La tesis que es presenta comprèn tres treballs d'investigació independents, connectats entre sí per un mateix fil conductor: l'estudi de l'estructura i funció de l'organela terminal de Mycoplasma genitalium.En el primer treball s'han obtingut i caracteritzat mutants deficients per les proteïnes P140 i P110. Aquests estudis han revelat que les proteïnes P140 i P110 estan estabilitzades de forma recíproca, són els principals determinants de citadherència i la seva presència és necessària per al desenvolupament de l'organela terminal. A més, l'absència d'aquestes dues proteïnes també promou la inestabilitat de la proteïna de motilitat MG386 i un increment en els nivells de la proteïna DnaK. Per altra banda, també s'han analitzat un conjunt de mutants espontanis en adhesió cel·lular que apareixen amb una elevada freqüència. Aquest anàlisi ha permès determinar que aquests mutants s'originen com a conseqüència de grans delecions afectant als gens codificants de les proteïnes P140 i P110. A més, s'ha demostrat que aquestes delecions són producte de recombinacions entre seqüències dels gens afectats i seqüències repetides que es troben distribuïdes al llarg del genoma. Aquest origen recombinatiu explica l'alta freqüència d'aparició d'aquests mutants i obre la possibilitat de l'existència d'un mecanisme general de variació de fase de l'expressió de les proteïnes P140 i P110. En el segon treball s'ha investigat el paper de la proteïna MG312 en l'arquitectura i funció de l'organela terminal. Aquest estudi ha permès determinar que aquesta proteïna és un component estructural bàsic de l'organela terminal, essencial per al manteniment de la integritat d'aquesta estructura i d'alguns dels seus components. Com a conseqüència, els mutants deficients per la proteïna MG312 no desenvolupen organeles terminals, són parcialment deficients en adhesió i completament immòbils. D'altra banda, també s'ha analitzat la implicació de diferents dominis en la funció de la proteïna MG312. En general, aquest estudi ha permès identificar dos dominis funcionals importants: un domini C-terminal que manté la integritat estructural de l'organela terminal i un domini N-terminal amb una implicació més específica en motilitat i/o divisió cel·lular. També s'ha analitzat la implicació específica dels motius EAGR i Walker A presents en el domini N-terminal. Per últim, la proteïna MG312 ha estat expressada de forma recombinant. Estudis de microsocòpia electrònica sobre la proteïna recombinant indiquen que aquesta proteïna mostra una notable semblança estructural amb les proteïnes SMC, implicades en el manteniment estructural dels cromosomes. En el tercer i últim treball s'ha abordat la identificació de gens involucrats en el control del moviment dels micoplasmes. Es descriu el desenvolupament d'un mètode, que ens ha permès aïllar un mutant deficient per la proteïna MG217 i que exhibeix alteracions en els patrons de moviment. Les dades obtingudes de la caracterització d'aquest mutant indiquen que la proteïna MG217 és un nou component de l'organela terminal implicat en promoure la inclinació d'aquesta estructura respecte el cos cel·lular. De manera interessant, aquestes alteracions en el grau d'inclinació de l'organela terminal es correlacionen amb els canvis observats en els patrons de moviment, suggerint que l'organela terminal actua com a un timó i determina la direcció del desplaçament dels micoplasmes. / This thesis is composed of three independent research works focused on the study of the structure and function of the terminal organelle in Mycoplasma genitalium.In the first work, we obtained and characterized P140 and P110 deficient mutants. These studies revealed a reciprocal posttranslational stabilization between P140 and P110 proteins, and that these proteins are required for cell adhesion and terminal organelle development. Loss of either P140 or P110 also correlates with decreased levels of the MG386 motility related protein and increased levels of the DnaK protein. In addition, several cytadherence-negative mutants that appear spontaneously at unexpectedly high rates were also examined. We found that these mutants were originated as a consequence of large deletions affecting the P140 and P110 coding genes. Furthermore, we demonstrated that these deletions are the product of recombination events involving sequences of the P140 and P110 coding genes and DNA repetitive elements that are distributed along the M. genitalium genome. The recombinative origin of these deletions provides a plausible explanation for the unexpectedly high rates of appearance of these mutants and opens the possibility of the existence of a phase variation mechanism to switch on and off the expression of the M. genitalium P140 and P110 cytadhesins. In the second work, we investigated the role of the MG312 protein in the function