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Neuro- und Gliotoxizität von Wolframcarbid-basierten Nanopartikeln in vitro

Bastian, Susanne 12 October 2011 (has links) (PDF)
Die Anzahl neurodegenerativer Erkrankungen nimmt in unserer Gesellschaft stetig zu. Obwohl inzwischen eine Reihe genetischer Ursachen identifiziert worden sind, wird auch der Einfluss von Umweltfaktoren bei der Pathogenese dieser Erkrankungen zunehmend in Betracht gezogen. Der Beitrag von ultrafeinen Partikeln aus Industrie und Umwelt auf neurodegenerative Erkrankungen steht daher zunehmend im Fokus der Forschung. Die Translokation von ultrafeinen Partikeln bzw. Nanopartikeln ins Gehirn ist bekannt. Die Charakterisierung neuro- und gliotoxischer Wirkungen von Nanopartikeln in einem in vitro System war deshalb Ziel dieser Arbeit. Untersucht wurden Wolframcarbid-Partikel mit und ohne Cobalt, die im Herstellungsprozess von Hartmetallen von Bedeutung sind. Die meisten toxikologischen Daten wurden bisher mit mikrokristallinen WC-Pulvern an Lungenzellen bzw. -gewebe erhoben. Da aber die Verarbeitung von nanoskaligen Partikeln bessere Eigenschaften der Hartmetalle bewirkt, nimmt das Interesse an toxikologischen Studien mit WC-Nanopartikeln zu. Da die Gefahr der Translokation und Akkumulation im Gehirn beim Einatmen von Stäuben am Arbeitsplatz besteht, wurde erstmalig die Toxizität von WC-NP mit und ohne Cobalt auf Zellen des Gehirns untersucht. Für die Durchführung wurden primäre Neuronen, Astrozyten und Mikroglia sowie die Oligodendrozyten-vorläuferzelllinie OLN-93 der Ratte eingesetzt. Alle untersuchten Partikel konnten mittels Elektronenmikroskopie, ICP-Massenspektrometrie und Durchflusszytometrie in den verschiedenen Zelltypen nachgewiesen werden. Untersuchungen mit Cytochalasin D (Inhibitor der Aktinpolymerisation) deuteten auf zell- und partikelspezifische Aufnahmemechanismen hin. Experimente mit Cobaltchlorid und Natriumwolframat konnten beweisen, dass nicht die gelösten Ionen für die Toxizität von WC-Co ursächlich waren, sondern die Partikelform von entscheidender Bedeutung ist. Es zeigte sich jedoch, dass einige der WC-Co verursachten Effekte vermutlich auf dem Cobaltanteil beruhen. Offensichtlich dienen WC-Co-NP als Vehikel, um Cobalt in die Zellen einzuschleusen. Zur toxischen Wirkung trägt auch das Reaktionsvermögen von WC und Cobalt an der beiderseitigen Grenzfläche bei, denn dadurch können in der Zelle vermehrt reaktive Sauerstoffspezies gebildet werden. Im Rahmen der Untersuchungen wurden die zeit- und konzentrationsabhängigen Effekte der Nanopartikelexposition auf die Vitalität, die Proliferation, das Adhäsionsverhalten, das mitochondriale Membranpotential und die Induktion apoptotischer und nekrotischer Zelluntergänge untersucht. Dabei wurden verschiedene Vitalitäts- und Proliferationstests angewendet, um die häufig beobachteten Wechselwirkungen zwischen Reagenzien und Nanopartikeln auszuschließen. Nicht alle untersuchten Nanopartikel erwiesen sich in den durchgeführten Experimenten als akut toxisch. Nur eine Exposition mit WC-Co-NP führte nach 72 h zu einer deutlich verringerten Vitalität und Proliferation bei Astrozyten und OLN-93 Zellen. Eine Exposition mit WC-Co-NP zeigte des Weiteren eine geringe Induktion von Apoptose und Nekrose bei Astrozyten, nicht aber bei OLN-93 Zellen. Neurone wiesen nach einer Exposition mit NP eine wenig verringerte Vitalität auf. Es