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O transtorno do espectro autista (ASD, do inglês, autism spectrum disorder) é uma condição neuropsiquiátrica de início precoce, caracterizado por déficit do uso da comunicação para socialização e padrões de comportamentos restritos e repetitivos. A herdabilidade do ASD tem sido estimada em 50-90%. O ASD pode se apresentar como uma condição sindrômica, considerando, nesses casos, síndromes genéticas, como a distrofia muscular de Duchenne (DMD), e como uma condição não sindrômica. Além disso, o ASD apresenta uma grande heterogeneidade genética e centenas de genes têm sido relatados como candidatos. As variantes com alta patogenicidade para o ASD são mais comumente raras, de novo e levam ao truncamento da proteína. A função da maioria dos genes candidatos para o ASD ainda é desconhecida e pode explorá-la pode trazer grande conhecimento sobre essa condição. O estudo genômico de casos familiais de ASD pode facilitar a identificação de fatores genéticos possivelmente patogênicos para o ASD, uma vez que esses casos podem estar enriquecidos de fatores genéticos e têm sido pouco explorados. Então, uma estratégia para identificar e validar genes candidatos para o ASD é investigar variantes que levam ao truncamento das proteínas nos casos familiais de ASD. Além disso, entender as alterações dos processos moleculares e celulares desregulados pelos genes candidatos para o ASD pode nos ajudar a compreender melhor a relevância desses genes na manutenção da homeostasia do sistema nervoso central e, também, como esses genes podem causar o fenótipo do ASD. Dessa forma, primeiramente, nós investigamos variantes exômicas raras de perda de função (rLoF, do inglês, rare loss-of-function) (MAF<0,01) potencialmente patogênicas compartilhadas e não compartilhadas por indivíduos aparentados afetados pelo ASD em 13 famílias não relacionadas. Ademais, analisamos se outras variantes rLoF poderiam contribuir para o ASD em dois irmãos que também são afetados por DMD. A partir disso, identificamos 56 variantes rLoF em 54 genes, as quais foram compartilhadas (12 variantes em 11 genes) e não compartilhadas (44 variantes em 43 genes) entre os indivíduos afetados das famílias. Desse total de 54 genes, foi possível destacar 16 genes como principais causas do ASD, nos quais as mutações observadas foram tanto herdadas quanto de novo. Nos indivíduos com ASD/DMD, detectamos uma deleção no gene da distrofina, a qual explica o fenótipo de DMD, e outras duas variantes possivelmente patogênicas no DPYSL4 e no OPALIN que podem contribuir para o ASD. Em uma das famílias estudadas, identificamos mutações bialélicas de perda de função no TBCK, assim estudamos as células neuronais derivadas de iPSC de um indivíduo com rompimento do TBCK. A compreensão da função desse gene pode auxiliar no entendimento das vias de sinalização e assim na busca de tratamentos para os fenótipos neurológicos. No presente estudos, mostramos que a depleção do TBCK nas células neuronais causa alterações no ciclo e proliferação celular, além de desregulação da via mTOR. O tratamento com a L-leucina, um aminoácido que sinaliza na via mTOR, das células neuronais com diminuição de TBCK resgatou a sinalização da via mTOR, bem como, aumentou a proliferação celular. Assim, os nossos resultados sugerem que a L-leucina pode resgatar os fenótipos causados pela redução da expressão do TBCK, os quais abrem novas perspectivas de tratamento de crianças com mutações nesse gene. Somado a isso, nós exploramos o uso da Drosophila melanogaster para realizar estudos funcionais para outros genes candidatos para o ASD. Nós analisamos a morfologia neuronal nas larvas dessa mosca com expressão reduzida do trp&gamma;, mahjong, dys e crmp, os quais são, respectivamente, os ortólogos dos genes humanos candidatos para o ASD: TRPC6, VPRBP, DMD e DPYSL4 (CRMP3). Nas linhagens com diminuição da expressão do trp?, mahjong, dys e crmp, nós observamos várias alterações morfológicas, tais como, defasciculação axonal e anormalidade no formato do ângulo nos neuritos ipsilaterais-contralaterais. Assim sendo, este trabalho evidenciou a heterogeneidade genética do ASD em famílias brasileiras, permitiu a validação e identificação de genes candidatos adicionais para o ASD, contribuiu para a melhor compreensão do papel de alguns genes, em particular, o TBCK, e para o estabelecimento do uso da D. melanogaster para estudar os genes candidatos para o ASD no nosso laboratório / Autism Spectrum Disorder (ASD) is a neuropsychiatric condition of early onset, characterized by deficit in social communication and repetitive and restrict behavior. Its heritability has been