentration of proinflammatory cytokines and phenotype of resistance to apoptosis. In ET, relevant data were the detection of decreased expression of the tumor suppressor genes LATS1, LATS2 MST1 and SAV1, and the observation of the relationship between high expression of the SAV1 and MOB1B genes and the mutation of the CALR. In PMF, stands out the reduction of the SAV1 and TAZ gene expression of the Hippo signaling pathway and the AURKB gene of the cell cycle. In conclusion, the data indicate that decreased expression of the tumor suppressor genes of the Hippo pathway contributes to the pathophysiology and neoplastic cell resistance phenotype to the apoptosis of MPN.

Doenças Mieloproliferativas Crônicas são desordens hematológicas malignas caracterizadas pela alteração na célula-tronco hematopoética e independência ou hipersensibilidade dos progenitores hematopoéticos a citocinas. Em 2008 a OMS renomeou esse grupo como Neoplasias Mieloproliferativas (NMPs), no qual estão inclusas as entidades nosológicas Policitemia Vera (PV), Trombocitemia Essencial (TE) e Mielofibrose Primária (MFP), doenças alvo desse estudo. Apesar dos avanços no diagnóstico das NMPs e nos mecanismos envolvidos com a fisiopatologia dessas doenças, sua patogênese permanece desconhecida. Alterações na maquinaria apoptótica parecem estar envolvidas em na fisiopatologia das NMP e por isso a compreensão dos mecanismos de regulação da apoptose e a interferência das galectinas-1 e 3 nesse processo, em pacientes com NMPs, é relevante para a busca de novos alvos terapêuticos. Neste contexto, os objetivos deste trabalho foram: avaliar em leucócitos de sangue periférico e células tronco hematopoéticas CD34+ de medula óssea dos pacientes com PV, TE e MFP os níveis de expressão das LGALS1 e LGALS3 e a concentração de galectina-3 plasmática. Foram determinadas as correlações dos níveis de expressão de LGALS1 e LGALS3 e da concentração da galectina-3 plasmática com os níveis de expressão do RNAm das moléculas reguladoras da apoptose e com os dados clínico-laboratoriais dos pacientes como a concentração de hemoglobina, percentagem de hematócrito, porcentagem de alelos mutados JAK2V617F, contagem de leucócitos e esplenomegalia. A expressão de LGALS1 estava diminuída em células CD34+ em PV e MFP e em leucócitos de sangue periférico de pacientes com MFP. Os pacientes de TE apresentaram aumento na expressão de LGALS3 em leucócitos de sangue periférico e alta concentração de galectina-3 no plasma. Houve correlação entre os níveis de expressão de LGALS1 e a porcentagem de alelos mutados e a contagem de leucócitos, em pacientes com PV. Foi detectada a correlação entre os níveis de expressão de LGALS3 a porcentagem de alelos mutados e o tamanho do baço, em pacientes com MFP. Com relação aos genes reguladores da apoptose, foram observadas correlações entre os níveis de expressão de LGALS1 e BCL-2 em células CD34+ de pacientes PV e entre LGALS3 e A1, MCL-1, BAX e C-FLIP em leucócitos de de pacientes com TE. Os resultados obtidos indicam que as NPM apresentam expressão diferencial de LGALS1 e LGALS3 e sugerem a associação entre a expressão de galectinas e o status da mutação JAK2V617F, principalmente em pacientes com MFP / Chronic myeloproliferative diseases are haematological malignant disorders characterized by the presence of an altered haematopoietic stem cell and independence or hypersensibility of their hematopoietic progenitors to cytokines. In 2008, WHO renamed this group of diseases as Myeloproliferative Neoplasms (MPN) in which is included Polycythemia Vera (PV), Essential Thrombocythemia (ET) and Primary Myelofibrosis (PMF). There have been advances concerning the knowledge about the mechanisms involved in MPN pathophysiology, however their pathogenesis remains unknow. Deregulation in apoptotic machinery seems to be involved in MPN pathophysiology. Fully understanding of apoptotic machinery and the influence of galectin-1 and 3 in this process in NMP patients might unveil novel targets for manipulation. The aims of the present study were to evaluate in leukocytes and CD34+ hematopoietic stem cells from PV, ET and PMF patients the LGALS1 and LGALS3 expression levels, the Galectin-3 plasma levels and to correlate LGALS1 and LGALS3 expression levels with galectin-3 plasma levels, apoptosis-related genes expression, JAK2 mutation status and clinic-laboratorial parameters. PV and PMF patients showed decreased expression levels of LGALS1 in CD34+ cells and also decreased LGALS1 expression levels in PMF leukocytes. ET patients presented an increased expression level of galectin-3 in leukocytes and plasma. We detected the correlations between LGALS3 gene expression with JAK2 allele burden and with leukocytes number in PV patients. We also observed in PMF patients the correlation between LGALS3 expression levels with JAK2 allele burden and spleen size. We also detected the correlation between LGALS1 expression levels BCL-2 gene expression in PV CD34+ HSC cells and between LGALS3 expression and A1, MCL-1, BAX and C-FLIP gene expression in TE leukocytes. Taken together, the results suggest the LGALS1and LGALS3 differential expression in NMP and the relation between JAK2V617F status with galectins expression, especially in PMF patients.

