Background. The phylum Tardigrada consists of over 1,300 species that inhabit terrestrial, freshwater and marine environments throughout the world. In terrestrial habitats they live primarily in mosses, lichens, leaf litter and soil, whereas tardigrades in freshwater and marine environments are mainly found in sediments and on aquatic plants. More than 65 species have been previously reported in the state of Tennessee, USA. Methods. Tardigrades present in moss cushions (Grimmia sp.) collected from a xerothermic habitat on the East Tennessee State University campus, Johnson City, TN, USA, were extracted, mounted on slides, identified, and counted. Additional samples of fresh dried moss were used for integrative analyses, including morphological analysis with phase contrast (PCM) and scanning electron microscopy (SEM), as well as molecular analyses of COI, 18S rRNA, 28S rRNA, and ITS-2 of the Macrobiotus and Milnesium species. Results. Five species were found, including two species new to science: Viridiscus miraviridis sp. nov. and Macrobiotus basiatus sp. nov. Viridiscus miraviridis sp. nov. differs from other members of the genus mainly by having a different type of dorsal cuticle and some other, more subtle, morphometric characters. In addition to the two new species, Viridiscus perviridis and Viridiscus viridissimus were present, and males of Vir. viridissimus were found for the first time, the first record of males in the genus Viridiscus. Macrobiotus basiatus sp. nov. is most similar to Macrobiotus nelsonae, but it differs from Mac. nelsonae mainly by the stylet supports being situated in a more anterior position, shorter and narrower egg processes, and a smaller number of areoles around the egg processes. Moreover, the identification of Milnesium inceptum was confirmed as the first record for the USA by analysis of COI.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1625922 bytes, checksum: 8e4e59f3e5a2481a04957bd2da9aa918 (MD5) Previous issue date: 2012-09-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) is the etiological agent of paratuberculosis, a disease which causes chronic granulomatous enteritis preferably in domestic and wild ruminants. It is considered a disease of economic and social impact, because of losses in livestock and importance in human health, since there is evidence of possible correlation of MAP with Crohn's disease. However, much is still unknown about the developing the pathophysiology and immunopathogenesis this disease, in the sites of infection. Thus, this study has proposed verify the response of cytokines proinflammatory and anti-inflammatory by quantitative PCR and associate the expression of these cytokines with the lesions and the presence of the agent in organs of C57BL/6 mice infected intraperitoneal with strain MAP66115-98. It was applied 250μl of inoculum at 3 x 108 UFC/ml in 20 mice, and it was applied saline phosphate buffers (PBS) in eight control species. The animals were sacrificed at 30, 60, 90 and 120 days post-inoculation. In each period were collected spleen, liver, intestine (ileum and colon) and Peyer's patches of five challenged mice and two controls. It was found in the majority an upregulation in the expression profiles of proinflammatory cytokines IL-2, IFN-, and TNF-α ү, and anti-inflammatory IL-4 and IL-10 analyzed in the organs compared to controls during period of the experiment. It was observed also negative regulations in the fourth week in spleen and colon, twelfth in the spleen, ileum and Peyer's patch and the sixteenth week in the liver, colon and ileum. Statistical differences were only observed at the eighth week after the challenge for IFN-ү in liver, in spleen for expression of IL-2 and IFN-ү and in the ileum for IL-4 and TNF-α. In the fourth week, it was possible to identify increased levels of mRNA transcripts of the cytokines studied. In the liver, ileum and colon IFN-ү showed the highest level of mRNA transcripts compared to the negative control, however at higher levels spleen were observed for IL- 10. Only eight weeks it was possible to observe a statistically significant difference for the cytokine IFN-ү in the liver and spleen samples for TNF-α and IL-4 in the ileum and IL-2 in spleen. The highest levels of mRNA transcript were observed in the liver for IFN- ү, spleen for IL-2, and in the ileum Peyer's patch for IL-4 and colon for IL-10. In the twelfth week, the major mRNA transcript levels were observed in liver for IL-10 in spleen and ileum for IL-2 in colon for TNF-α and Peyer's patch for IL-4. In the sixteenth week, the major mRNA transcript levels were observed in liver and colon for IL-10 in spleen and ileum for IFN-ү and Peyer's patch for TNF-α. The animals showed increased expression of mRNA transcripts of cytokines studied organs after challenge with MAP, although not verified gross and microscopic changes (hematoxylin and eosin staining). However it was possible to observe the presence of alcohol-acid resistant rods in two samples of Peyer's patches (Ziehl-Neelsen) and nested-PCR technique was possible to observe the presence of MAP in every organ analyzed. Thus, these results contribute to a better understanding of the expression of proinflammatory and anti-inflammatory in local infection at different post-inoculation in both organs taken