Abstract For decades, the mammalian kidney has served as a model system for studying developmental processes, such as induced epithelialization, branching morphogenesis, and cell differentiations. The possibility to recapitulate and follow the renal organogenesis ex vivo in organ culture set-ups has provided a large amount of molecular and cellular information about sequential events during development. However, certain limitations remain when combining traditional organ culture set-ups with modern molecular technology. This thesis seeks to address these disadvantages. In the experimental part of the thesis, the traditional organ culture set-ups were studied, modified, and optimized to meet the needs of functional genetic screening. First, the traditional transfilter- induced nephrogenesis was characterized with a panel of nephron segment specific markers to reveal the differentiation level of in vitro developing mouse renal tissue. A comprehensive genome wide time course microarray analysis was also performed to in vitro- induced metanephric mesenchyme. Next, to improve the accessibility of genetic tools into the three- dimensional organ in culture, the classic kidney culture set-ups were modified to tolerate dissociation and re-aggregation before the induction of nephrogenesis. This step was achieved with the aid of preservative growth factors offering a 24- hour window to manipulate the genetic and cellular composition of the explant. The dissociation and re-aggregation per se had not particular effect on the progress of the nephron differentiation. Demonstrations of the addition and removal of cells, as well as a virus vector mediated gene knock in and knock down are presented. The gene expression data, together with the novel organ manipulation and culture techniques presented in this thesis, provide a useful guide and specific tools to further characterize the details of nephron development and differentiation in functional manner. / Tiivistelmä Nisäkkäiden munuainen on toiminut vuosikymmeniä mallielimenä tutkittaessa kehitysbiologisia tapahtumasarjoja, kuten epitelisaatiota, haaroittumismorfologiaa sekä solujen erilaistumista. Munuaisaihioita voidaan viljellä laboratorio-olosuhteissa, jolloin kehityksen aikaisia muutoksia päästään seuraamaan lähes reaaliaikaisesti. Perinteisten kudosviljelytekniikoiden tarjoamat mahdollisuudet solujen molekulaariseen muokkaukseen ovat kuitenkin varsin rajalliset. Tässä väitöskirjassa esitettävät tulokset pyrkivät osaltaan vähentämään näitä rajoitteita. Väitöskirjan kokeellisessa osassa tarkastellaan lähemmin klassista munuaiskudosviljelyä sekä esitetään siihen tehtyjä optimointeja, joiden avulla kudosviljelyä pyritään hyödyntämään geenien toiminnan tutkimuksessa. Aluksi perinteisellä tavalla reikäisen kalvon läpi indusoitu nefroni karakterisoitiin tarkasti hyödyntäen useita erilaistumista osoittavia merkkimolekyylejä. Lisäksi samalla tekniikalla tuotettujen munuaiskudosviljelmien geeniekspressiota tutkittiin mikrosiruanalyysillä. Klassisia kudosviljelytekniikoita muokattiin soveltuvammaksi moderneille geneettisille työkaluille. Munuaiskudos hajotettiin ensin solususpensioksi, jonka jälkeen solut muodostivat uudelleen kolmiulotteisen, kudosmaisen rakenteen. Hyödyntämällä suojaavia kasvutekijöitä, hajotus kyettiin tekemään jo ennen nefronien muodostumisen alkua. Näin saavutettin 24 tunnin aikaikkuna indusoimattoman kudoksen geneettiselle muokkaukselle. Väitöskirjassa esitelläänkin demonsrtaatiot solujen lisäämisestä ja poistamisesta sekä virusvälitteisestä geenin aktivoinnista ja hiljennyksestä hyödyntäen uutta kudosmanipulaatio ja –vilejelytekniikkaa. Nefronin kehityksen aikaisen geeniekspression kartoitus sekä tässä tutkimuksessa kehitetyt uudet kudosmanipulaatio ja -viljelytekniikat tarjoavat yhdessä työkaluja molekyylitason yksityiskohtaiseen tutkimiseen.