estimated between 50-90%. The ASD cases can be related to both syndromic conditions, considering, in these cases, genetic syndromes like Duchenne muscular dystrophy (DMD), and non-syndromic conditions. Moreover, this disorder presents high genetic heterogeneity, and several hundreds of genes have reported as candidates. Variants associated with high pathogenicity in ASD are most usually rare, de novo and lead to protein truncation. The role of most of the ASD candidate genes is still under unclear and explore it could bring important knowledge about this condition. The genomic study of familial cases of ASD could aid the identification of likely pathogenic genetic factors, as it might be enriched by genetic factors and have not been largely explored. Therefore, a potential approach to validate and identify additional ASD candidate variants would be to investigate if truncating variants would explain the ASD phenotype in familial cases. Besides, understanding the molecular and cellular process altered by ASD candidate genes could clarify the relevance of these genes on keeping central nervous system homeostasis as well as how the deficiency of these genes would cause the ASD phenotype. Thus, firstly, we investigated rare loss-of function (rLoF) variants (MAF<0.01) shared and unshared among ASD related individuals from 13 unrelated families with the aim of identifying those that contribute to the phenotype. Also, we tested if additional rLoF variants would contribute to the ASD phenotype in DMD brothers. We identified 56 rLoF varaints in 54 genes, which were shared (12 variants in 11 genes) and unshared (44 variants in 43 genes) among affected individuals within a family. We pinpointed 16 genes out of 54 as major cause of ASD, which included both inherited and de novo mutations. In ASD/DMD individuals, we detected a deletion in dystrophin gene, which explains the DMD phenotype, and other two likely pathogenic variants in DPYSL4 and OPALIN that can contribute to ASD. In one of the families, we identified biallelic loss-of-function mutations in TBCK. Thus, we studied the phenotypes of iPSC-derived neuronal cells of an individual with disruption of the TBCK. The comprehension of the gene function can lead us to look for treatments for the neurological phenotypes. In the present study, we show that the depletion of TBCK in neuronal cells cause cell cycle and proliferation abnormalities and mTOR dysregulation. The treatment of TBCK-depleted neuronal cells with L-leucine improved mTOR signaling, as well as increased cell proliferation. Thus, our results suggest that L-leucine could rescue the neuronal phenotypes caused by reduced expression of TBCK, which can open new perspectives on the treatment of children with mutations in this gene. Additionaly, we explored the use of Drosophila melanogaster to conduct functional studies of ASD candidate genes. We analyzed neuronal morphology in flies\' larvae with reduced expression of trp?, mahjong, dys and crmp, which are, respectively, the orthologs of the ASD candidate human genes TRPC6, VPRBP, DMD and DPYSL4 (CRMP3). In lines with reduced expression of trp&gamma;, mahjong, dys and crmp, we observed several morphological alterations, like axonal defasciculation and aberrant form of ipsilateral-contralateral neurite angles. Hence, our results demonstrate the genetic heterogeneity of ASD in Brazilian families, allowed the validation and identification of additional gene targets for ASD and contributed to a better understanding of the role of some ASD genes, most particularly TBCK. Finally, we had set up the use of D. melanogaster to explore ASD candidate genes in our laboratory

La carence en vitamine B12 est fréquente chez les sujets âgés et produit un vieillissement cérébral par des mécanismes malconnus. La vitamine B12 joue un rôle majeur dans les régulations épigénomiques dépendantes de la S-adénosyl méthionine (SAM). Nous avons établi un modèle de cellules neuronales dopaminergiques NIE115 carencé en vitamine B12 par l'expression stable d'une protéine chimère : la transcobalamine-oléosine (TO) réduisant la disponibilité cellulaire en B12, la SAM et la prolifération cellulaire. La protéine chimère oléosine-transcobalamine (OT) ne lie pas la B12 et constitue un contrôle. Les cellules TO ont une diminution B12-dépendante de la déacétylase SIRT1 (sirtuin1) et un stress du réticulum endoplasmique (RE) avec une augmentation des transducteurs transmembranaires, une diminution des protéines chaperonnes et une augmentation des marqueurs pro-apoptotiques. La diminution de l'expression de SIRT1 déclenche le stress du RE en réponse au stress nutritionnel. Cette diminution