wurde festgestellt, dass erst die primäre Schädigung von Astrozyten zu einer sekundären Neuronenschädigung führt. Bei der Bewertung der NP-Toxizität müssen daher unbedingt die Wechselwirkungen der Zellen bedacht werden. Die Exposition mit WC- und WC-Co-NP beeinflusste das mitochondriale Membranpotential und das Adhäsionsverhalten der untersuchten Zellen. Neuronen und OLN-93 Zellen zeigten nach NP-Exposition eine verminderte Adhäsion. Auch physiologische Kalziummessungen lieferten einen Hinweis für die veränderte Funktionalität glialer Zellen nach einer NP-Exposition. Des Weiteren wurde die Expression einiger Gene, bedeutend für Adhäsion und extrazelluläre Matrix, mit realtime RT-PCR bei OLN-93-Zellen und Astrozyten überprüft. Es konnte eine Regulation von Mmp9, Timp1, Lama3, Tgfbi, Col8a1 und Hmox1 gezeigt werden. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die ausgewählten Nanopartikel nicht per se neuro- und gliotoxisch wirkten. Die Partikel können anhand abnehmender Toxizität wie folgt geordnet werden: WC-Co > WC 100na > WC 10n. Auch die Reaktionen der Zellen fielen unterschiedlich aus: die Astrozyten erwiesen sich als die sensitivsten Zellen. Eine Exposition des Gehirns mit WC-Co-NP in hohen Konzentrationen oder über einen längeren Zeitraum könnte also weit reichende Folgen haben, angefangen bei einer gestörten Signalweiterleitung über eine erhöhte Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke bis hin zu neurodegenerativen Veränderungen. Diese und weitere Untersuchungen könnten bei der Erstellung von Arbeitsrichtlinien im Umgang mit Hartmetallen, deren Ausgangsmaterial nanoskalige Pulver sind, hilfreich sein und damit einen Beitrag zum Schutz der Arbeiter liefern.
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Neuro- und Gliotoxizität von Wolframcarbid-basierten Nanopartikeln in vitro

Bastian, Susanne 20 January 2011 (has links)
Die Anzahl neurodegenerativer Erkrankungen nimmt in unserer Gesellschaft stetig zu. Obwohl inzwischen eine Reihe genetischer Ursachen identifiziert worden sind, wird auch der Einfluss von Umweltfaktoren bei der Pathogenese dieser Erkrankungen zunehmend in Betracht gezogen. Der Beitrag von ultrafeinen Partikeln aus Industrie und Umwelt auf neurodegenerative Erkrankungen steht daher zunehmend im Fokus der Forschung. Die Translokation von ultrafeinen Partikeln bzw. Nanopartikeln ins Gehirn ist bekannt. Die Charakterisierung neuro- und gliotoxischer Wirkungen von Nanopartikeln in einem in vitro System war deshalb Ziel dieser Arbeit. Untersucht wurden Wolframcarbid-Partikel mit und ohne Cobalt, die im Herstellungsprozess von Hartmetallen von Bedeutung sind. Die meisten toxikologischen Daten wurden bisher mit mikrokristallinen WC-Pulvern an Lungenzellen bzw. -gewebe erhoben. Da aber die Verarbeitung von nanoskaligen Partikeln bessere Eigenschaften der Hartmetalle bewirkt, nimmt das Interesse an toxikologischen Studien mit WC-Nanopartikeln zu. Da die Gefahr der Translokation und Akkumulation im Gehirn beim Einatmen von Stäuben am Arbeitsplatz besteht, wurde erstmalig die Toxizität von WC-NP mit und ohne Cobalt auf Zellen des Gehirns untersucht. Für die Durchführung wurden primäre Neuronen, Astrozyten und Mikroglia sowie die Oligodendrozyten-vorläuferzelllinie OLN-93 der Ratte eingesetzt. Alle untersuchten Partikel konnten mittels Elektronenmikroskopie, ICP-Massenspektrometrie und Durchflusszytometrie in den