As neoplasias mieloproliferativas (NMPs) negativas para o rearranjo t(9;22)/BCRABL1, incluindo Policitemia Vera (PV), Trombocitemia Essencial (TE) e Mielofibrose Primária (MFP), são doenças hematopoéticas clonais e estão frequentemente associadas à mutação JAK2V617F. Apesar dos avanços no conhecimento da fisiopatologia após a descoberta da mutação JAK2V617F e do desenvolvimento de inibidores da JAK2, o tratamento permanece não curativo. Sabe-se que as célulastronco mais primitivas nas NMPs são responsáveis pela iniciação da doença e que a expansão dos precursores mieloeritróides contribui para o fenótipo clínico. Dados recentes obtidos com ensaios in vitro mostram que as proteínas da família BCL2, reguladoras da apoptose mitocondrial, desempenham um papel relevante na patogênese das NMPs. Acreditamos que a expressão anômala de BCL2 nas células progenitoras hematopoéticas (CPH) das NMPs pode contribuir para a patogênese desse grupo de doenças. Avaliamos a expressão gênica, por meio de PCR em Tempo Real, da família BCL2 (genes antiapoptóticos BCL-xL e BCL2 e o pró-apoptótico BIM) nas diferentes subpopulações de progenitores hematopoéticos murinos (de um modelo condicional knockin de expressão heterozigótica condicional da Jak2V617F) e de pacientes portadores de NMPs bem como sua contribuição para o fenótipo da doença e resposta ao inibidores da JAK2 (com a droga ruxolitinibe) e/ou inibição da família BCL2 (com o inibidor de BCL2 obatoclax). Não encontramos diferença de expressão basal dos genes BCL2, BCL-xL e BIM nas células CD34+ bem como nas subpopulações de células CD34+38-/+ de pacientes com NMPs, independente da presença da mutação JAK2V617F, em relação às células CD34+ e subpopulações CD34+38-/+ dos controles (p>0.05). Nas células CD34+ de pacientes com TE encontramos aumento de expressão de BCL2 em relação às células CD34+ pacientes com MFP (p=0.03). No modelo transgênico de camundongos Jak2 wt/VF (que apresentam uma NMP semelhante à PV) e Jak2 wt/wt (controles), comparamos a expressão diferencial dos genes da família Bcl2 em precursores hematopoéticos imaturos (LSKs) e progenitores mieloides mais maduros (MPs). A expressão do BclxL em MPs de camundongos wt/VF foi maior em relação à subpopulação de células LSKs e em relação as duas subpopulações de células dos controles (p=0.0011). Não houve diferença significativa de expressão do Bcl2 nas subpopulações de células LSKs e MPs de animais wt/VF e wt/wt (p=0.12). Observou-se menor expressão de Bim em LSKs em relação às células MPs dos animais mutados (p=0.026), diferença essa não observada entre os controles Jak2 wt/wt. O tratamento isolado com inibidor de JAK2 ou de BCL2 resultou em aumento de expressão do Bim nas CPH (LSKs e MPs) de camungongos Jak2 wt/VF em relação aos animais Jak2 wt/wt. Este aumento da expressão de Bim foi ainda mais evidente após o tratamento das células com a combinação das duas drogas quando comparadas às células não tratadas ou tratadas com um dos dois inibidores, sendo maior em animais doentes do que em animais controles (p<0.0001). A análise do efeito do tratamento com os inibidores de JAK2 e BCL2 na indução de apoptose por meio de citometria de fluxo (marcação com anexina/7-AAD) revelou que as células LSKs foram mais resistentes à apoptose tardia do que as células MPs independentemente da mutação da JAK2 (p<0.05). O tratamento com obatoclax resultou em indução de apoptose diferentemente do que foi observado com o tratamento com ruxolitinibe (p=0.594) nas células MPs de animais Jak2 wt/VF. Ademais, o tratamento combinado com ruxolitinibe e obatoclax resultou no aumento da apoptose nas células MPs dos animais com fenótipo de PV (Jak2 wt/VF) em relação aos animais Jak2 wt/wt (p=0.05). Em conclusão, demonstramos que a resistência à apoptose nas NMPs ocorre desde as CPH iniciadoras da doença. Nossos resultados sugerem que a modulação da apoptose mitocondrial pode ser uma nova estratégia terapêutica para pacientes com NMP em combinação aos inibidores de JAK2, na medida em que atua tanto nas CPH que iniciam a doença como nos MPs, responsáveis pelos sinais e sintomas de mieloproliferação. / Myeloproliferative Neoplasms (MPNs) negative for t(9;22)/BCR-ABL1 rearrangement, including Polycythemia Vera (PV), Essential Thrombocythemia (ET) and Primary Myelofibrosis (PMF), are clonal hematopoietic diseases and are often associated with the JAK2V617F mutation. Despite advances in the pathophysiology knowledge after the discovery of the JAK2V617F mutation and the development of JAK2 inhibitors, treatment remains non-curative. It is known that MPN primitive stem cells are essential for the initiation of the disease and that the expansion of the myeloeritroid precursors contributes to the clinical phenotype. Recent data, obtained with in vitro assays, showed that BCL2 family proteins, regulators of mitochondrial apoptosis, play a relevant role in the pathogenesis of MPNs. We believe that the anomalous expression of BCL2 in hematopoietic progenitor cells (HPCs) of MPNs may contribute to their pathogenesis. We evaluated BCL2 family (antiapoptotic genes BCL-xL and BCL2 and the pro-apoptotic BIM) gene expression by real-time PCR in different subpopulations of hematopoietic progenitors from a conditional Jak2V617F knockin murine model and from patients with MPNs as well as their contribution to the disease phenotype and response to JAK2 inhibitors (with ruxolitinib) and/or to the inhibition of the BCL2 family (with the BH3-mimetic obatoclax). We found no difference in the basal expression of the BCL2, BCL-xL and BIM in CD34+ cells as well as in subpopulations of CD34+ 38-/+ cells from patients with MPNs, regardless of the presence of the JAK2V617F mutation. In CD34+ cells obtained from patients with ET, we found an increase of BCL2 expression when compared to CD34+ cells with PMF (p=0.03). In the Jak2 wt/VF transgenic mice (that develop a MPN similar to PV) and Jak2 wt/wt controls, we compared the differential expression of Bcl2 family genes in immature