A presença de cultivares indesejáveis em lotes de linhagens de milho não é tolerada, pois compromete a eficiência da multiplicação subsequente para a produção comercial de sementes. A detecção das sementes contaminantes é realizada através de testes para determinação da pureza varietal e/ou genética, os quais, geralmente, são baseados em marcadores morfológicos e bioquímicos. Devido à importância dessa determinação, métodos alternativos eficientes vêm sendo avaliados e, entre esses merecem destaque os baseados em polimorfismo de DNA, visando a obtenção de informações mais consistentes. Nesse sentido, esta pesquisa teve como objetivo principal a comparação da eficiência de marcadores morfológicos e microssatélites para avaliação de pureza varietal de linhagens de milho e a determinação do grau de sensibilidade da técnica de microssatélites para detectar a ocorrência de genótipos contaminantes em lotes de sementes. Utilizaram-se quatro linhagens (L1, L2, L3 e L4) fornecidas pela Dow AgroSciences Ltda., misturadas duas a duas, para a obtenção de níveis de contaminação de 0, 1, 2, 5, 10 e 100%. L1 e L3 foram consideradas linhagens puras, enquanto L2 e L4 foram tratadas como genótipos contaminantes. A avaliação mediante o uso de marcadores morfológicos foi realizada utilizando-se descritores para sementes, plântulas e plantas em diferentes estádios de desenvolvimento. Na técnica de microssatélites utilizaram-se iniciadores específicos para amplificar DNA isolado a partir de amostras constituídas por 100 sementes ou 100 pares de folhas de plântulas. As reações de amplificação foram conduzidas via reação da polimerase em cadeia e o programa de amplificação utilizado foi específico para microssatélites. Para a resolução dos fragmentos utilizaram-se os géis de agarose (3,5%) e poliacrilamida (6%). Com a finalidade de verificar a sensibilidade dos microssatélites em detectar a ocorrência de contaminantes, foram realizadas misturas sucessivas do DNA da linhagem denominada contaminante em DNA da linhagem pura, simulando níveis de contaminação de 0%, 0,01%, 0,013%, 0,02%, 0,04%, 0,1%, 0,2%, 1%, 2%, 5%, 10% e 100%. Foi observado que as características morfológicas de sementes, plântulas ou mesmo plantas, não ofereceram segurança suficiente para a detecção de contaminação em amostras de linhagens de milho. Por outro lado, a técnica de microssatélites apresentou maior eficiência e precisão, permitindo a detecção de níveis de contaminação de até 1%, como o uso de amostras constituídas por sementes e também folhas de plântulas. No experimento simulando misturas com DNA de diferentes genótipos (L1 - L2 e L3 - L4), a técnica de microssatélites foi eficiente em detectar de maneira consistente concentrações de 0,1% da amostra contaminante. Assim, a determinação da pureza varietal em lotes de sementes de linhagens de milho é mais eficiente pela utilização de marcadores microssatélites em comparação aos marcadores morfológicos. / Maize inbred lines seed production has been conducted to avoid the presence of varietal contamination since it compromises the subsequent multiplication phases within the commercial seed program. Contaminant seeds are detected through varietal and/or genetic purity determination tests which are usually based on morphological and biochemical markers, depending on the desired effectiveness. Thus, more efficient alternative approaches have been tested, with special emphasis on those based on DNA polymorphism. In that context, the main objective of this research was to compare the efficiency of morphological and microsatellite markers to evaluate varietal purity of maize inbred lines and to determine the sensitiveness of the microsatellite technique to detect the occurrence of contaminant genotypes in seed lots. There were used four inbred lines (L1, L2, L3 and L4) supplied by Dow AgroSciences Ltd., mixed to attain contamination levels of 0, 1, 2, 5, 10 and 100%. L1 and L3 were considered pure strains while L2 and L4 were treated as contaminant genotypes. For the morphological marker evaluation seed, seedling and plant descriptors at different development stages were used. Specific maize primers were used in the microsatellite technique and the DNA was isolated from samples of 100 seeds or 100 pairs of seedling leaves. The DNA amplification reactions were conducted through polymerase chain reaction, with amplification program especially designed for microsatellites, and for fragments resolution, 3.5% agarose and 6% polyacrilamyde gels were used. Successive mixtures among DNA of contaminant line and pure line (0%, 0.01%, 0.013%, 0.02%, 0.04%, 0.1%, 0.2%, 1%, 2%, 5%, 10%, and 100%) were performed to simulate contamination levels with the objective of verify the microssatellite sensitiveness in detecting the occurrence of contaminants. Morphological characteristics of the seeds, seedlings or plants were less reliable to detect contamination in maize inbred lines than the microsatellite technique; this provides more efficient and accurate evaluation of varietal purity of seed lots. Levels with 1% of contamination were detected by the use of seed and seedling leaf samples. The experiment with mixtures of DNA (L1 - L2 and L3 - L4) using microsatellite technique allowed the consistent detection of 0.1% contaminant DNA concentration. Thus, the determination of varietal purity in maize seed lots is more efficient by using microsatellite markers than morphological markers.

