München, Techn. Universiẗat, Diss., 2006.

Universiẗat, Diss., 2007--Giessen.

Univ., Diss.--Erlangen-Nürnberg, 1997.

University, Diss., 1999--Stuttgart.

München, Techn. Univ., Diss., 2004.

Bielefeld, Univ., Diss., 2001.

Universiẗat, Diss., 2002--Bonn.

For a large fraction of the proteins expressed in the human brain only the primary structure is known from the genome project. Proteins conserved in evolution can be studied in genetic models such as Drosophila. In this doctoral thesis monoclonal antibodies (mAbs) from the Wuerzburg Hybridoma library are produced and characterized with the aim to identify the target antigen. The mAb ab52 was found to be an IgM which recognized a cytosolic protein of Mr ~110 kDa on Western blots. The antigen was resolved by two-dimensional gel electrophoresis (2DE) as a single distinct spot. Mass spectrometric analysis of this spot revealed EPS-15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15) to be a strong candidate. Another mAb from the library, aa2, was already found to recognize EPS-15, and comparison of the signal of both mAbs on Western blots of 1D and 2D electrophoretic separations revealed similar patterns, hence indicating that both antigens could represent the same protein. Finally absence of the wild-type signal in homozygous Eps15 mutants in a Western blot with ab52 confirmed the ab52 antigen to be EPS-15. Thus both the mAbs aa2 and ab52 recognize the Drosophila homologue of EPS-15. The mAb aa2, being an IgG, is more suitable for applications like immunoprecipitation (IP). It has already been submitted to the Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) to be easily available for the entire research community. The mAb na21 was also found to be an IgM. It recognizes a membrane associated antigen of Mr ~10 kDa on Western blots. Due to the membrane associated nature of the protein, it was not possible to resolve it by 2DE and due to the IgM nature of the mAb it was not possible to enrich the antigen by IP. Preliminary attempts to biochemically purify the endogenously expressed protein from the tissue, gave promising results but could not be completed due to lack of time. Thus biochemical purification of the protein seems possible in order to facilitate its identification by mass spectrometry. Several other mAbs were studied for their staining pattern on cryosections and whole mounts of Drosophila brains. However, many of these mAbs stained very few structures in the brain, which indicated that only a very limited amount of protein would be available as starting material. Because these antibodies did not produce signals on Western blots, which made it impossible to enrich the antigens by electrophoretic methods, we did not attempt their purification. However, the specific localization of these proteins makes them highly interesting and calls for their further characterization, as they may play a highly specialized role in the development and/or function of the neural circuits they are present in. The purification and identification of such low expression proteins would need novel methods of enrichment of the stained structures. / Für einen Großteil der Proteine, die im menschlichen Gehirn exprimiert werden, ist lediglich die Primärstruktur aus dem Genomprojekt bekannt. Proteine, die in der Evolution konserviert wurden, können in genetischen Modellsystemen wie Drosophila untersucht werden. In dieser Doktorarbeit werden monoklonale Antikörper (mAk) aus der Würzburger Hybridoma Bibliothek produziert und charakterisiert, mit dem Ziel, die erkannten Proteine zu identifizieren. Der mAk ab52 wurde als IgM typisiert, das auf Western Blots ein zytosolisches Protein von Mr ~110 kDa erkennt. Das Antigen wurde durch zwei-dimensionale Gelelektrophorese (2DE) als einzelner Fleck aufgelöst. Massenspektrometrische Analyse dieses Flecks identifizierte dass EPS-15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15) als viel versprechenden Kandidaten. Da für einen anderen mAk aus der Bibliothek, aa2, bereits bekannt war, dass er EPS-15 erkennt, wurden die Western-Blot-Signale der beiden Antikörper nach 1D und 2D Trennungen von Kopfhomogenat verglichen. Die Ähnlichkeit der beiden Muster deuteten darauf hin, dass beide Antigene dasselbe Protein erkennen. Das Fehlen des Wildtyp-Signals in homozygoten Eps15 Mutanten in einem Western Blot mit mAk ab52 bestätigten schließlich, dass EPS-15 das Antigen zu mAk ab52 darstellt. Demnach erkennen beide mAk, aa2 und ab52, das Drosophila Homolog zu EPS-15. Da mAk aa2 ein IgG ist, dürfte er für Anwendungen wie Immunpräzipitation (IP) besser geeignet sein. Er wurde daher bereits bei der Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) eingereicht, um ihn der ganzen Forschergemeinde leicht zugänglich zu machen. Der mAk na21 wurde ebenfalls als IgM typisiert. Er erkennt ein Membran assoziiertes Antigen von Mr ~10 kDa auf Western Blots. Aufgrund der Membranassoziierung des Proteins war es nicht möglich, es in 2DE aufzulösen und da es sich um ein IgM handelt, war eine Anreicherung des Antigens mittels IP nicht erfolgreich. Vorversuche zur biochemischen Reinigung des endogenen Proteins aus Gewebe waren Erfolg versprechend, konnten aber aus Zeitmangel nicht abgeschlossen werden. Daher erscheint eine biochemische Reinigung des Proteins für eine Identifikation durch Massenspektrometrie möglich. Eine Reihe weiterer mAk wurden hinsichtlich ihrer Färbemuster auf Gefrierschnitten und in Ganzpräparaten von Drosophila Gehirnen untersucht. Allerdings färbten viele dieser mAk sehr wenige Strukturen im Gehirn, so dass nur eine sehr begrenzte Menge an Protein als Startmaterial verfügbar wäre. Da diese Antikörper keine Signale auf Western Blots produzierten und daher eine Anreicherung des Antigens durch elektrophoretische Methoden ausschlossen, wurde keine Reinigung versucht. Andererseits macht die spezifische Lokalisation dieser Proteine sie hoch interessant für eine weitere Charakterisierung, da sie eine besonders spezialisierte Rolle in der Entwicklung oder für die Funktion von neuralen Schaltkreisen, in denen sie vorkommen, spielen könnten. Die Reinigung und Identifikation solcher Proteine mit niedrigem Expressionsniveau würde neue Methoden der Anreicherung der gefärbten Strukturen erfordern.