and architecture of the terminal organelle. We found that MG312 protein is a structural component essential to maintain the integrity of the terminal organelle and its components. As a consequence, MG312 deficient mutants loss the terminal organelle and exhibit an intermediate-cytadherence phenotype and a complete absence of gliding motility. On the other hand, we also examined the contribution of different domains in the MG312 protein function. This study allowed us to identify two separate and functional domains: a C-terminal domain implicated in the terminal organelle assembly functions and an N-terminal domain involved specifically in gliding motility and/or cell division. The specific contribution of the EAGR box and Walker A box found in the N-terminal region was also examined. Finally, MG312 was expressed in a recombinant way and its structure was analyzed by using electron microscopy. Images obtained showed that this protein exhibits a surprising structural similarity with SMC proteins, involved in the structural maintenance of chromsomes.In the third and last work we aimed to identify genes related to the regulation of the mycoplasma cell movement. We developed a straightforward procedure that allowed us to isolate a MG217 deficient mutant exhibiting an altered gliding behaviour pattern. Further characterization of this mutant revealed that the MG217 protein is a novel terminal organelle component involved in the curving of this structure in M. genitalium cells. Interestingly, changes in the tilt angle between the terminal organelle and the cell body correlates with the observed changes in the gliding behaviour, suggesting that the terminal organelle operates as a guide to steer the mycoplasma cell in specific directions.

Els micobacteris són un grup de microorganismes de gran importància clínica, ja que existeixen múltiples espècies que són agents causals de diverses malalties humanes amb unes importants morbiditat i mortalitat. Entre aquest grup de micobacteris patògens cal destacar Mycobacterium tuberculosis i Mycobacterium leprae, agents causals de la tuberculosi i la lepra, respectivament. D'altra banda, a part dels microorganismes que constitueixen els complexes M. tuberculosis i M. leprae trobem un grup nombrós de micobacteris, format per micobacteris atípics o micobacteris ambientals (MNT). Aquest grup engloba la resta d'espècies micobacterianes no incloses en els dos grups anteriors. De les més de 130 espècies descrites de MNT, aproximadament un terç podrien estar relacionades amb malalties en humans i ser les responsables de les anomenades micobacteriosis, encara que, a diferència del complex M. tuberculosis i M. leprae, les espècies de MNT no són patògens obligats. Els MNT tenen una gran capacitat de prevalença en aigües de distribució i això és degut principalment a la seva capacitat de créixer en un ampli rang de condicions ambientals i, sobretot, a la seva capacitat de colonitzar superfícies. La motilitat i la capacitat d'adherir-se a superfícies són algunes de les respostes funcionals que es manifesten en el procés de colonització d'una superfície. Per tant l'estudi de la motilitat, la hidrofobicitat i la capacitat d'adhesió a diferents materials ens pot ajudar a entendre i determinar els mecanismes de colonització, persistència i transmissió dels MNT en el medi ambient.En el gènere Mycobacterium, els efectes de la morfologia colonial en les funcions biològiques són múltiples. Diferents estudis, en Mycobacterium avium, Mycobacterium abcessus i Mycobacterium smegmatis, mostren una relació directa entre la morfologia colonial, la motilitat, la hidrofobicitat, l'adhesió cel·lular i la formació de biopel·lícules en superfície, a més a més de relacionar aquestes funcions biològiques amb la presència en la paret cel·lular d'aquests micobacteris d'un tipus específic de glicolípids anomenats glicopeptidolípids.Aquesta tesi s'ha centrat a estudiar i relacionar la morfologia colonial amb les funcions biològiques (motilitat, hidrofobicitat, adhesió cel·lular i formació de biopel·lícules en superfície), descrites inicialment en M. avium, M. abcessus i M. smegmatis, en un altre grup de micobacteris ambientals, Mycobacterium aurum, Mycobacterium chubuense, Mycobacterium gilvum, Mycobacterium obuense, Mycobacterium parafortuitum i Mycobacterium vaccae. Aquestes espècies micobacterianes tenen en comú que són de creixement ràpid, presenten originàriament una morfologia colonial llisa i, segons els estudis comparatius del 16S ARN, són filogenèticament properes entre elles, a la vegada que filogenèticament distants de les espècies micobacterianes ja estudiades. En aquest sentit, ens vem proposar obtenir de forma espontània, a partir de les colònies llises de M. aurum, M. chubuense, M. gilvum, M. obuense, M. parafortuitum i M. vaccae, variants rugoses estables