A presença de cultivares indesejáveis em lotes de linhagens de milho não é tolerada, pois compromete a eficiência da multiplicação subsequente para a produção comercial de sementes. A detecção das sementes contaminantes é realizada através de testes para determinação da pureza varietal e/ou genética, os quais, geralmente, são baseados em marcadores morfológicos e bioquímicos. Devido à importância dessa determinação, métodos alternativos eficientes vêm sendo avaliados e, entre esses merecem destaque os baseados em polimorfismo de DNA, visando a obtenção de informações mais consistentes. Nesse sentido, esta pesquisa teve como objetivo principal a comparação da eficiência de marcadores morfológicos e microssatélites para avaliação de pureza varietal de linhagens de milho e a determinação do grau de sensibilidade da técnica de microssatélites para detectar a ocorrência de genótipos contaminantes em lotes de sementes. Utilizaram-se quatro linhagens (L1, L2, L3 e L4) fornecidas pela Dow AgroSciences Ltda., misturadas duas a duas, para a obtenção de níveis de contaminação de 0, 1, 2, 5, 10 e 100%. L1 e L3 foram consideradas linhagens puras, enquanto L2 e L4 foram tratadas como genótipos contaminantes. A avaliação mediante o uso de marcadores morfológicos foi realizada utilizando-se descritores para sementes, plântulas e plantas em diferentes estádios de desenvolvimento. Na técnica de microssatélites utilizaram-se iniciadores específicos para amplificar DNA isolado a partir de amostras constituídas por 100 sementes ou 100 pares de folhas de plântulas. As reações de amplificação foram conduzidas via reação da polimerase em cadeia e o programa de amplificação utilizado foi específico para microssatélites. Para a resolução dos fragmentos utilizaram-se os géis de agarose (3,5%) e poliacrilamida (6%). Com a finalidade de verificar a sensibilidade dos microssatélites em detectar a ocorrência de contaminantes, foram realizadas misturas sucessivas do DNA da linhagem denominada contaminante em DNA da linhagem pura, simulando níveis de contaminação de 0%, 0,01%, 0,013%, 0,02%, 0,04%, 0,1%, 0,2%, 1%, 2%, 5%, 10% e 100%. Foi observado que as características morfológicas de sementes, plântulas ou mesmo plantas, não ofereceram segurança suficiente para a detecção de contaminação em amostras de linhagens de milho. Por outro lado, a técnica de microssatélites apresentou maior eficiência e precisão, permitindo a detecção de níveis de contaminação de até 1%, como o uso de amostras constituídas por sementes e também folhas de plântulas. No experimento simulando misturas com DNA de diferentes genótipos (L1 - L2 e L3 - L4), a técnica de microssatélites foi eficiente em detectar de maneira consistente concentrações de 0,1% da amostra contaminante. Assim, a determinação da pureza varietal em lotes de sementes de linhagens de milho é mais eficiente pela utilização de marcadores microssatélites em comparação aos marcadores morfológicos. / Maize inbred lines seed production has been conducted to avoid the presence of varietal contamination since it compromises the subsequent multiplication phases within the commercial seed program. Contaminant seeds are detected through varietal and/or genetic purity determination tests which are usually based on morphological and biochemical markers, depending on the desired effectiveness. Thus, more efficient alternative approaches have been tested, with special emphasis on those based on DNA polymorphism. In that context, the main objective of this research was to compare the efficiency of morphological and microsatellite markers to evaluate varietal purity of maize inbred lines and to determine the sensitiveness of the microsatellite technique to detect the occurrence of contaminant genotypes in seed lots. There were used four inbred lines (L1, L2, L3 and L4) supplied by Dow AgroSciences Ltd., mixed to attain contamination levels of 0, 1, 2, 5, 10 and 100%. L1 and L3 were considered pure strains while L2 and L4 were treated as contaminant genotypes. For the morphological marker evaluation seed, seedling and plant descriptors at different development stages were used. Specific maize primers were used in the microsatellite technique and the DNA was isolated from samples of 100 seeds or 100 pairs of seedling leaves. The DNA amplification reactions were conducted through polymerase chain reaction, with amplification program especially designed for microsatellites, and for fragments resolution, 3.5% agarose and 6% polyacrilamyde gels were used. Successive mixtures among DNA of contaminant line and pure line (0%, 0.01%, 0.013%, 0.02%, 0.04%, 0.1%, 0.2%, 1%, 2%, 5%, 10%, and 100%) were performed to simulate contamination levels with the objective of verify the microssatellite sensitiveness in detecting the occurrence of contaminants. Morphological characteristics of the seeds, seedlings or plants were less reliable to detect contamination in maize inbred lines than the microsatellite technique; this provides more efficient and accurate evaluation of varietal purity of seed lots. Levels with 1% of contamination were detected by the use of seed and seedling leaf samples. The experiment with mixtures of DNA (L1 - L2 and L3 - L4) using microsatellite technique allowed the consistent detection of 0.1% contaminant DNA concentration. Thus, the determination of varietal purity in maize seed lots is more efficient by using microsatellite markers than morphological markers.