as site specific as MAP intestine (colon and ileum) and Peyer's patch and organs extraintestinal, and thus find a better understanding of the immunopathogenesis of infection in the local. / Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis (MAP) é o agente etiológico da paratuberculose, uma enfermidade que causa enterite granulomatosa crônica preferencialmente em ruminantes domésticos e silvestres. É considerada uma doença de impacto econômico e social, devido às perdas no rebanho e na saúde humana, uma vez que se têm indícios da possível relação de MAP com a doença de Crohn. Contudo, muito ainda se desconhece sobre o desenvolvimento da patofisiologia e imunopatogênese desta doença, nos locais da infecção. Desse modo, este estudo propôs verificar a resposta de citocinas pró e anti-inflamatórias por meio da técnica de PCR quantitativo e associar a expressão destas citocinas com as lesões e a presença do agente em órgãos de camundongos C57BL/6 infectados por via intraperitoneal com a cepa MAP66115-98. Em 20 camundongos foram aplicados 250μl de inóculo a 3 x 10 8 UFC/ml e, em oito controles foram aplicados PBS. Os animais foram sacrificados aos 30, 60, 90 e 120 dias pós-inoculação. Em cada período, foram coletado baço, fígado, intestino (cólon e íleo) e placas de Peyer de cinco camundongos desafiados e de dois controles. Verificou-se na maioria, uma regulação positiva nos perfis de expressões das citocinas pró-inflamatórias IL-2, IFN-ү e TNF-α, e anti-inflamatórias IL-4 e IL-10 nos órgãos analisados em relação aos controles durante o período do experimento. Observaram-se também regulações negativas na quarta semana no baço e colón, na décima segunda no baço, íleo e placa de Peyer e na décima sexta semana no fígado, colón e íleo. Diferenças estatísticas foram observadas somente na oitava semana após o desafio no fígado para IFN-ү, no baço para expressão da IL-2 e IFN-ү e no íleo para IL-4 e TNF-α. Na quarta semana, foi possível identificar aumento dos níveis de transcritos de RNAm das citocinas estudadas. No fígado, íleo e colón o IFN-ү apresentou maior nível de transcritos de RNAm em relação ao controle negativo, no entanto no baço os maiores níveis foram observados para a IL-10. Somente na oitava semana foi possível observar diferença estatística significativa para a citocina IFN-ү, em amostras do fígado e baço, para o TNF-α e IL-4 no íleo e para a IL-2 no baço. Os maiores níveis de transcrito de RNAm foram observados no fígado, para o IFN-ү , no baço para a IL-2 , no íleo e placa de Peyer para a IL-4 e no colón para a IL-10. Na décima segunda semana, os maiores níveis de transcrito de RNAm foram observados no fígado para a IL-10, no baço e íleo para a IL-2, no colón para o TNF-α e na placa de Peyer para a IL-4. Na décima sexta semana, os maiores níveis de transcrito de RNAm foram observados no fígado e colón para a IL-10, no baço e íleo para o IFN-ү e na placa de Peyer para o TNF-α. Os animais apresentaram uma maior expressão dos transcritos de RNAm das citocinas estudadas nos órgãos após o desafio com MAP, embora não tenham sido verificadas alterações macro e microscópica (coloração de Hematoxilina e Eosina). No entanto foi possível observar presença de bastonetes álcool ácido resistentes em duas amostras de placas de Peyer, (coloração de Ziehl-Neelsen) e pela técnica de nested-PCR foi possível observar a presença de MAP em todos os órgão analisados. Assim, estes resultados contribuem para a melhor compreensão da expressão de citocinas pró e anti-inflamatória nos locais da infecção em diferentes tempos pós-inoculação tanto em órgãos tidos como sitio específicos de MAP como intestino (colón e íleo) e placa de Peyer e órgãos extra-intestinais, e com isso buscar o melhor entendimento da imunopatogênese nos locais da infecção.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 709722 bytes, checksum: 25ae10b4477351d0ee2293c5f5d08d05 (MD5) Previous issue date: 2012-04-27 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) is the etiological agent of paratuberculosis, a disease which causes chronic granulomatous enteritis preferably in domestic and wild ruminants. It is characterized by intermittent diarrhea, progressive weight loss and reduced milk production. The major route of transmission is the ingestion of food and water contaminated by feces of infected animals. It is considered a disease of high economic importance, because of losses in livestock and importance in human health, since there is evidence of possible correlation of MAP with Crohn's disease. Although previous researches have contributed to advances in the diagnosis of subclinical MAP in animals, there is a lack of studies concerning the correct understanding of its pathophysiology. Thus, the aim of this study was to investigate the distribution of MAP by means of the histology and nested-PCR techniques in organs of C57BL/6 mice infected with MAP66115-98 strain at a dose of 3 x 108 CFU /mL intraperitoneally (IP). It was applied 250μl of inoculum in 20 mice, and it was applied saline phosphate buffer (PBS) in eight control species. The animals were euthanized at 30, 60, 90 and 120 days post-inoculation, and fragments of spleen, liver, colon, ileum and Peyer's patches of five mice and two control, for each period of time, were performed molecular and histopathological