verschiedenen Zelltypen nachgewiesen werden. Untersuchungen mit Cytochalasin D (Inhibitor der Aktinpolymerisation) deuteten auf zell- und partikelspezifische Aufnahmemechanismen hin. Experimente mit Cobaltchlorid und Natriumwolframat konnten beweisen, dass nicht die gelösten Ionen für die Toxizität von WC-Co ursächlich waren, sondern die Partikelform von entscheidender Bedeutung ist. Es zeigte sich jedoch, dass einige der WC-Co verursachten Effekte vermutlich auf dem Cobaltanteil beruhen. Offensichtlich dienen WC-Co-NP als Vehikel, um Cobalt in die Zellen einzuschleusen. Zur toxischen Wirkung trägt auch das Reaktionsvermögen von WC und Cobalt an der beiderseitigen Grenzfläche bei, denn dadurch können in der Zelle vermehrt reaktive Sauerstoffspezies gebildet werden. Im Rahmen der Untersuchungen wurden die zeit- und konzentrationsabhängigen Effekte der Nanopartikelexposition auf die Vitalität, die Proliferation, das Adhäsionsverhalten, das mitochondriale Membranpotential und die Induktion apoptotischer und nekrotischer Zelluntergänge untersucht. Dabei wurden verschiedene Vitalitäts- und Proliferationstests angewendet, um die häufig beobachteten Wechselwirkungen zwischen Reagenzien und Nanopartikeln auszuschließen. Nicht alle untersuchten Nanopartikel erwiesen sich in den durchgeführten Experimenten als akut toxisch. Nur eine Exposition mit WC-Co-NP führte nach 72 h zu einer deutlich verringerten Vitalität und Proliferation bei Astrozyten und OLN-93 Zellen. Eine Exposition mit WC-Co-NP zeigte des Weiteren eine geringe Induktion von Apoptose und Nekrose bei Astrozyten, nicht aber bei OLN-93 Zellen. Neurone wiesen nach einer Exposition mit NP eine wenig verringerte Vitalität auf. Es wurde festgestellt, dass erst die primäre Schädigung von Astrozyten zu einer sekundären Neuronenschädigung führt. Bei der Bewertung der NP-Toxizität müssen daher unbedingt die Wechselwirkungen der Zellen bedacht werden. Die Exposition mit WC- und WC-Co-NP beeinflusste das mitochondriale Membranpotential und das Adhäsionsverhalten der untersuchten Zellen. Neuronen und OLN-93 Zellen zeigten nach NP-Exposition eine verminderte Adhäsion. Auch physiologische Kalziummessungen lieferten einen Hinweis für die veränderte Funktionalität glialer Zellen nach einer NP-Exposition. Des Weiteren wurde die Expression einiger Gene, bedeutend für Adhäsion und extrazelluläre Matrix, mit realtime RT-PCR bei OLN-93-Zellen und Astrozyten überprüft. Es konnte eine Regulation von Mmp9, Timp1, Lama3, Tgfbi, Col8a1 und Hmox1 gezeigt werden. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die ausgewählten Nanopartikel nicht per se neuro- und gliotoxisch wirkten. Die Partikel können anhand abnehmender Toxizität wie folgt geordnet werden: WC-Co > WC 100na > WC 10n. Auch die Reaktionen der Zellen fielen unterschiedlich aus: die Astrozyten erwiesen sich als die sensitivsten Zellen. Eine Exposition des Gehirns mit WC-Co-NP in hohen Konzentrationen oder über einen längeren Zeitraum könnte also weit reichende Folgen haben, angefangen bei einer gestörten Signalweiterleitung über eine erhöhte Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke bis hin zu neurodegenerativen Veränderungen. Diese und weitere Untersuchungen könnten bei der Erstellung von Arbeitsrichtlinien im Umgang mit Hartmetallen, deren Ausgangsmaterial nanoskalige Pulver sind, hilfreich sein und damit einen Beitrag zum Schutz der Arbeiter liefern.