hematopoietic precursors (LSKs) and more mature myeloid progenitors (MPs). Expression of Bcl-xL in MPs of wt/VF mice was greater when compared to LSKs and to the two progenitor subpopulations of control cells (p=0.0011). There was no significant difference in Bcl2 expression between the subpopulations of LSKs and MPs from wt/VF and wt/wt animals (p=0.12). Lower Bim expression in LSKs than in MPs was observed in samples from JAK2-mutated animals (p=0.026). Such difference was not observed between the Jak2 wt/wt subpopulations. Treatment with JAK2 or BCL2 inhibitors alone resulted in increased Bim expression in LSKs and MPs of the Jak2 wt/VF mice when compared to Jak2 wt/wt animals. This increase in Bim expression was even more evident when these cells were treated with the combination of the two drugs as compared to single treatment with one of the two inhibitors, being higher in mutaded than control animals (p<0.0001). The analysis of apoptosis by flow cytometry (annexin / 7-AAD labeling) revealed that LSK cells were more resistant to late apoptosis than MP cells regardless of the JAK2 mutation (p<0.05). Treatment with obatoclax resulted in greater apoptosis induction than it was observed with ruxolitinib treatment (p=0.594) on MP cells of Jak2 wt/VF animals. In addition, the combined treatment with ruxolitinib and obatoclax resulted in increased apoptosis in MP cells of animals with the PV phenotype (Jak2 wt/VF) as compared to the Jak2 wt/wt animals (p=0.05). In conclusion, we demonstrated that resistance to apoptosis in MPNs occurs at the level of the hematopoietic progenitors that initiate the disease. Our results suggest that modulation of mitochondrial apoptosis may be a new therapeutic strategy for MPN patients in combination with JAK2 inhibitors, as it acts on both the disease initiating and more mature progenitors, responsible for the clinical findings of myeloproliferation.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-02-15T17:10:47Z No. of bitstreams: 1 renatamendesdefreitas.pdf: 1082430 bytes, checksum: 17933c41d6c615bede876aefdcce85ef (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-02-26T12:27:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 renatamendesdefreitas.pdf: 1082430 bytes, checksum: 17933c41d6c615bede876aefdcce85ef (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-26T12:27:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 renatamendesdefreitas.pdf: 1082430 bytes, checksum: 17933c41d6c615bede876aefdcce85ef (MD5) Previous issue date: 2014-02-21 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As Neoplasias Mieloproliferativas são originadas por uma proliferação clonal de um progenitor hematopoético. Descrita inicialmente em 1951 como “Doenças Mieloproliferativas” e reavaliada pela Organização Mundial da Saúde em 2011, as Neoplasias Mieloproliferativas agrupam a Policitemia Vera, Trombocitemia Essencial e Miefibrose Primária em um subgrupo chamado de BCR-ABL negativo. De acordo com a revisão dos critérios adotados para o diagnóstico das Neoplasias Mieloproliferativas a presença da mutação JAK2 V617F é considerada critério de maior importância para o diagnóstico do subgrupo BCR-ABL negativo representando um marcador clonal. A Policitemia Vera é principalmente diagnosticada por um aumento na massa eritrocitária independente de fator estimulante, aumento de leucócitos no sangue periférico, esplenomegalia e trombocitose. Ocorre, geralmente, em homens e mulheres com faixa etária de 60 anos, com incidência de 0,7 a 2,6/100.000 habitantes/ano. A mutação V617F no gene JAK2 produz uma proteína alterada que ativa constitutivamente a via JAK-STAT e outras vias downstream de modo que, as proteínas de ativação transcricional e transdutoras de sinal (STAT do inglês Signal Transducerand Activator of Transcription) são fosforiladas posteriormente impactando na expressão de genes envolvidos na regulação da apoptose e proteínas regulatórias, além de alterar a taxa de proliferação das células hematopoéticas. Neste trabalho foram selecionados 26 pacientes com Policitemia Vera, os quais foram atendidos na cidade de Juiz de Fora, Minas Gerais. Foram realizadas análises de mutações no gene JAK2 a partir do material genético isolado do sangue periférico. Os dados clínicos de cada paciente foram relacionados entre si e correlacionados com os dados moleculares. / Myeloproliferative neoplasms (MPN) are caused by a clonal proliferation of a hematopoietic progenitor. First described in 1951 as “Myeloproliferative Diseases” and reevaluated by the World Health Organization in 2011 (WHO, 2011), the Myeloproliferative Neoplasms gather the Polycythemia Vera, Essential Thrombocythemia and Primary Mielofibrose in a subgroup called negative BCR-ABL. According to WHO the revised diagnosis criteria for myeloproliferative neoplasms, the presence of JAK2 V617F mutation, is considered the most important criterion for the diagnosis of negative BCR-ABL subgroup representing a clonal marker. The Polycythemia Vera is primarily diagnosed by an independent stimulating factor in red cells mass increasing, followed by an increase of leukocytes in peripheral blood, spleen and thrombocytosis. It usually occurs in men and women of all age groups with higher incidence in 60-year-old patients ranging from 0.7 to 2.6/ 100.000 hab/year. The V617F mutation in the JAK2 gene produces an altered protein that activates constitutively the JAK-STAT pathway and other pathways downstream as a result the protein transcriptional activation and signal transduction (STAT) are subsequently phosphorylated causing impact in the expression of genes involved in regulation of apoptosis and regulatory proteins, as well as altering the rate of proliferation of hematopoietic cells. In this study 26 patients with Polycythemia Vera were selected in Juiz de Fora, Minas Gerais. The peripheral blood was used for genetic material isolation (JAK2 mutation). The clinical data of each patient were related to each other and correlated with the molecular data.