Fn14 ist als Mitglied der TNFRSF im Kontext proinflammatorischer Prozesse und demzufolge auch an Tumorentstehung und -wachstum beteiligt. Aufgrund der Hochregulation von Fn14 und seinem bislang einzig bekannten Liganden „TWEAK“ in Tumorzellen und ihrer Umgebung gilt dieses System für die immunonkologische Forschung als vielversprechend. Durch Fn14 können unter anderem der alternative und klassische NFκB-Signalweg aktiviert werden. Die Signalkaskade des klassischen NFκB-Signalwegs beruht auf der E3-Ligasefunktion rekrutierter cIAP1/2-Moleküle und erfordert daher eine Clusterbildung von zwei oder mehr TWEAK3-Fn143-TRAF23-cIAP1/2-Komplexen. Diese Aggregation kann im Vergleich zu löslichem TWEAK effektiv lediglich durch membrangebundenes TWEAK hervorgerufen werden. Im Rahmen der Entwicklung TWEAK/Fn14-basierter Wirkstoffe geht die Tendenz aktuell hin zur Herstellung TWEAK-unabhängiger, rekombinanter anti-Fn14-Antikörper mit intrinsischer Aktivität, Fn14-assoziierte Signalwege zu stimulieren. Ziel dieser Arbeit war es anti-Fn14-Antikörper mit einem effektiven, intrinsischen, FcγR-unabhängigen Agonismus zu produzieren. Die bereits etablierten, bisher lediglich schwach agonistisch wirksamen anti-Fn14-Antikörper 18D1, PDL192 und P4A8 vom Typ IgG1 wurden dazu im Vorfeld dieser Arbeit institutsintern durch gentechnische Fusion mit scFv jeweils als monospezifische bi-, tetra- und hexavalente Antikörperkonstrukte konzipiert. Durch die zusätzlichen Antigenbindungsstellen wurden die oligovalenten anti-Fn14-Antikörpervarianten ohne Applikation zusätzlicher Reagenzien oligomerisiert. Um potenzielle Fcγ-Rezeptor-vermittelte Interaktionen zu minimieren, wurde außerdem in jedes Antikörperkonstrukt die Punktmutation N297A eingefügt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die entstandenen neun Antikörpervarianten mittels transienter Transfektion in HEK293 Zellen produziert und deren Wirkung in verschiedenen molekularbiologischen Assays untersucht. Bei allen drei bivalenten Varianten konnte höchstens ein schwacher agonistischer Effekt an Fn14 verzeichnet werden. Alle oligovalenten anti-Fn14-Antikörpervarianten hingegen induzierten in HT1080 Zellen nachweislich den alternativen NFκB-Signalweg und verstärkten außerdem den TNF-TNFR1-vermittelten Zelltod in HeLa-RIPK3-FADD-KO Zellen. Eine effektive Aktivierung des klassischen NFκB-Signalwegs gelang jedoch lediglich durch die oligovalenten Varianten von 18D1 und PDL192. Durch diese wurde eine Wirkstärke vergleichbar der von membrangebundenem TWEAK erreicht, weshalb von einem FcγR-unabhängigen, intrinsischen Agonismus dieser anti-Fn14-Antikörpervarianten ausgegangen werden kann. Hinsichtlich Expressionsniveau und Stabilität unterschieden sich die produzierten anti-Fn14-Antikörper deutlich, weswegen vor allem die tetravalenten Varianten von 18D1 und PDL192 für weitere Untersuchungen und eine potenzielle klinische Anwendung infrage kommen. / As a member of the TNFRSF family Fn14 is involved in proinflammatory processes, and consequently, also in tumor formation and growth. Due to the upregulation of Fn14 and its only known ligand "TWEAK" in tumor cells and their environment, this system is considered promising in immuno-oncology