A incidência e severidade da mancha de cercospora, causada por Cercospora zeae-maydis Tehon & Daniels, aumentou significativamente em território brasileiro a partir do ano 2000, sendo hoje considerada uma das principais doenças foliares da cultura do milho. Mesmo assim, poucos estudos com este patossistema foram realizados no Brasil. Este trabalho teve por objetivo determinar meio de cultura e regime luminoso para adequada esporulação de C. zeae-maydis, estudar a reação de um grupo de 118 linhagens endogâmicas de milho quanto a resistência ao patógeno em dois ambientes distintos (Indianópolis-MG e Jardinópolis-SP), observar aspectos microscópicos da esporulação, germinação e penetração em hospedeira suscetível e avaliar diferenças morfológicas, genéticas e de agressividade entre isolados coletados na região centro-sul do país. Os resultados indicaram que a melhor esporulação do fungo foi obtida em meio V8 e suco de tomate temperado quando submetidos a fotoperíodo 12/12h (luz/escuro). Quanto a reação das linhagens à doença, foi possível verificar interação diferencial significativa entre genótipo de milho e os dois ambientes, indicando que fatores ambientais ou patogênicos, distintos entre os locais, podem ter contribuído para os discrepantes comportamentos de alguns genótipos. Também foi possível verificar elevado nível de resistência em 12 linhagens em ambos locais, demonstrando a existência de genótipos mais estáveis para resistência com possibilidade de uso em programas de melhoramento da cultura. Através da análise do padrão de restrição gerado pela digestão da região ITS-5.8S do rDNA, de 104 locos AFLP e de mensurações morfométricas dos conídios, foi possível verificar a existência de dois grupos geneticamente distintos de C. zeae-maydis em território brasileiro. Estes são relatados na literatura como grupos I e II ou espécies afins (siblings species). Estes grupos foram detectados em todos os locais de coleta do território brasileiro, com exceção de Goiás, onde o grupo I não foi observado. Quanto aos aspectos microscópicos deste patógeno, foi possível verificar que sob condições ambientais adequadas a germinação dos esporos ocorre 13 horas após o contato do esporo com a hospedeira, e a penetração, via estômato, tem início 16 horas após a inoculação. Também foi observado o fenômeno da conidiação microcíclica nos isolados brasileiros. Vinte e seis por cento daqueles pertencentes ao grupo I produziram microconídios, enquanto nenhum do grupo II apresentou esta característica. Deste modo, este é o primeiro relato da existência deste fenômeno no grupo I e ausência no grupo II. Estes estudos demonstram que a população brasileira de C. zeae-maydis se assemelha àquelas existentes nos Estados Unidos e na África, com a prevalência dos dois grupos genéticos. / The incidence and severity of cercospora leaf spot, caused by Cercospora zeae-maydis Tehon & Daniels, increased significantly in Brazil in 2000, being considered today one of the major leaf disease of the crop. Despite this, few researches about the pathosystem come being carried in Brazil. The aims of this work were to identify the suitable culture media and light conditions for sporulation of C. zeae-maydis; to study the reaction of 118 mayze genotypes to pathogen in two different locations (Indianópolis - Minas gerais State and Jardinópolis - São Paulo State); to observe some microscopical aspects of esporulation, germination and penetration in a susceptible maize genotype; and finally to assess morphological and genetic differences among a group of isolates collected in center-south Brazil. The results showed that the better culture media for esporulation was the V8 media and tomato juice, under 12-hours photoperiod. Concerning to genotype reaction to disease, it was possible to verify significant interaction between genotypes and environment, indicanting that environmental or pathogenic factors, distinct between locations, may have influenced the reactions of some genotypes. It was possible to identify highly level of resistance in 12 lines in both places, evidencing the existence of stable genotypes that can be used in breeding programs. Analysis of restriction fragments from ITS-5.8S of rDNA, 104 AFLP loci, and conidial measurements, showed the existence of two genetically divergent groups of C. zeae-maydis in Brazil. These groups are similar to the ones reported previously reported as I and II groups or siblings species. Both groups were detected in all sampled regions, except Goiás State where no isolates from group I were detected. Concerning to microscopic traits, it was possible to verify that the brazilian isolates of this pathogen have the ability for production of microconidia. Twenty six percent of the isolates of the group I produced microconidia, while none of the group II showed this trait. Thus, this is the first report with presence of MC in the group I but absence in the group II. The results showed that Brazilian isolates are very similar to isolates from USA and Africa, occurring both genetic groups.