As neoplasias mieloproliferativas (NMPs) negativas para o rearranjo t(9;22)/BCRABL1, incluindo Policitemia Vera (PV), Trombocitemia Essencial (TE) e Mielofibrose Primária (MFP), são doenças hematopoéticas clonais e estão frequentemente associadas à mutação JAK2V617F. Apesar dos avanços no conhecimento da fisiopatologia após a descoberta da mutação JAK2V617F e do desenvolvimento de inibidores da JAK2, o tratamento permanece não curativo. Sabe-se que as célulastronco mais primitivas nas NMPs são responsáveis pela iniciação da doença e que a expansão dos precursores mieloeritróides contribui para o fenótipo clínico. Dados recentes obtidos com ensaios in vitro mostram que as proteínas da família BCL2, reguladoras da apoptose mitocondrial, desempenham um papel relevante na patogênese das NMPs. Acreditamos que a expressão anômala de BCL2 nas células progenitoras hematopoéticas (CPH) das NMPs pode contribuir para a patogênese desse grupo de doenças. Avaliamos a expressão gênica, por meio de PCR em Tempo Real, da família BCL2 (genes antiapoptóticos BCL-xL e BCL2 e o pró-apoptótico BIM) nas diferentes subpopulações de progenitores hematopoéticos murinos (de um modelo condicional knockin de expressão heterozigótica condicional da Jak2V617F) e de pacientes portadores de NMPs bem como sua contribuição para o fenótipo da doença e resposta ao inibidores da JAK2 (com a droga ruxolitinibe) e/ou inibição da família BCL2 (com o inibidor de BCL2 obatoclax). Não encontramos diferença de expressão basal dos genes BCL2, BCL-xL e BIM nas células CD34+ bem como nas subpopulações de células CD34+38-/+ de pacientes com NMPs, independente da presença da mutação JAK2V617F, em relação às células CD34+ e subpopulações CD34+38-/+ dos controles (p>0.05). Nas células CD34+ de pacientes com TE encontramos aumento de expressão de BCL2 em relação às células CD34+ pacientes com MFP (p=0.03). No modelo transgênico de camundongos Jak2 wt/VF (que apresentam uma NMP semelhante à PV) e Jak2 wt/wt (controles), comparamos a expressão diferencial dos genes da família Bcl2 em precursores hematopoéticos imaturos (LSKs) e progenitores mieloides mais maduros (MPs). A expressão do BclxL em MPs de camundongos wt/VF foi maior em relação à subpopulação de células LSKs e em relação as duas subpopulações de células dos controles (p=0.0011). Não houve diferença significativa de expressão do Bcl2 nas subpopulações de células LSKs e MPs de animais wt/VF e wt/wt (p=0.12). Observou-se menor expressão de Bim em LSKs em relação às células MPs dos animais mutados (p=0.026), diferença essa não observada entre os controles Jak2 wt/wt. O tratamento isolado com inibidor de JAK2 ou de BCL2 resultou em aumento de expressão do Bim nas CPH (LSKs e MPs) de camungongos Jak2 wt/VF em relação aos animais Jak2 wt/wt. Este aumento da expressão de Bim foi ainda mais evidente após o tratamento das células com a combinação das duas drogas quando comparadas às células não tratadas ou tratadas com um dos dois inibidores, sendo maior em animais doentes do que em animais controles (p<0.0001). A análise do efeito do tratamento com os inibidores de JAK2 e BCL2 na indução de apoptose por meio de citometria de fluxo (marcação com anexina/7-AAD) revelou que as células LSKs foram mais resistentes à apoptose tardia do que as células MPs independentemente da mutação da JAK2 (p<0.05). O tratamento com obatoclax resultou em indução de apoptose diferentemente do que foi observado com o tratamento com ruxolitinibe (p=0.594) nas células MPs de animais Jak2 wt/VF. Ademais, o tratamento combinado com ruxolitinibe e obatoclax resultou no aumento da apoptose nas células MPs dos animais com fenótipo de PV (Jak2 wt/VF) em relação aos animais Jak2 wt/wt (p=0.05). Em conclusão, demonstramos que a resistência à apoptose nas NMPs ocorre desde as CPH iniciadoras da doença. Nossos resultados sugerem que a modulação da apoptose mitocondrial pode ser uma nova estratégia terapêutica para pacientes com NMP em combinação aos inibidores de JAK2, na medida em que atua tanto nas CPH que iniciam a doença como nos MPs, responsáveis pelos sinais e sintomas de mieloproliferação. / Myeloproliferative Neoplasms (MPNs) negative for t(9;22)/BCR-ABL1 rearrangement, including Polycythemia Vera (PV), Essential Thrombocythemia (ET) and Primary Myelofibrosis (PMF), are clonal hematopoietic diseases and are often associated with the JAK2V617F mutation. Despite advances in the pathophysiology knowledge after the discovery of the JAK2V617F mutation and the development of JAK2 inhibitors, treatment remains non-curative. It is known that MPN primitive stem cells are essential for the initiation of the disease and that the expansion of the myeloeritroid precursors contributes to the clinical phenotype. Recent data, obtained with in vitro assays, showed that BCL2 family proteins, regulators of mitochondrial apoptosis, play a relevant role in the pathogenesis of MPNs. We believe that the anomalous expression of BCL2 in hematopoietic progenitor cells (HPCs) of MPNs may