L’adaptateur Lnk est un inhibiteur clé dans le système hématopoïétique. Son invalidation chez la souris entraîne l’hyperprolifération des lignages myéloïdes (mégacaryocytaire et érythoïde). Les cellules Lnk présentent une hypersensibilité à certaines cytokines dont la Trombopoïétine (TPO) et l’Erythropoïétine (EPO) et la dérégulation de leurs voies de signalisation (JAK/STAT et MAPK). D’autre part, le phénotype Lnk s’assimile aux caractéristiques trouvées chez les patients atteints des syndromes myéloprolifératifs (SMPs), suggérant un rôle clé de Lnk dans ces maladies. L’identification récente des mutations de LNK dans ces hémopathies l’a confirmé. Ainsi, l’objectif de mon travail de thèse était de définir les mécanismes moléculaires par lesquels Lnk régule la mégacaryopoïèse en disséquant son interaction avec son partenaire, la kinase JAK2, dans la voie TPO/Mpl. En parallèle, nous avons visé à déterminer le rôle de Lnk dans la pathogénèse de SMPs. Afin d’étudier le rôle de Lnk dans les SMPs, nous avons effectué une analyse transcriptionnelle de Lnk dans les cellules CD34 et les plaquettes de patients exprimant JAK2WT ou JAK2V617F. Nos résultats ont montré uns surexpression de Lnk, dans les témoins sains. Cette surexpression est due à l’induction de l’expression de Lnk par la TPO, montrant une boucle de rétrorégulation par Lnk de la voieTPO/Mpl/JAK2. Par ailleurs l’analyse de l’interaction Lnk/JAK2 dans les plaquettes des patients atteints de SMPs a démontré que Lnk est capable de s’associer à JAK2 (JAK2WT et JAK2V617F) E outre cette liaison est indépendante de la stimulation par la TPO et abouti à une phosphorylation constitutive de Lnk.Notre analyse au niveau moléculaire de l’interaction Lnk/JALK2 a révélé, qu’en plus du domaine SH2 de Lnk, la région N-terminale et le domaine PH de Lnk ont un nouveau rôle important dans l’inhibition de la kinase JAK2. Nous avons également montré une association entre Lnk et les formes mutées dans les SMPs, JAK2V617F ou JAK2K539L avec une infimité plus élevée qu’avec JAK2WT, suggérant ainsi une régulation différentielle de ces formes par Lnk. L’analyse fonctionnelle de ces formes par Lnk. L’analyse fonctionnelle par des essais de prolifération cellulaire, a montré que Lnk, inhibe la croissance de cellules exprimant JAK2V617F et ceci de manière dos-dépendante. Nous avons ensuite entrepris l’étude des effets des mutations de LNK (LNKG152R et LNKE208Q) identifiées dans les SMPs. Nos résultats ont indiqué que seule la mutation LNKE208Q semble affecter la localisation membranaire de l’adaptateur. De plus nous avons montré que cette mutation de LNK altère son effet inhibiteur sur la croissance cellulaire dépendante de JAK2, contrairement à la mutation de LNKG152R ayant elle-même un effet modéré. Ces résultats montrent que ces mutations de LNK affectent différemment les réponses cellulaires dépendantes de JAK2 dans les SMPs. Ainsi, nos données suggèrent que la région N-terminale et le domaine PH de LNK sont importants pour moduler sa fonction inhibitrice sur JAK2. L’ensemble de nos travaux nous a permis une meilleure caractérisation de la régulation de la kinase JAK2, par Lnk dans la voie de le TPO. Ainsi, une déstabilisation du complexe Lnk/JAK2 affecte la fonction inhibitrice de l’adaptateur, ce qui peut contribuer au développement de désordres hématopoïétiques. L’interaction différentielle entre Lnk et les formes JAK2WT ou mutées suggère la possibilité d’utiliser Lnk comme outil thérapeutique innovant dans les SMPs, et éventuellement dans les autres hémopathies. / The Lnk adaptor is a key inhibitor of cytokine signaling during hematopoiesis. Lnk