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Einschätzung der Verwendbarkeit und Aussagekraft von toxikologisch relevanten Endpunkten der TiO2- und BaSO4-NP anhand eines In vitro-Langzeitmodells für in vivo

Prüfling, Patrick 04 January 2023 (has links)
Nanopartikel (NP) werden insbesondere bei Herstellungs- und Verarbeitungsprozessen in nanotechnologischen Betrieben in die Umgebungsluft freigesetzt und vornehmlich via Inhalation in den menschlichen Organismus aufgenommen. Aufgrund ihrer Größe und veränderter physikochemischer Eigenschaften stellen NP ein bisher nicht genügend einschätzbares Gesundheitsrisiko dar. Daher steht die Interaktion aspirierter NP mit dem Lungengewebe im Fokus nanotoxikologischer Untersuchungen. Die Effekte aerogener NP wurden sowohl in vivo mittels Inhalation und Instillation als auch in vitro in Zellkultursystemen eingehend untersucht. Als Hauptmechanismus der toxischen Effekte wird dabei die NP-induzierte Bildung reaktiver Sauerstoffagenzien postuliert. Der resultierende oxidative Stress ist in der Lage, zelluläre Bestandteile wie Membrane, Proteine, DNA und Organellen zu schädigen und infolgedessen Entzündungsprozesse und Zelltod auszulösen. Diesbezüglich erfordern die Fortschritte der Nanotechnologie, die mit einem zunehmenden Umgang des Menschen mit NP einhergehen, eine entsprechende Risikobewertung. Aufgrund von fehlender Standardisierung sowie von Unterschieden in der Dosimetrie und den Messverfahren konnten die Wirkmechanismen der NP bislang nicht vollständig aufgeklärt werden. Zudem stehen die Ergebnisse von Hochdosis-Akutstudien wegen der unrealistischen Belastung in der Kritik. Aus diesem Grund war ein Ziel der vorliegenden Arbeit, eine realitätsnahe Bewertung des Risikopotenzials der PSLT-NP TiO2 und BaSO4 nach Langzeitexposition zu geringen Dosen in vitro zu ermitteln. Als weiteres Ziel soll das dazu etablierte Modell die Aussagekraft von In vitro-Studien erhöhen, um eine einfache und reproduzierbare Prognose von adversen biologischen Effekten in vivo zu erreichen und somit Tierversuche zu reduzieren. Das Modell wurde auf Basis von In vivo-Langzeitstudien mit niedriger Dosis auf höchstem europäischen Standard etabliert und soll die chronische Exposition von Angestellten gegenüber aerogener NP in nanotechnologischen Betrieben nachbilden. Die Exposition erfolgte in einem ein- bis dreimonatigen Untersuchungszeitraum jeweils sechs Stunden täglich über fünf Tage die Woche. Die gemäß standardisiertem Dispersionsprotokoll gelösten NP wurden dabei in humanen Typ II-Alveolarepithelzellen (A549) auf die biologischen Endpunkte Viabilität und Zelltod, ROS-Generierung sowie Beeinträchtigung des mitochondrialen Membranpotenzials untersucht. Ebenfalls wurde ein Einfluss der NP auf die Zellproliferation und den Zellzyklus analysiert. Der Schwerpunkt wurde dabei auf die Beobachtung der subakuten und subchronischen Effekte beider PSLT-NP gelegt. Neben den toxischen Effekten standen insbesondere die noninvasive markierungsfreie Betrachtung und Quantifizierung der zellulären Aufnahme sowie der intrazellulären NP-Verteilung auf Einzelzellebene anhand der konfokalen Raman-Mikroskopie im Mittelpunkt der Arbeit. Denn die daraus ermittelten Informationen stellen mit der relativen Dosis sowie der Beeinträchtigung der Zellorganellen einen essenziellen Faktor für die Risikobewertung dar. Auf Basis der Quantifizierung der