contribute to their pathogenesis. We evaluated BCL2 family (antiapoptotic genes BCL-xL and BCL2 and the pro-apoptotic BIM) gene expression by real-time PCR in different subpopulations of hematopoietic progenitors from a conditional Jak2V617F knockin murine model and from patients with MPNs as well as their contribution to the disease phenotype and response to JAK2 inhibitors (with ruxolitinib) and/or to the inhibition of the BCL2 family (with the BH3-mimetic obatoclax). We found no difference in the basal expression of the BCL2, BCL-xL and BIM in CD34+ cells as well as in subpopulations of CD34+ 38-/+ cells from patients with MPNs, regardless of the presence of the JAK2V617F mutation. In CD34+ cells obtained from patients with ET, we found an increase of BCL2 expression when compared to CD34+ cells with PMF (p=0.03). In the Jak2 wt/VF transgenic mice (that develop a MPN similar to PV) and Jak2 wt/wt controls, we compared the differential expression of Bcl2 family genes in immature hematopoietic precursors (LSKs) and more mature myeloid progenitors (MPs). Expression of Bcl-xL in MPs of wt/VF mice was greater when compared to LSKs and to the two progenitor subpopulations of control cells (p=0.0011). There was no significant difference in Bcl2 expression between the subpopulations of LSKs and MPs from wt/VF and wt/wt animals (p=0.12). Lower Bim expression in LSKs than in MPs was observed in samples from JAK2-mutated animals (p=0.026). Such difference was not observed between the Jak2 wt/wt subpopulations. Treatment with JAK2 or BCL2 inhibitors alone resulted in increased Bim expression in LSKs and MPs of the Jak2 wt/VF mice when compared to Jak2 wt/wt animals. This increase in Bim expression was even more evident when these cells were treated with the combination of the two drugs as compared to single treatment with one of the two inhibitors, being higher in mutaded than control animals (p<0.0001). The analysis of apoptosis by flow cytometry (annexin / 7-AAD labeling) revealed that LSK cells were more resistant to late apoptosis than MP cells regardless of the JAK2 mutation (p<0.05). Treatment with obatoclax resulted in greater apoptosis induction than it was observed with ruxolitinib treatment (p=0.594) on MP cells of Jak2 wt/VF animals. In addition, the combined treatment with ruxolitinib and obatoclax resulted in increased apoptosis in MP cells of animals with the PV phenotype (Jak2 wt/VF) as compared to the Jak2 wt/wt animals (p=0.05). In conclusion, we demonstrated that resistance to apoptosis in MPNs occurs at the level of the hematopoietic progenitors that initiate the disease. Our results suggest that modulation of mitochondrial apoptosis may be a new therapeutic strategy for MPN patients in combination with JAK2 inhibitors, as it acts on both the disease initiating and more mature progenitors, responsible for the clinical findings of myeloproliferation.

Doenças Mieloproliferativas Crônicas são desordens hematológicas malignas caracterizadas pela alteração na célula-tronco hematopoética e independência ou hipersensibilidade dos progenitores hematopoéticos a citocinas. Em 2008 a OMS renomeou esse grupo como Neoplasias Mieloproliferativas (NMPs), no qual estão inclusas as entidades nosológicas Policitemia Vera (PV), Trombocitemia Essencial (TE) e Mielofibrose Primária (MFP), doenças alvo desse estudo. Apesar dos avanços no diagnóstico das NMPs e nos mecanismos envolvidos com a fisiopatologia dessas doenças, sua patogênese permanece desconhecida. Alterações na maquinaria apoptótica parecem estar envolvidas em na fisiopatologia das NMP e por isso a compreensão dos mecanismos de regulação da apoptose e a interferência das galectinas-1 e 3 nesse processo, em pacientes com NMPs, é relevante para a busca de novos alvos terapêuticos. Neste contexto, os objetivos deste trabalho foram: avaliar em leucócitos de sangue periférico e células tronco hematopoéticas CD34+ de medula óssea dos pacientes com PV, TE e MFP os níveis de expressão das LGALS1 e LGALS3 e a concentração de galectina-3 plasmática. Foram determinadas as correlações dos níveis de expressão de LGALS1 e LGALS3 e da concentração da galectina-3 plasmática com os níveis de expressão do RNAm das moléculas reguladoras da apoptose e com os dados clínico-laboratoriais dos pacientes como a concentração de hemoglobina, percentagem de hematócrito, porcentagem de alelos mutados JAK2V617F, contagem de leucócitos e esplenomegalia. A expressão de LGALS1 estava diminuída em células CD34+ em PV e MFP e em leucócitos de sangue periférico de pacientes com MFP. Os pacientes de TE apresentaram aumento na expressão de LGALS3 em leucócitos de sangue periférico e alta concentração de galectina-3 no plasma. Houve correlação entre os níveis de expressão de LGALS1 e a porcentagem de alelos mutados e a contagem de leucócitos, em pacientes com PV. Foi detectada a correlação entre os níveis de expressão de LGALS3 a porcentagem de alelos mutados e o tamanho do baço, em pacientes com MFP. Com relação aos genes