A incidência e severidade da mancha de cercospora, causada por Cercospora zeae-maydis Tehon & Daniels, aumentou significativamente em território brasileiro a partir do ano 2000, sendo hoje considerada uma das principais doenças foliares da cultura do milho. Mesmo assim, poucos estudos com este patossistema foram realizados no Brasil. Este trabalho teve por objetivo determinar meio de cultura e regime luminoso para adequada esporulação de C. zeae-maydis, estudar a reação de um grupo de 118 linhagens endogâmicas de milho quanto a resistência ao patógeno em dois ambientes distintos (Indianópolis-MG e Jardinópolis-SP), observar aspectos microscópicos da esporulação, germinação e penetração em hospedeira suscetível e avaliar diferenças morfológicas, genéticas e de agressividade entre isolados coletados na região centro-sul do país. Os resultados indicaram que a melhor esporulação do fungo foi obtida em meio V8 e suco de tomate temperado quando submetidos a fotoperíodo 12/12h (luz/escuro). Quanto a reação das linhagens à doença, foi possível verificar interação diferencial significativa entre genótipo de milho e os dois ambientes, indicando que fatores ambientais ou patogênicos, distintos entre os locais, podem ter contribuído para os discrepantes comportamentos de alguns genótipos. Também foi possível verificar elevado nível de resistência em 12 linhagens em ambos locais, demonstrando a existência de genótipos mais estáveis para resistência com possibilidade de uso em programas de melhoramento da cultura. Através da análise do padrão de restrição gerado pela digestão da região ITS-5.8S do rDNA, de 104 locos AFLP e de mensurações morfométricas dos conídios, foi possível verificar a existência de dois grupos geneticamente distintos de C. zeae-maydis em território brasileiro. Estes são relatados na literatura como grupos I e II ou espécies afins (siblings species). Estes grupos foram detectados em todos os locais de coleta do território brasileiro, com exceção de Goiás, onde o grupo I não foi observado. Quanto aos aspectos microscópicos deste patógeno, foi possível verificar que sob condições ambientais adequadas a germinação dos esporos ocorre 13 horas após o contato do esporo com a hospedeira, e a penetração, via estômato, tem início 16 horas após a inoculação. Também foi observado o fenômeno da conidiação microcíclica nos isolados brasileiros. Vinte e seis por cento daqueles pertencentes ao grupo I produziram microconídios, enquanto nenhum do grupo II apresentou esta característica. Deste modo, este é o primeiro relato da existência deste fenômeno no grupo I e ausência no grupo II. Estes estudos demonstram que a população brasileira de C. zeae-maydis se assemelha àquelas existentes nos Estados Unidos e na África, com a prevalência dos dois grupos genéticos. / The incidence and severity of cercospora leaf spot, caused by Cercospora zeae-maydis Tehon & Daniels, increased significantly in Brazil in 2000, being considered today one of the major leaf disease of the crop. Despite this, few researches about the pathosystem come being carried in Brazil. The aims of this work were to identify the suitable culture media and light conditions for sporulation of C. zeae-maydis; to study the reaction of 118 mayze genotypes to pathogen in two different locations (Indianópolis – Minas gerais State and Jardinópolis – São Paulo State); to observe some microscopical aspects of esporulation, germination and penetration in a susceptible maize genotype; and finally to assess morphological and genetic differences among a group of isolates collected in center-south Brazil. The results showed that the better culture media for esporulation was the V8 media and tomato juice, under 12-hours photoperiod. Concerning to genotype reaction to disease, it was possible to verify significant interaction between genotypes and environment, indicanting that environmental or pathogenic factors, distinct between locations, may have influenced the reactions of some genotypes. It was possible to identify highly level of resistance in 12 lines in both places, evidencing the existence of stable genotypes that can be used in breeding programs. Analysis of restriction fragments from ITS-5.8S of rDNA, 104 AFLP loci, and conidial measurements, showed the existence of two genetically divergent groups of C. zeae-maydis in Brazil. These groups are similar to the ones reported previously reported as I and II groups or siblings species. Both groups were detected in all sampled regions, except Goiás State where no isolates from group I were detected. Concerning to microscopic traits, it was possible to verify that the brazilian isolates of this pathogen have the ability for production of microconidia. Twenty six percent of the isolates of the group I produced microconidia, while none of the group II showed this trait. Thus, this is the first report with presence of MC in the group I but absence in the group II. The results showed that Brazilian isolates are very similar to isolates from USA and Africa, occurring both genetic groups.