mice show abnormal magakaryopoiesis due to loss of Lnk inhibition of thrombopoietin (TPO)-mediated JAK2/STAT and MAPK activation. The ressemblance between Lnk phenotype and Myeloproliterative Neoplasms (MPNs) features together with the identification of LNK mutations in MPNs patients suggest a role for Lnk in these diseases. We aimed to characterize the functional role of Lnk in regulating magakaryopoiesis and also define its role in MPN pathogenesis. Transcriptional analysis of Lnk in MPN cells (expressing JAK2WT and mutated form JAK2V617F) showed its overexpression, notably in JAK2V617F-positive patients. This increase in Lnk level is partly due to its up-regulation by TPO. Studies on TPO-simulated MPN Platelets revealed the interaction between Lnk and JAK2 and the subsequent Lnk phosphorylation. Our molecular analysis showed that Lnk/JAK2 binding occurs via Lnk SH2 domain and revealed a new role for its N-terminal and PH doamins in the regulation of the kinase. We also showed that Lnk binds more strongly to JAK2V617F and JAK2K539L, mutated in MPNs, that with JAK2WT, suggesting that the adaptor regulates differently the JAK2 forms. Moreover, the overexpression of Lnk in JAK2V617F celles showed a dose dependent growth inhibition.Furthermore, our analysis of the LNK mutations found in MPNs, G152R in N-terminal and E208Q PH domains showed that only the E208Q mutation affect Lnk subcellular localization. Moreover, we demonstrated that these mutations, and mostly E208Q, alter the inhibitory function of Lnk on cell growth in JAK2V617F- expressing cells. Altogether, our results show that Lnk is involved in the regulatory loop TPO/Mpl receptor/JAK2 essential in magakaryopoiesis. Thus, changes in Lnk expression and its JAK2 binding can contribute to the developement of MPNs. The differential binding of Lnk with JAK2WT and mutated forms suggests a potential therapeutic use of the adaptor in the MPNs.

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De part leur importance médicale, leur capacité à évoluer et leur facilité de manipulations, les bêta-lactamases TEM-1 et plus récemment CTX-M-15, se sont imposées comme des modèles de biochimie mais aussi des modèles pour une étude évolutive des protéines. La caractérisation de la distribution de l'effet des mutations dans une protéine permet d'avancer dans la compréhension des mécanismes moléculaires et des contraintes influant sur l'évolution des gènes de résistance aux antibiotiques et de façon plus globale sur les protéines.Par une approche de mutagénèse exhaustive suivie d’une évolution expérimentale sous sélection antibiotique couplée à du séquençage à haut débit, nous avons pu déterminer et décrire la distribution des effets des mutations dans la protéine TEM-1. Trois catégories de mutants ont été identifiées comme ayant des comportements différents en termes de cinétique de mort face à l'antibiotique. Des études phénotypiques ont permis de proposer un scénario impliquant une saturation progressive des principales protéines liant la pénicilline en fonction de l’activité hydrolytique du mutant de bêta-lactamase. Enfin, un modèle biochimique qualitatif compatible avec cette cinétique est proposé. La comparaison des effets des mutations entre TEM-1 et CTX-M-15, deux bêta-lactamases de la famille des sérines protéases de classe A et homologue à 30%, permet d’étudier la notion de contexte-dépendance des mutations. Notamment, à travers le résidu 251 qui est différent entre ces 2 protéines et intolérant aux mutations, nous replaçons cette problématique dans une perspective évolutive globale. Cela nous permet d’étudier les