evaluations. Although it was not found histologic lesions in sections stained by Hematoxylin Eosin, there was a positive staining for two Peyer s patches referring to 90 and 120 days after inoculation, stained by Ziehl-Neelsen. Among the collected organs, 64.9% were positive by molecular technique. The spleen (0.85), colon (0.75) and liver (0.60) had the highest proportion of positive regardless of the evaluation period. Taking into consideration the time after inoculation, the spleen had a higher proportion of positive results after 60 days of infection (1.00), remaining stable until 120 days. The colon had a higher proportion at 30 days (1.00) and drastically reduced to 90 days (0.40). The liver ranged between 0.40 and 0.80 during the four periods of evaluation and the Ileum showed positivity ratio equal to 0.80 only at 120 days of infection. Moreover, Peyer's patches did not vary significantly (0.40) from day 60, remaining with the lowest ratio among the organs studied. The assessment of the probability of infection of an organ relative to another was obtained by the Relative Risk, where the highest values were observed in the ratio of spleen/Peyer's patches (2.00), colon/Peyer's patches (1.74), spleen/ileum (1.54) and spleen/liver (1.40). The highest odds ratio values were observed in the spleen/Peyer s patches (7.56), spleen/ileum (4.64), spleen/liver (3.78), and colon/ileum (2.45). However, among all the established associations, only the relations spleen / ileum and spleen / Peyer's patches were statistically significant at the level of 95%, showing that the spleen was the organ with higher risk and chances of positivity in relation to the ileum and Peyer's patches. Thus, these results can contribute to better understanding of the distribution of MAP in experimental models during the course of systemic infection, being this the first study to correlate the infective capacity of the strain MAP66115- 98 in C57BL/6 mice with a distribution in different organs after inoculation by intraperitoneal route. / Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis (MAP) é o agente etiológico da paratuberculose, uma enfermidade que causa enterite granulomatosa crônica preferencialmente em ruminantes domésticos e silvestres. É considerada uma doença de impacto na economia, devido às perdas no rebanho e na saúde humana, uma vez que se têm indícios da possível relação de MAP com a doença de Crohn. Embora pesquisas tenham contribuído para avanços no diagnóstico de MAP, há carências de estudos relacionados à compreensão de sua patofisiologia. Desse modo, este estudo propôs avaliar a distribuição de MAP por meios das técnicas de nested-PCR e histologia em órgãos de camundongos C57BL/6 infectados por via intraperitoneal com a cepa MAP66115-98. Em 20 camundongos foram aplicados 250μl de inóculo contendo 3 x 108 UFC/mL e, em oito controles foram aplicados tampão fosfato-salina (PBS). Os animais foram eutanasiados aos 30, 60, 90 e 120 dias pós-inoculação. Em cada período, foram coletados baço, fígado, cólon, íleo e placas de Peyer de cinco camundongos desafiados e dois controles. O material foi dividido para avaliação molecular e histopatológica. Embora não tenham sido verificadas alterações histológicas nas lâminas coradas pela Hematoxilina Eosina, houve marcação positiva para duas placas de Peyer, referentes a 90 e 120 dias pós-inoculação, quando coradas pela técnica de Ziehl-Neelsen. Dentre os órgãos coletados, 64,9% foram positivos pela técnica molecular. Os órgãos que apresentaram maiores valores proporcionais de positividade independentemente do período de avaliação foram o baço (0,85), o cólon (0,75) e o fígado (0,60). Ao levar em consideração o tempo pós-inoculação, o baço apresentou maior proporção de positividade após 60 dias (1,00), permanecendo estável até os 120 dias, enquanto o cólon apresentou maior proporção aos 30 dias (1,00) e reduziu drasticamente aos 90 dias (0,40) da inoculação. O fígado variou entre 0,40 e 0,80 durante os quatro períodos de avaliação e o Íleo apresentou proporção de positividade igual a 0,80 apenas aos 120 dias de inoculação. Por outro lado, as placas de Peyer não variaram significativamente a partir dos 60 dias (0,40) permanecendo com a menor proporção dentre os órgãos analisados. A avaliação da probabilidade de infecção de um órgão em relação a outro foi obtida pelo Risco Relativo, onde os maiores valores foram verificados na relação entre baço/placas de Peyer (2,00); cólon/placas de Peyer (1,74); baço/íleo (1,54) e baço/fígado (1,40). Os maiores valores de Razão de Chances foram verificados na relação entre baço/placas de Peyer (7,56); baço/íleo (4,64); baço/fígado (3,78) e cólon/íleo (2,45). Contudo, dentre todas as associações estabelecidas, apenas as relações: baço/íleo e baço/placas de Peyer foram estatisticamente significativas à nível de 95%, demonstrando que o baço foi o órgão com maior risco e chances de positividade em relação ao íleo e placas de Peyer. Assim, estes resultados podem contribuir para a melhor compreensão da distribuição de MAP em modelos experimentais durante o curso de uma infecção sistêmica, sendo o primeiro trabalho a correlacionar a capacidade infectiva da cepa MAP66115-98 nos camundongos C57BL/6 com a sua distribuição em diferentes órgãos pós-inoculação usando a via intraperitoneal.