NP konnte erstmals eine starke Reduktion des Gehalts an intrazellulären NP in A549-Zellen nach subakuter und subchronischer Exposition festgestellt werden. Insbesondere bei dem Gehalt intrazellulärer BaSO4-NP wurde trotz konstanter Exposition ein starker Rückgang verzeichnet, sodass nach subchronischer Exposition lediglich in der höchsten Konzentration vereinzelte BaSO4-Aggregate detektiert werden konnten. Auf Grundlage dieser Ergebnisse kann eine Aufnahmeresistenz der beiden NP in vitro vermutet werden. Diese stimmt zudem mit dem ermittelten geringen zytotoxischen Potenzial der NP überein. Eine Pixelanalyse zeigt im Vergleich, besonders nach subakuter/subchronischer Exposition, eine mehrfach größere Menge an TiO2-NP als an BaSO4-NP innerhalb der Zellen. Demnach beeinflusst die postulierte Resistenz die Aufnahmefähigkeit von BaSO4-NP mehr als von TiO2-NP. Trotz des festgestellten geringen toxischen Potenzials beider NP auf Lungenepithelzellen nach Langzeitexposition zu realitätsnahen geringen Dosen sind die Auswirkungen der NP-Resistenz in vivo zu klären. Denn neben einem verstärkten Abtransport ohne Lungenschädigung ist weiterhin eine Translokation in extrapulmonale Gewebe mit unbekannten Auswirkungen möglich. Zudem zeigt die Kolokalisation der NP mit intrazellulären Organellen eine Präferenz der TiO2-NP für die Mitochondrien sowie der BaSO4-NP für das endoplasmatische Retikulum. Dabei kolokalisieren beide NP nach subakutem/subchronischem Expositionszeitraum verstärkt mit dem ER. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen eine starke Korrelation mit den Beobachtungen der Langzeitinhalationsstudien in vivo. Denn die präferierte Kolokalisation der TiO2-NP mit den Mitochondrien als Quelle der ROS stimmt mit der Induktion von ROS als Ursache toxischer Effekte in vivo überein. Ebenfalls gehen die in vivo beobachtete rasche initiale Lungenclearance sowie die Translokation von inhalierten BaSO4-NP in das Knochengewebe konform mit der ermittelten Resistenzentwicklung und der präferierten Kolokalisation mit dem ER, da dieses sowie das Knochengewebe stehen Calciumspeicher in Verbindung stehen. Demnach konnte mithilfe des in der vorliegenden Arbeit etablierten Modells und markierungsfreier CRM-Verfahren in vitro eine Prognose von adversen Effekten in vivo erreicht werden. Zusammenfassend zeigen die beiden PSLT-NP TiO2 und BaSO4 nach realistischer Langzeitexposition gegenüber geringen Mengen ein geringes toxisches Potenzial für A549-Zellen. Die erstmals beobachtete Entwicklung einer NP-Resistenz mit daraus folgender geringer effektiver Dosis kann eine Ursache dafür darstellen. Mithilfe des etablierten In vitro-Modells nach EU-Standard sowie der markierungsfreien CRM ist es zudem gelungen, eine einfache und validierte Möglichkeit zur Risikopotenzialeinschätzung zu schaffen und so dazu beizutragen, die Aussagekraft von In vitro-Studien zu erhöhen sowie aufwendige Tierstudien einzusparen.:Inhaltsverzeichnis I Abbildungsverzeichnis IV Abkürzungsverzeichnis VI 1 Einleitung 1 1.1 Nanopartikel und deren Anwendungsbereiche 2 1.2 Berufsbedingte NP-Exposition 4 1.3 Aufnahmewege der Nanomaterialien 6 1.3.1 Die Lunge als Haupteintrittspforte 7 1.3.2 Zelluläre Aufnahmemechanismen 10 1.4 Toxisches Potenzial der NP 12 1.4.1 Oxidativer Stress 12 1.4.2 Einfluss auf die Zellvitalität 14 1.4.3 Auswirkung auf den Zellzyklus 17 1.4.4 Induktion einer Entzündungsreaktion 