incompatibilités mutationnelles au sein des protéines et les possibilités de compensation des sites destabilisés. Nous observons une compensation à la fois globale, au travers de l’effet sur la stabilité, mais aussi locale avec une épistasie forte entre le résidu 251 et le site compensateur. Enfin, afin d’étudier de façon exhaustive les intéractions épistatiques dans les protéines, nous nous sommes focalisés sur une hélice alpha de la protéine TEM-1. L’étude de près de 73% des 22000 combinaisons mutationnelles possibles a permis de souligner l’importance de la stabilité thermodynamique, celle-ci expliquant une grande part des effets des mutations. Cependant, un contingent d’interactions ne semble pas expliquable par ce modèle ce qui montre l’importance des interactions locales au sein des hélices. Le couplage de ces approches évolutives quantitatives et mécanistiques permettent à la fois d’avancer dans la compréhension des contraintes qui sous-tendent l’évolution des protéines mais aussi de plonger au cœur de la résistance aux antibiotiques et de ses mécanismes moléculaires. / Beta-lactamases TEM-1 and more recently CTX-M-15 are antibiotic resistance enzymes that combine a medical importance, a fast evolution in the wild and are easy amenable to manipulation in the laboratory. As such, they have become models of biochemistry and also models for the study of protein evolution. The characterization of the distribution of mutational effect within a protein shed light on the molecular mechanisms and the constraints influencing the evolution of proteins.Using an exhaustive mutagenesis approach followed by an experimental evolution under antibiotic selection coupled with high-throughput sequencing, we were able to determine and describe the distribution of the effects of mutations in the TEM-1 protein. Three categories of mutants have been identified as having different behaviors in terms of survival kinetics when facing the antibiotic. Phenotypic studies have allowed us to propose a scenario involving a progressive saturation of the main penicillin-binding proteins as a function of the hydrolytic activity of the beta-lactamase mutant. Finally, a qualitative biochemical model compatible with this kinetic is proposed.I then compared the fitness effects of mutations in TEM-1 and CTX-M-15, which are two beta-lactamases of the class A serine protease family with 30% homology. I focused on the context dependency of mutation effects and concentrated my analysis on residue 251, which harbor a different aminoacid in each of the enzyme that is not functional when inserted in the other protein. I further studied how mutations in the rest of the protein could compensate that incompatibility. Compenstation was found to be associated to mutations acting presumably through on overall effect on protein stability, and on some cases to some local interactions with residue 251.Finally, in order to study exhaustively the epistatic interactions in proteins, we focused one alpha helix of TEM-1. The study of nearly 73% of the 22,000 possible mutational combinations made it possible to underline the importance of thermodynamic stability, which explains a large part of the effects of mutations. However, a contingent of interactions does not seem to be explained by this model, which shows the importance of the local interactions within the helices.The coupling of these quantitative and mechanistic evolutive approaches makes it possible both to advance in understanding the constraints underlying the evolution of proteins but also to plunge into the heart of resistance to antibiotics and its molecular mechanisms.