reguladores da apoptose, foram observadas correlações entre os níveis de expressão de LGALS1 e BCL-2 em células CD34+ de pacientes PV e entre LGALS3 e A1, MCL-1, BAX e C-FLIP em leucócitos de de pacientes com TE. Os resultados obtidos indicam que as NPM apresentam expressão diferencial de LGALS1 e LGALS3 e sugerem a associação entre a expressão de galectinas e o status da mutação JAK2V617F, principalmente em pacientes com MFP / Chronic myeloproliferative diseases are haematological malignant disorders characterized by the presence of an altered haematopoietic stem cell and independence or hypersensibility of their hematopoietic progenitors to cytokines. In 2008, WHO renamed this group of diseases as Myeloproliferative Neoplasms (MPN) in which is included Polycythemia Vera (PV), Essential Thrombocythemia (ET) and Primary Myelofibrosis (PMF). There have been advances concerning the knowledge about the mechanisms involved in MPN pathophysiology, however their pathogenesis remains unknow. Deregulation in apoptotic machinery seems to be involved in MPN pathophysiology. Fully understanding of apoptotic machinery and the influence of galectin-1 and 3 in this process in NMP patients might unveil novel targets for manipulation. The aims of the present study were to evaluate in leukocytes and CD34+ hematopoietic stem cells from PV, ET and PMF patients the LGALS1 and LGALS3 expression levels, the Galectin-3 plasma levels and to correlate LGALS1 and LGALS3 expression levels with galectin-3 plasma levels, apoptosis-related genes expression, JAK2 mutation status and clinic-laboratorial parameters. PV and PMF patients showed decreased expression levels of LGALS1 in CD34+ cells and also decreased LGALS1 expression levels in PMF leukocytes. ET patients presented an increased expression level of galectin-3 in leukocytes and plasma. We detected the correlations between LGALS3 gene expression with JAK2 allele burden and with leukocytes number in PV patients. We also observed in PMF patients the correlation between LGALS3 expression levels with JAK2 allele burden and spleen size. We also detected the correlation between LGALS1 expression levels BCL-2 gene expression in PV CD34+ HSC cells and between LGALS3 expression and A1, MCL-1, BAX and C-FLIP gene expression in TE leukocytes. Taken together, the results suggest the LGALS1and LGALS3 differential expression in NMP and the relation between JAK2V617F status with galectins expression, especially in PMF patients.

As células Natural Killer (NK), quando estimuladas por meio de seus receptores, rapidamente produzem citocinas e quimiocinas, incluindo IFN?, TNF?, TGF?, GMCSF, MIP1?, MIP1?, IL-10 e outras, as quais podem afetar a função de outras células hematopoéticas. Considerando as evidências recentes de que as célulastronco hematopoéticas (CTH) respondem diretamente à sinalização de várias citocinas, acreditamos que a produção de citocinas mediada pelas células NK possa regular a função da CTH e que a sua desregulação possa favorecer a transformação maligna. As neoplasias mieloproliferativas (NMP) negativas para o rearranjo t(9;22)/BCR-ABL1, incluindo as entidades Policitemia Vera (PV), Trombocitemia Essencial (TE) e Mielofibrose Primária (MFP), são doenças hematopoéticas originadas de alteração clonal da CTH, e podem servir de modelo para o estudo dessa regulação NK-CTH. Além de mutações que ativam vias de proliferação e sobrevivência celular, como a mutação JAK2V617F, presente em mais da metade das NMP, outros mecanismos contribuem para a patogênese e manutenção da doença, tais como mutações adicionais e regulação da hematopoese neoplásica pelo microambiente da medula óssea. Este último inclui não apenas células do estroma, mas também células do sistema imune. Dessa forma, com objetivo de investigar a potencial contribuição das células NK para a patogênese das NMP, caracterizamos células do sangue periférico de pacientes com NMP do Ambulatório de Hematologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, bem como células esplênicas obtidas de animais de um modelo murino condicional knockin de expressão heterozigótica da Jak2V617F (Jak2VF) quanto à frequência, expressão de receptores e função das células NK. Observamos menor porcentagem de células NK e maior expressão do receptor inibitório NKG2A nos animais Jak2 wt/VF. Pacientes portadores de NMP apresentaram número absoluto de células NK-CD16+ reduzido em relação aos controles saudáveis. O número de células NK-CD16+ foi menor na MFP em relação aos controles e à TE, particularmente naqueles portadores da mutação JAK2V617F. Encontramos menor expressão do receptor de ativação NKG2D nos portadores de PV positivos para a mutação JAK2V617F. Houve menor expressão do receptor de ativação NKp46 nos portadores de NMP, particularmente nos portadores da mutação JAK2V617F, e nos pacientes com MFP. Observamos também menor expressão do receptor NKG2A nos portadores de TE negativos para a mutação JAK2V617F. Em concordância com a redução de células NK, a porcentagem de