les quals van ser aïllades en cultiu pur. Posteriorment, ens vem centrar en analitzar els lípids i glicolípids de la paret cel·lular d'aquests micobacteris mitjançant cromatografia de capa fina per a comprovar si s'observaven diferències en la composició lipídica i glicolipídica entre les dues variants morfològiques. A més, es va dur a terme l'estudi comparatiu de la capacitat de motilitat, de les característiques hidrofòbiques, de l'adhesió cel·lular i de la formació de biopel·lícules en la interfase líquid-aire entre les dues morfologies colonials en les diferents espècies estudiades. I, finalment, es van fer estudis genètics per determinar les bases moleculars relacionades amb els canvis de morfologia colonial en M. vaccae. / Mycobacteria are a clinically important group of microorganisms due to the fact that there are some species which are causal agents of human diseases with high morbidity and mortality. Among this group of pathogenic mycobacteria it has to be highlighted Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium leprae, which are, respectively, the causal agents for tuberculosis and leprosy. Besides, apart from the microorganisms which constitute the complexes M. tuberculosis and M. leprae, there is a large group of mycobacteria species which includes atypical or environmental mycobacteria (NTM). This group comprises the other mycobacteria species which have not been included in both groups before mentioned. At least a third out of the 130 NTM described could be related to human diseases and could be responsible for mycobacteriosis, although, unlike complex M. tuberculosis and M. leprae, NTM species are not obligated pathogens.NTM have a great capacity to remain in the environment, and this is mainly due to their capacity to grow in a wide range of environmental conditions and, overall, due to their capacity to colonize surfaces. The motility and the capacity to adhere to many different surfaces are some of the functional responses which appear in a surface colonization process. That is why the study of motility, hydrophobicity and adhesion to many materials can help us to understand and determine the colonization, persistence and transmission mechanisms of NTM in the environment.In Mycobacterium genus, the effects of colonial morphology in the biological functions are numerous. Different studies in Mycobacterium avium, Mycobacterium abcessus and Mycobacterium smegmatis, show a direct connection among colonial morphology, motility, hydrophobicity, cellular adhesion and biofilm formation. These biological functions are also connected with the presence in these mycobacteria cell wall of a specific type of glycosylated peptidolipids named glycopeptidolipids (GPLs).This thesis has been focused on studying and connecting colonial morphology with biological functions (motility, hydrophobity, cellular adhesion and the biofilm formation), which have been described previously in M. avium, M. abcessus and M. smegmatis, in another environmental mycobacteria group, Mycobacterium aurum, Mycobacterium chubuense, Mycobacterium gilvum, Mycobacterium obuense, Mycobacterium parafortuitum and Mycobacterium vaccae. These species have in common that they are fast growing, show an originally smooth colonial morphology and, according to comparative 16S ARN studies, they are phylogenetically nearby among them but phylogenetically distant of the other mycobacteria species already studied. Moreover, none of these last species possess GPLs in their cell wall.In this sense, we proposed to obtain spontaneous rough variants from the original smooth colonies of M. aurum, M. chubuense, M. gilvum, M. obuense, M. parafortuitum and M. vaccae. Afterwards, we analyzed and compared the lipid and glycolipid composition of the cell wall between both morphological variants by thin layer chromatography. In addition, we carried out the comparative study about the motility capacity, hydrophobical characteristics, cellular adhesion and biofilm formation in liquid-air interface between both colonial morphologies studied. And, finally, genetic studies were realized in order to determine the molecular bases connected with the changes in the colonial morphology in M. vaccae.

En aquest treball, hem estudiat la motilitat de les cèl·lules de M. genitalium i hem desenvolupat un mètode que ens ha permès aïllar trenta mutants deficients en motilitat d'aquest microorganisme. La caracterització dels mutants aïllats, ens ha permès identificar cinc gens que redueixen la capacitat de desplaçament de les cèl·lules. / In this work, we analyzed the motility of Mycoplasma genitalium and we developed a straightforward procedure to isolate gliding deficient mutants of this microorganism. Characterization of the thirty mutants isolated, allowed us to identify five genes that are required for locomations.