The basic aim of this thesis was to identify a suitable approach for prevention of thalassaemia in Pakistan. The overall carrier rate for β-thalassaemia was 5.3%. The rate varied by ethnic group, i.e. Punjabi: 4.5%, Pathan: 5.2%, Sindhi: 1.3%, Baluchi: 9% and Mohajir: 5.2%. The annual birth rate of affected children was estimated at 1.35 per 1000. Screening for α-thalassaemia showed 6% carrier rate for α -3.7 genotype. Approaches for identifying carriers and at risk couples were investigated in pregnant females, but proved to be technically difficult and cost ineffective. By contrast screening in ten index families with haemoglobin disorders identified 21-70% (mean 31%) carriers per family. No carrier was identified in five control families without a history of haemoglobin disorder. Follow-up for one year in the families screened showed a significant effect on the marriage choices. Molecular basis of thalassaemia was investigated in 1240 mutant alleles in all ethnic groups. 19 different mutations were found including one novel allele. The five commonest mutations accounted for 81% of the alleles. The pattern of mutations was significantly different in the ethnic groups studied. 7.5% of patients on blood transfusions had thalassaemia intermedia, and its genetic basis included Xmn-1 +/+ genotype (36%) and mild mutations (31%). Coincidental α-thalassaemia was found or suspected in 38% of cases of thalassaemia intermedia. Prenatal diagnosis of thalassaemia was introduced for the first time in Pakistan and in the two years of the study 158 couples used the test. All couples, except two, already had at least one affected child. They had better education and socio-economic status than the controls and 93% requested termination of pregnancy when the fetus was affected. Over 98% of the diagnoses were done by direct mutation analysis. A multiplex polymerase chain reaction for mutation analysis was developed and significantly reduced the total cost and time required for prenatal diagnosis. Consanguineous marriage and recessive disorders were studied in the nine index and the five control families. In 319 couples studied 46% were consanguineous, 52% were Biradri/Tribe members, and only 6% were completely unrelated. Consanguineous marriage (2nd cousins or closer) had increased from 12% in the 1St generation to 45% in the 2nd generation. Antecedent consanguinity had significant effect on the kinship coefficient of the close as well as distant relatives. There was only a marginal difference in coefficient of inbreeding, calculated in a random population sample by conventional methods (0.0257) and by allele frequencies at the D21S11 locus (0.0272). Morbidity and mortality from genetic causes was significantly higher in the children of consanguineous than the non-consanguineous couples living under similar socio-economic conditions. This pilot study appears to have identified a suitable approach for prevention of thalassaemia in Pakistan.

Le processus de croissance économique de la Chine ces dernières décennies, tiré principalement par la dynamique du secteur des exportations, est accompagné par une croissance démographique rapide. Cette croissance contribue à la création d’une base considérable de consommateurs potentiels et à la constitution d’un grand réservoir en ressources humaines. Faisant partie du groupe des pays dits « émergents », le cas de la Chine présente un intérêt particulier dans le but d’examiner dans quelle mesure la croissance économique se traduit par un processus simultané de développement, cette dernière notion étant étroitement liée à l’amélioration de la vie humaine. La thèse est structurée en trois parties principales. La première partie concerne l’analyse des mutations économiques et démographiques en Chine pendant les dernières décennies, notamment depuis la montée au pouvoir du Deng Xiao Ping en 1978. L’analyse opérée établit d’abord une distinction entre les processus de globalisation et de libéralisation économique, ce, simultanément avec l’évaluation des évolutions de population liées au processus de transition démographique. Dans cette même partie est proposée par la suite une analyse des changements institutionnels liés aux politiques appliquées dans un contexte économique et démographique fortement évolutif. Dans la deuxième partie, la construction d’une base de « diagnostic » concernant certains risques et opportunités liés aux défis du développement de la Chine dans la période actuelle permet de déboucher sur la formulation des principales hypothèses de la recherche. La troisième partie évalue les hypothèses de travail identifiées et tente de construire la distinction proposée entre croissance et développement. Au-delà de la construction et de l’évaluation des hypothèses, la posture épistémologique corollaire de la thèse consiste à appréhender en ouverture disciplinaire le phénomène de co-évolution entre les variables économiques et démographiques dans le cas chinois. Les questions posées autour de la notion du développement imposent, en effet, une approche bidisciplinaire, à la fois économique et démographique. / The process of economic growth in China during the last decades, mainly driven by the dynamics of the export sector, is accompanied by a simultaneous and rapid population growth. This growth contributes, in turn, to the creation of a vast amount of potential consumers, as well of a large human resources reservoir, at a national level. Being part of the group of countries well known as “emerging”, the case of China is of special interest, in order to examine if and how economic growth can result in a simultaneous development process, the latter concept being closely related to the improvement of human life.This PhD thesis is structured mainly in three parts. The first part concerns the analysis of economic and demographic changes in China over the last decades, especially since the rise to the country’s leadership of Deng Xiaoping in the year 1978. The analysis carried out first distinguishes the processes of economic globalization and liberalization, at the same time with the evaluation of population trends related to the demographic transition process. Later in the same part, an analysis of institutional changes becomes available, associated with the national policies applied in this highly evolving economic and demographic context. During the second part, the construction of a “diagnosis base” concerning selected risks and opportunities, related to the challenges on China’s development in the current period, allows us to formulate the key assumptions of this research. Finally, the third part comes exactly to evaluate our identified key assumptions, while attempting to define the proposed distinction between the concepts of growth and development. Apart from the construction and the evaluation of our key assumptions, the corollary epistemological posture of this thesis is to examine, through a disciplinary openness, the phenomenon of the co-evolution between economic and demographic variables in the Chinese case. The questions raised about the concept of development require, in fact, a bi-disciplinary approach, both from an economic and demographic view.