Abstract Kidney diseases affect an increasing number of people worldwide, and there is a growing demand to develop new treatments and increase the number of transplantable organs. New treatments can be designed when new knowledge is gained by studying the details of kidney development. The ex vivo culture techniques have been used for over a century to study the development of kidneys, but they are not optimal for long-term imaging and following the nephrogenesis process over time. Kidney organoids, which are cellular aggregates resembling the in vivo kidney, together with intact embryonic kidneys, present a platform for these studies. However, there are limitations when working with primary embryonic kidney cells. Primary embryonic metanephric mesenchymal cells are usually low in number and lose the ability to undergo nephrogenesis rapidly. New ways to culture, biobank, and transfect cells can offer ways for functional testing of the effects of different genes on the nephrogenesis. This study presents new tools for studying nephrogenesis. Time-lapse imaging of organ development may be enhanced by using a Fixed Z-direction (FiZD) culture system where the kidney explant is grown in a restricted 70μm space. The technique enables the segmentation of the individual cells in a two-dimensional image and a dynamic analysis of the time-lapse data. This study also presents a technique of dissociation and reaggregation of the uninduced kidney metanephric mesenchyme (MM). With this novel method of culturing the dissociated MM cells in a growth factor medium for 24 hours, the cells can keep their competence for nephrogenesis. This technique allows the genetic manipulation of the MM cells before the induction to form nephrons, allowing functional testing of genes in the metanephric mesenchyme. This study further presents different techniques for gene editing of MM cells and introduces biobanking of primary kidney cells. It is shown here that the MM and ureteric bud (UB) cells have the capability to remember their fates and build nephron-like structures or continue branching after the cryopreservation in the liquid nitrogen. The methods introduced here provide new ways to create kidney organoids, manipulate their genome, and biobank the primary embryonic kidney cells. The developed FiZD culture system enhances the imaging of kidney development compared to the previously used culture methods. Using this method, the morphogenesis of the developing kidney can be followed more precisely, even in a single cell level. This culture method may also be used to culturing other organs, such as ovary, and may help provide insights into the development of other tissues as well. / Tiivistelmä Munuaissairauksiin sairastuvien määrä on lisääntynyt maailmanlaajuisesti, ja se on aikaansaanut tarpeen uusien hoitokeinojen sekä siirtoelimien kehitykseen. Näiden kehittämiseksi tarvitsemme uutta tietoa munuaisen kehityksestä ja toiminnasta. Munuaisen kehitystä on tutkittu ex vivo -viljelyn avulla jo yli vuosisadan ajan, mutta nykyiset elinviljelytekniikat eivät ole kuitenkaan optimaalisia pitkäkestoiseen time-lapse-kuvaukseen. Tässä työssä käytetään munuaisen kehityksen tutkimiseen hiiren alkion munuaisia sekä munuaisorganoideja, jotka ovat munuaissoluista koostuvia ja aitoa munuaista mallintavia soluaggregaatteja. Primaaristen munuaissolujen käyttöön sisältyy rajoitteita, ja tämä luo tarpeen uusien organoiditekniikoiden kehitykseen ja optimointiin. Primaarisia munuaissoluja on yleensä käytettävissä pieniä määriä, ja ne eivät myöskään sovellu pitkäkestoiseen kasvatukseen, koska ne menettävät nopeasti kykynsä muodostaa nefroneita. Uusien tekniikoiden avulla voidaan parantaa näiden solujen kasvatusta, säilytystä ja transfektointia ja edistää eri geenien vaikutuksia tutkivat funktionaaliset testaukset. Tässä tutkimuksessa esitetään uusia työkaluja nefrogeneesin tutkimiseen. Elinten kehitystä seuraavan time-lapse-kuvauksen laatua voidaan parantaa käyttämällä tässä työssä esitettyä FiZD-kasvatusmenetelmää, jossa munuaiseksplantti kasvaa rajoitetussa 70μm:n tilassa. Kuvat ovat korkealaatuisia, ja se mahdollistaa 2D-kuvan yksittäisten solujen segmentoinnin ja solujen liikkeiden dynaamisen analyysin. Lisäksi tässä tutkimuksessa esitetään ei-indusoidun munuaismesenkyymin käsittelyyn kehitetty dissosiaatio- ja reaggregaatiomenetelmä. Munuaisen kehityksen alkuvaiheessa on mahdollistaerottaa nefroneja muodostava metanefrinen mesenkyymi (MM) sekä munuaisen kokoajaputkiston muodostava ureterin silmu. Metanefrinen mesenkyymi voidaan hajottaa yksisolususpensioksi, säilyttää 24 tuntia kasvutekijämediumissa ja tämän jälkeen reaggregoida ja indusoida muodostamaan nefroneita. Tämä tekniikka mahdollistaa MM-solujen geneettisen muokkauksen, ennen kuin munuaisen kehitys alkaa. Tämä tekniikka mahdollistaa myös dissosioitujen MM solujen geneettiset muokkaukset. Geenien yliekspression tai hiljentämisen avulla voidaan tehdä funktionaalisia kokeita näiden muutosten vaikutuksesta nefrogeneesiin. Lisäksi tässä työssä esitetään munuaisprogenitorisolujen säilömistä syväjäädytyksellä. Munuaisprogenitorisolut voidaan säilöä nestetyppeen, minkä jälkeen ne ovat edelleen kykeneviä muodostamaan nefronirakenteita tai haarautumaan. Tässä väitöskirjatyössä esitettyjen menetelmien avulla on tulevaisuudessa mahdollista saada lisätietoa munuaisten kehitysprosessista. Kehitetty FiZD-kasvatusmenetelmä parantaa munuaisen kehityksen kuvantamista ja mahdollistaa yksittäisten solujen seuraamisen. Tämä kasvatusmenetelmä sopii myös muiden elinten, kuten munarauhasten, ja kudosten kasvatukseen, ja sen avulla voidaan saada tietoa myös niiden kehityksestä.