linfócitos totais mostrou-se reduzida nos pacientes com NMP, particularmente nos portadores de MFP, independentemente da mutação JAK2V617F. Encontramos redução percentual e absoluta do subtipo de células NK CD56brightCD16- (cuja principal função é secretória) nos pacientes com NMP, especialmente na presença da mutação JAK2V617F, nos pacientes com PV e MFP, e menor frequência absoluta do subtipo CD56-CD16bright (com função primariamente citotóxica) nos portadores de MFP. Em contraste, não verificamos deficiência citotóxica das células NK dos animais Jak2 wt/VF em relação aos controles Jak2 wt/wt. Adicionalmente, as células NK dos animais Jak2-mutados demonstraram menor capacidade de secreção da citocina MIP-1?, reconhecida por regular a função de CTH, em relação aos animais controle. Finalmente, houve expressão significativamente aumentada do gene MyD88 nos animais mutados em relação aos controles, sugerindo que a via de sinalização dos receptores do tipo Toll (TLR) pode estar envolvida na regulação NKCTH nas NMP. Em resumo, detectamos deficiência numérica e funcional de células NK em células primárias murinas e humanas de NMP. Nossos achados sugerem potencial regulação da hematopoese maligna pelas células NK nestas neoplasias e podem contribuir para a identificação de novas estratégias terapêuticas que possam interferir nesta complexa interação. / Natural Killer (NK) cells, when stimulated by their receptors, rapidly produce cytokines and chemokines, including IFN?, TNF?, TGF?, GM-CSF, MIP1?, MIP1?, IL-10 and others, which may affect the function of other hematopoietic cells. Considering the recent evidence that hematopoietic stem cells (HSC) directly respond to cytokine signaling, we hypothesized that NK cells mediated cytokine production can regulate HSC function and that their dysregulation may favor malignant transformation. BCR-ABL1-negative myeloproliferative neoplasms (MPN), including Polycythemia Vera (PV), Essential Thrombocythemia (ET) and Primary Myelofibrosis (PMF), are hematopoietic diseases originated from HSC clonal transformation, and thus can serve as a model for studying this NK-HSC regulation. In addition to mutations that activate cell proliferation and survival pathways, such as the JAK2V617F mutation, present in more than half of MPN cases, other mechanisms contribute to the pathogenesis and maintenance of the disease, such as additional mutations and regulation of neoplastic hematopoiesis by the bone marrow microenvironment. This latter includes not only stromal cells but also cells of the immune system. Therefore, in order to investigate the potential contribution of NK cells to the pathogenesis of MPN, we characterized the frequency, receptor expression and function of NK cells from patients with MPN from the Clinical Hospital of the Medical School of Ribeirão Preto, University of São Paulo, as well as from splenic cells obtained from animals of a conditional knockin murine model of Jak2V617F heterozigous expression. Lower percentage of NK cells and higher NKG2A inhibitory receptor expression was observed in Jak2 wt/VF animals as compared to Jak2 wt/wt controls. In agreement, patients with MPN presented reduced absolute numbers of NK-CD16+ cells when compared to healthy controls. The number of NKCD16+ cells was lower in the PMF than in controls or ET patients, particularly in those bearing the JAK2V617F mutation. We found lower expression of the NKG2D activatory receptor in PV patients with the JAK2V617F mutation. There was lower expression of the NKp46 activatory receptor in MPN patients, particularly in those with the JAK2V617F mutation, and in PMF patients. We also observed reduced expression of the NKG2A receptor in non-JAK2 mutated ET patients. In agreement with the NK cell reduction, the percentage of total lymphocytes was reduced in patients with MPN, particularly in PMF, regardless of the JAK2V617F mutation. We found an absolute decrease of the CD56brightCD16- NK subtype (whose main function is secretory) in patients with MPN, especially when the JAK2V617F mutation was present, in patients with PV and PMF. Also, lower absolute frequency of CD56-CD16bright NK subtype (primarily cytotoxic) was found in PMF patients. In contrast, we did not find cytotoxic deficiency in the Jak2 wt/VF NK cells as compared to the Jak2 wt/wt controls. In addition, Jak2-mutated NK cells presented reduced ability of secreting the cytokine MIP-1?, known to regulate HSC function. Finally, there was significantly increased expression of the MyD88 gene in the Jak2-mutated animals as compared to controls, suggesting that the Toll-like receptors (TLR) signaling pathway may be involved in NK-HSC regulation in MPN. In summary, we detected numerical and functional deficiency of NK cells in murine and human primary cells of MPN. Our findings suggest a potential regulation of malignant hematopoiesis by NK cells in these neoplasms and may contribute to the identification of new therapeutic strategies that may target this complex interaction.