Ce travail de thèse comporte trois projets visant à approfondir la caractérisation moléculaire des adénocarcinomes du rein à cellules claires (ccRCC) et à en améliorer le diagnostic.Le premier projet traite de l’identification de mutations oncogéniques présentes dans les éléments régulateurs actifs du génome des ccRCC. L’utilisation de données de séquençage pangénomique de patients atteints de ccRCC et de données épigénétiques (ChIP-seq et ATAC-seq) de lignées cellulaires de cancer du rein a permis l’identification d’îlots de mutations situés dans ces éléments régulateurs. De plus, l’utilisation de données de RNA-seq a permis d’identifier plusieurs îlots de mutation associés à un changement d’expression génique, dont un situé dans le premier intron du gène WWC1. Ce gène appartient à la voie Hippo, connue pour être impliquée dans l’oncogenèse. Ce travail constitue la première étude à permettre l’identification de mutations non-codantes localisées sur des éléments régulateurs actifs définis dans un type cellulaire pertinent.Le deuxième volet de ce travail consiste en une étude des altérations moléculaires de la voie FGF/FGFR qui est actuellement la cible d’essais cliniques dans le ccRCC. Il a permis de suggérer une implication de l’activation de la voie FGF/FGFR dans l’oncogenèse du ccRCC et dans le pronostic vital des patients, notamment par l’action de régulateurs négatifs de cette voie tel que SEF.Enfin, la troisième partie concerne la mise au point d’un test de diagnostic non-invasif du ccRCC à partir de l’ADN circulant. Il a abouti à l’identification de biomarqueurs hyperméthylés et au développement de tests sensibles basés sur des qPCR spécifiques de la méthylation. / This thesis is composed of three projects looking to improve molecular characterization and diagnosis of clear cell renal cell carcinoma (ccRCC). The first project concern the identification of oncogenic mutations located on active regulatory elements of ccRCC. The use of whole-genome sequencing data of an hundred patients affected by ccRCC and epigenetic data (ChIP-seq and ATAC-seq) from renal cancer cell lines enabled the identification of mutation islands located in these active regulatory elements. Moreover, the use of RNA-seq data highlighted the association between some mutation islands and gene expression changes. One mutation island has been identified on a regulatory element located in the first intron of KIBRA. This gene is a member of the Hippo pathway known to be involved in ccRCC tumorigenesis. This pioneer work in integrating approach of genetic and epigenetic data consists in the first study that describes non-coding mutations located on active regulatory elements identified on a cell type relevant to the study. The second project consists of a study of the molecular alterations of the FGF/FGFR pathway, that is currently the target of clinical assays in ccRCC. It suggests an involvement of the FGF/FGFR pathway activation in ccRCC tumorigenesis and in patient prognosis, partly through the expression alterations of negative regulators of this pathway such as SEF.Finally, the set-up of a ccRCC non-invasive diagnostic test from circulating DNA has been initiated. Hypermethylated biomarkers have been identified and sensible tests based on methylation-specific qPCR  have been set up in the third project.

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