Abstract This thesis focuses on mammalian kidney development and in particular on the question of how two Wnt signalling pathway genes, an antagonistic Dkk1 and an agonistic ligand Wnt5a, regulate the process. Wnts are secreted ligands that are involved in many developmental processes, including gonadal differentiation and kidney development, but also in various diseases and malformations. Wnts form a large signalling family containing 19 different glycoprotein ligands in mammals. Wnt signalling occurs via two different intracellular pathways. A canonical pathway proceeds via beta-catenin, and a non-canonical pathway utilizes other signalling molecules. Dkk1 is an antagonist of the canonical pathway and Wnt5a is considered a ligand that activates the non-canonical signalling pathway. As part of the thesis, I have studied the role of Dkk1 in kidney morphogenesis using a conditional mouse model, in which the gene is deleted in a cell specific manner from the collecting ducts. Dkk1 deficiency increased renal papilla growth and the risk of hydronephrosis. Research pointed out that the lack of Dkk1 in the collecting ducts increased cell proliferation and disturbed the balance of canonical Wnt signalling, which led to an overgrowth of renal papilla. This led to functional phenotypes including increased water reabsorption and changes in ion secretion/absorption. These changes are most likely due to altered Wnt7b signalling. The second part of the thesis examines the role of the non-canonical Wnt5a gene in kidney development with a conventional knock out mouse model. At the time work began on the thesis, no corresponding kidney phenotype had been published. The primary finding in kidneys lacking Wnt5a was an altered basement membrane organization of the collecting ducts and glomeruli. The phenotype is most likely the reason behind morphological phenotypes which vary from bilateral kidney agenesis to duplex collecting system. Notably, during the course of this study we found a mutation in the human WNT5A gene of a CAKUT patient. This is the first time Wnts have been shown to organize kidney development via basement membrane formation. / Tiivistelmä Tämän väitöskirjan tarkoituksena on ollut tutkia munuaisen kehitystä ja kuinka kaksi Wnt-signalointireitin geeniä, signalointia estävä Dkk1 ja signalointia edistävä Wnt5a säätelevät sitä. Wnt ligandit ovat eritettäviä signaalimolekyylejä, jotka ovat osallisina monissa kehitysbiologissa prosesseissa kuten sukupuolen määräytymisessä ja munuaisen kehityksessä. Myös monissa taudeissa on havaittu muuntuneita Wnt geenien tuottotasoja. Wnt-geenit muodostava suuren signalointimolekyyliperheen, johon lukeutuu 19 jäsentä nisäkkäillä ja Wnt-signointi on jaettu perinteisesti kahteen signalointiryhmään. Dkk1 on kanonisen Wnt-signaloinnin estäjä ja Wnt5a:ta pidetään pääsaantiöisesti ei-kanonisena Wnt-ligandina. Väitöskirjassani olen tutkinut Dkk1 geenin toimintaa kohdennetussa Dkk1-poistogeenisessä hiiressä, jossa geenin toiminta on poistettu spesifisesti munuaisen kokoojaputkista. Dkk1:n puutos johtaa munuaisen papillan kasvuun ja lisää riskiä hydronefroksen muodostumiseen. Tutkimukset osoittivat että Dkk1:n puutos aiheuttaa lisääntynyttä solujakautumista kokoojaputkissa, jolloin Wnt-signaloinnin muutos aiheuttaa papillan ylikasvua. Ylikasvusta seuraa lisääntynyttä veden takaisin imeytymistä ja muutoksia ionien erittämisessä ja takaisin imeytymisessä. Todennäköisimmin muutokset johtuvat muuntuneesta Wnt7b signaloinnista, jota Dkk1 normaalisti säätelee. Väitöskirjan toisessa osassa tutkittiin ei-kanonisen reitin Wnt5a ligandin roolia munuaisen kehityksessä käyttäen poistogeenistä hiirimallia, jossa Wnt5a:n roolia munuaisenkehityksessä ei ollut julkaistu työn aloituksen aikaan. Wnt5a:n puutoksen havaittiin vaikuttavan tyvikalvon järjestymiseen kokoojaputkissa ja munuaiskeräsessä. Tyvikalvon häiriö on todennäköisin syy morfologisiin muutoksiin, jotka vaihtelevat molempien munuaisen puuttumisesta kaksois-kokoojatiehyen muodostumiseen. Työssä osoitetaan ensimmäistä kertaa kuinka Wnt-signalointireitin proteiinit säätelevät munuaisen kehitystä tyvikalvon muodostuksen kautta.