research. Fn14 can activate both the alternative and classical NFκB signaling pathway. The signaling cascade of the classical NFκB pathway relies on the E3 ligase function of recruited cIAP1/2 molecules and, therefore, requires the formation of clusters of two or more TWEAK3-Fn143-TRAF23-cIAP1/2 complexes. This aggregation can be effectively induced only by membrane-bound TWEAK in comparison to soluble TWEAK. In the development of TWEAK/Fn14-based therapeutics, the current trend is moving towards the production of TWEAK-independent recombinant anti-Fn14 antibodies with intrinsic activity to stimulate Fn14-associated signaling pathways. The goal of this work was to produce anti-Fn14 antibodies with efficient, intrinsic, FcγR-independent agonism. The previously established, weakly agonistic anti-Fn14 antibodies, 18D1, PDL192, and P4A8 of the IgG1 type, were designed as monospecific bi-, tetra-, and hexavalent antibodies by genetically fusing them with scFv in advance of this work. The additional antigen-binding sites allowed the oligovalent anti-Fn14 antibody constructs to be oligomerized without the application of additional reagents. To minimize potential Fcγ receptor-mediated interactions, the N297A point mutation was also introduced into each antibody construct. In the context of this work, the resulting nine antibody variants were produced through transient transfection in HEK293 cells, and their effects were examined in various molecular biology assays. In all three bivalent variants, at most, a weak agonistic effect on Fn14 was observed. However, all oligovalent anti-Fn14 antibody variants demonstrably induced the alternative NFκB signaling pathway in HT1080 cells and also enhanced TNF-TNFR1-mediated cell death in HeLa-RIPK3-FADD-KO cells. Efficient activation of the classical NFκB signaling pathway was achieved only by the oligovalent variants of 18D1 and PDL192. These variants reached a potency comparable to that of membrane-bound TWEAK, suggesting an FcγR-independent, intrinsic agonism of these anti-Fn14 antibody variants. The produced anti-Fn14 antibodies differed significantly in terms of expression levels and stability, making the tetravalent variants of 18D1 and PDL192 particularly suitable for further investigations and potential clinical applications.

Es sollten Checkpoint inhibierende anti-TNFRSF Rezeptor Antikörper-Fusionsproteine hergestellt und charakterisiert werden. Die agonistische Aktivität TNFR-spezifischer Antikörper wird maßgeblich durch eine Immobilisation über Fcγ-Rezeptoren beeinflusst. In dieser Arbeit erfolgte die Immobilisation der Antikörper-Fusionsproteine über den PD-L1. In funktionellen Assays konnte eine Aktivitätssteigerung der TNFR-spezifischen Domänen mittels PD-L1 vermittelter Immobilisation gezeigt werden. / Checkpoint inhibiting anti-TNFRSF receptor antibody fusion proteins should be prepared and characterized. The agonistic activity of TNFR-specific antibodies is significantly influenced by immobilization via Fcγ receptors. In this work, immobilization of the antibody fusion proteins was performed via the PD-L1. Functional assays revealed an increase in activity of TNFR-specific domains using PD-L1-mediated immobilization.