As células Natural Killer (NK), quando estimuladas por meio de seus receptores, rapidamente produzem citocinas e quimiocinas, incluindo IFN?, TNF?, TGF?, GMCSF, MIP1?, MIP1?, IL-10 e outras, as quais podem afetar a função de outras células hematopoéticas. Considerando as evidências recentes de que as célulastronco hematopoéticas (CTH) respondem diretamente à sinalização de várias citocinas, acreditamos que a produção de citocinas mediada pelas células NK possa regular a função da CTH e que a sua desregulação possa favorecer a transformação maligna. As neoplasias mieloproliferativas (NMP) negativas para o rearranjo t(9;22)/BCR-ABL1, incluindo as entidades Policitemia Vera (PV), Trombocitemia Essencial (TE) e Mielofibrose Primária (MFP), são doenças hematopoéticas originadas de alteração clonal da CTH, e podem servir de modelo para o estudo dessa regulação NK-CTH. Além de mutações que ativam vias de proliferação e sobrevivência celular, como a mutação JAK2V617F, presente em mais da metade das NMP, outros mecanismos contribuem para a patogênese e manutenção da doença, tais como mutações adicionais e regulação da hematopoese neoplásica pelo microambiente da medula óssea. Este último inclui não apenas células do estroma, mas também células do sistema imune. Dessa forma, com objetivo de investigar a potencial contribuição das células NK para a patogênese das NMP, caracterizamos células do sangue periférico de pacientes com NMP do Ambulatório de Hematologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, bem como células esplênicas obtidas de animais de um modelo murino condicional knockin de expressão heterozigótica da Jak2V617F (Jak2VF) quanto à frequência, expressão de receptores e função das células NK. Observamos menor porcentagem de células NK e maior expressão do receptor inibitório NKG2A nos animais Jak2 wt/VF. Pacientes portadores de NMP apresentaram número absoluto de células NK-CD16+ reduzido em relação aos controles saudáveis. O número de células NK-CD16+ foi menor na MFP em relação aos controles e à TE, particularmente naqueles portadores da mutação JAK2V617F. Encontramos menor expressão do receptor de ativação NKG2D nos portadores de PV positivos para a mutação JAK2V617F. Houve menor expressão do receptor de ativação NKp46 nos portadores de NMP, particularmente nos portadores da mutação JAK2V617F, e nos pacientes com MFP. Observamos também menor expressão do receptor NKG2A nos portadores de TE negativos para a mutação JAK2V617F. Em concordância com a redução de células NK, a porcentagem de linfócitos totais mostrou-se reduzida nos pacientes com NMP, particularmente nos portadores de MFP, independentemente da mutação JAK2V617F. Encontramos redução percentual e absoluta do subtipo de células NK CD56brightCD16- (cuja principal função é secretória) nos pacientes com NMP, especialmente na presença da mutação JAK2V617F, nos pacientes com PV e MFP, e menor frequência absoluta do subtipo CD56-CD16bright (com função primariamente citotóxica) nos portadores de MFP. Em contraste, não verificamos deficiência citotóxica das células NK dos animais Jak2 wt/VF em relação aos controles Jak2 wt/wt. Adicionalmente, as células NK dos animais Jak2-mutados demonstraram menor capacidade de secreção da citocina MIP-1?, reconhecida por regular a função de CTH, em relação aos animais controle. Finalmente, houve expressão significativamente aumentada do gene MyD88 nos animais mutados em relação aos controles, sugerindo que a via de sinalização dos receptores do tipo Toll (TLR) pode estar envolvida na regulação NKCTH nas NMP. Em resumo, detectamos deficiência numérica e funcional de células NK em células primárias murinas e humanas de NMP. Nossos achados sugerem potencial regulação da hematopoese maligna pelas células NK nestas neoplasias e podem contribuir para a identificação de novas estratégias terapêuticas que possam interferir nesta complexa interação. / Natural Killer (NK) cells, when stimulated by their receptors, rapidly produce cytokines and chemokines, including IFN?, TNF?, TGF?, GM-CSF, MIP1?, MIP1?, IL-10 and others, which may affect the function of other hematopoietic cells. Considering the recent evidence that hematopoietic stem cells (HSC) directly respond to cytokine signaling, we hypothesized that NK cells mediated cytokine production can regulate HSC function and that their dysregulation may favor malignant transformation. BCR-ABL1-negative myeloproliferative neoplasms (MPN), including Polycythemia Vera (PV), Essential Thrombocythemia (ET) and Primary Myelofibrosis (PMF), are hematopoietic diseases originated from HSC clonal transformation, and thus can serve as a model for studying this NK-HSC regulation. In addition to mutations that activate cell proliferation and survival pathways, such as the JAK2V617F mutation, present in more than half of MPN cases, other mechanisms contribute to the pathogenesis and maintenance of the disease, such as additional mutations and regulation of neoplastic hematopoiesis by the bone marrow microenvironment. This latter includes not only stromal cells but also cells of the immune system. Therefore, in order to investigate the potential contribution of NK cells to the pathogenesis of MPN, we characterized the frequency, receptor expression and function of NK cells from patients with MPN from the Clinical Hospital of the Medical School of Ribeirão Preto, University of São Paulo, as well as from splenic cells obtained from animals of a conditional knockin murine model of Jak2V617F heterozigous expression. Lower percentage of NK cells and higher NKG2A inhibitory receptor expression was observed in Jak2 wt/VF animals as compared to Jak2 wt/wt controls. In agreement, patients with MPN presented reduced absolute numbers of NK-CD16+ cells when compared to healthy controls. The number of NKCD16+ cells was lower in the PMF than in controls or ET patients, particularly in those bearing the JAK2V617F mutation. We found lower expression of the NKG2D activatory receptor in PV patients with the JAK2V617F mutation. There was lower expression of the NKp46 activatory receptor in MPN patients, particularly in those with the JAK2V617F mutation, and in PMF patients. We also observed reduced expression of the NKG2A receptor in non-JAK2 mutated ET patients. In agreement with the NK cell reduction, the percentage of total lymphocytes was reduced in patients with MPN, particularly in PMF, regardless of the JAK2V617F mutation. We found an absolute decrease of the CD56brightCD16- NK subtype (whose main function is secretory) in patients with MPN, especially when the JAK2V617F mutation was present, in patients with PV and PMF. Also, lower absolute frequency of CD56-CD16bright NK subtype (primarily cytotoxic) was found in PMF patients. In contrast, we did not find cytotoxic deficiency in the Jak2 wt/VF NK cells as compared to the Jak2 wt/wt controls. In addition, Jak2-mutated NK cells presented reduced ability of secreting the cytokine MIP-1?, known to regulate HSC function. Finally, there was significantly increased expression of the MyD88 gene in the Jak2-mutated animals as compared to controls, suggesting that the Toll-like receptors (TLR) signaling pathway may be involved in NK-HSC regulation in MPN. In summary, we detected numerical and functional deficiency of NK cells in murine and human primary cells of MPN. Our findings suggest a potential regulation of malignant hematopoiesis by NK cells in these neoplasms and may contribute to the identification of new therapeutic strategies that may target this complex interaction.