19 1.5 Biologische Antwort auf TiO2 und BaSO4 als poorly soluble, low toxicity (PSLT) NP in vivo und in vitro 20 1.5.1 TiO2-NP 21 1.5.2 BaSO4-NP 25 2 Zielsetzung der Arbeit 30 3 Materialien und Methoden 32 3.1 Geräte 32 3.2 Materialien 32 3.2.1 Nanopartikel 32 3.2.2 Chemikalien 32 3.2.3 Verbrauchsmaterialien 33 3.3 Software 33 3.4 Methoden 33 3.4.1 Präparation der Nanopartikel 33 3.4.2 Zellbiologische Methoden 34 3.4.3 Biophysikalische Methoden 37 3.4.4 Zytotoxizität-Assays 49 3.4.5 Statistische Auswertung 53 4 Ergebnisse 54 4.1 Charakterisierung der TiO2- und BaSO4-NP 54 4.2 Zytotoxische Effekte der NP auf A549-Zellen 59 4.2.1 Determination von Apoptose und Nekrose 59 4.2.2 Induktion von ROS in NP-exponierten A549-Zellen 61 4.2.3 MMP als Marker der Apoptose 62 4.2.4 Zellzyklus und Zellproliferation unter Einfluss der NP 63 4.3 Aufnahme und Verteilung der NP in alveolaren Epithelzellen 68 4.3.1 Chemisch selektive Bildgebung der A549-Zellen 68 4.3.2 Semiquantifizierung der NP-Aufnahme in A549-Zellen 70 4.3.3 Aggregatsbildung innerhalb der Einzelzelle 80 4.3.4 Intrazelluläre Lokalisation der NP 83 5 Diskussion 89 5.1 Extra- und intrazelluläre NP-Charakterisierung 91 5.2 Evaluation zytotoxischer Auswirkungen von TiO2- und BaSO4-NP unter subchronischen In vitro-Expositionsszenarien 97 5.3 Aufnahme und Verteilung der NP in A549-Zellen 102 5.3.1 Aufnahme der TiO2- und BaSO4-NP 102 5.3.2 Kolokalisation der NP mit den verschiedenen Zellorganellen 108 5.4 Abschätzung des Risikopotenzials 112 6 Zusammenfassung der Arbeit 115 7 Literaturverzeichnis 118 8 Anhang 159 8.1 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 159 8.2 Lebenslauf 160 8.3 Danksagung 161
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Analýza nebezpečnosti nanočástic v pracovním ovzduší a návrh opatření pro ochranu před jejich nežádoucími účinky / Hazard analysis of nanoparticles in the workplace environment and design of protective measures against their side effects

Skřehotová, Marcela January 2012 (has links)
The diploma thesis is focused on so called new risks, which currently include the risks associated with various nanomaterials - their production, introduction into practice and use. The paper summarizes the up-to-date knowledge about the characteristics of nanoparticles used and it proposes a procedure to estimate potential consequences of their exposure. The experimental part of the paper is represented by a case study, which introduces the practical application of the proposed procedure aiming at estimated exposure to nanoparticles on the workplace where metal working is executed and resulting occupational risks. The aim of this part of the study was to measure selected parameters of aerosols using a special measuring system working on the principle of laser photometry combined with diffusion charger and detector using Faraday cage. The object of the measurements was to determine the numerical concentration of nanoparticles present in working environment and the representation of size groups of submicron particles. The measurement procedure was designed in accordance with ČSN EN 689, ČSN EN ISO 16000-1 and ČSN ISO 8756 standards and data gained were subsequently interpreted. Afterwards the results were used to design the measures to reduce the risk of health damage when facing chronic inhalation...

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