produit une augmentation de HSF1 acétylé diminuant l'expression des protéines chaperons. L'ajout de B12, des activateurs de SIRT1 et HSF1, la surexpression de SIRT1 et HSF1 réduisent le stress du RE. Dans les cellules contrôles, le traitement par la thapsigargin, l'inhibition de SIRT1 et HSF1 induisent également un stress du RE réversible en présence de B12. Le traitement des cellules OT par Adox (inhibiteur des méthyltransférases) induit les mêmes effets que la carence. En conclusion, la carence en B12 induit un stress du RE via la diminution de SIRT1 et l'augmentation de HSF1 acétylé, l'ajout de B12 induit des effets neuro-protecteurs sur les cellules soumises à un stress du RE. Ces résultats suggèrent d'évaluer les effets des agonistes de SIRT1 sur les complications cérébrales de la carence / Vitamin B12 deficiency is common in elderly population and produces neurodegenerative disorders by elusive mechanisms. B12 is a key determinant for the S-adenosyl methionine-dependent epigenomic regulations. We have established a B12-deficient cell model via the stable expression of transcobalamin-oleosin chimera (TO), which impairs cellular availability of vitamin B12, reduces SAM level and cell proliferation. Since the expression of oleosin transcobalamin chimera (OT) does not modify the phenotype of the transfected cells, these cells serve as control cells. TO cells present a B12-dependant decrease of deacetylase SIRT1 (sirtuin1) and an endoplasmic reticulum stress (ER stress) reflected by the increased expression of ER stress tranducers, decreased chaperon proteins and increased pro-apoptotic markers. We propose that the decreased expression of SIRT1 triggers cell response to nutritional stress through ER stress. This decrease results in a greater acetylation of heat-shock factor protein 1 (HSF1) and thus reducing the expression of heat shock proteins (HSP). Adding B12, SIRT1, or HSF1 activators as well as overexpressing SIRT1 or HSF1 reduce ER stress. In OT cells, thapsigargin treatment or impairing SIRT1 and HSF1 leads to B12-reversible ER stress. Treating OT cells with AdoX, an inhibitor of methyltransferase activities, produces effects similar to those observed in cells with decreased B12 availability.In summary, the impaired cellular availability of vitamin B12 induces ER stress by increasing HSF1 acetylation through a decreased SIRT1 expression and adding vitamin B12 produces neuro-protective effects in cells subjected to prior ER stress. These results suggest evaluating the effects of SIRT1 agonists on cerebral complications due to a B12 deficiency

Hintergrund Das Aicardi-Goutières Syndrom (AGS) ist eine genetisch bedingte Enzephalopathie, die durch Mutationen in neun verschiedenen Genen verursacht wird und zu einer Neurodegenration mit globaler Entwicklungsverzögerung führt. Die Mutationen führen zu einer Fehlregulation des Metabolismus und der immunologischen Erkennung intrazellulärer Nukleinsäuren sowie einer konstitutiven Aktivierung von Typ 1-Interferon (IFN). Bei AGS-Patienten sind Kalzifizierungen der Basalganglia sowie Demyelinisierungen der weißen Substanz charakteristisch. Fragestellung: Biallele Mutationen in den Genen, TREX1 und SAMHD1, sind Ursache des AGS Typ 1 und AGS Typ 5. Die DNA-Exonuklease TREX1 degradiert intrazelluläre Nukleinsäure-Metabolite, die während zellulärer Prozesse gebildet werden. Die Triphosphohydrolase SAMHD1 spielt vorrangig in der Regulation des intrazellulären dNTP-Pools und des RNA-Metabolismus eine wichtige Rolle. Die Möglichkeit induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) zu generieren und damit aus somatischen Zellen embryonale Stammzellen nachzubilden, um diese in unterschiedliche Zelltypen zu differenzieren, ermöglicht es, Zelltypen von schwer zugänglichen Geweben wie das Gehirn zu erforschen. Die vorliegende Arbeit untersucht die Auswirkungen einer TREX1- und SAMHD1-Defizienz in neuronalen Zellen. Dazu wurden reprogrammierte neuronale Modelle für das AGS Typ 1 und AGS Typ 5 etabliert. Ziel war hierbei die Aufdeckung bisher unbekannter molekularer Mechanismen, die zur Entstehung einer Typ 1-IFN-induzierten Inflammation und Neurodegeneration bei Patienten mit AGS führt. Material und Methoden: Als Ausgangspunkt dieser Arbeit dienten primäre Fibroblasten und PBMCs, die aus Hautbiopsien bzw. Blutproben von AGS-Patienten mit Mutationen in den Genen, TREX1 und SAMHD1, gewonnen wurden. Durch eine Reprogrammierung dieser patientenspezifischen Zellen wurden pluripotente Stammzellen induziert und anschließend über die Bildung von Embryonalkörperchen und neuronale Vorläuferzellen in neuronale Zellen differenziert. Um die etablierten neuronalen Zelllinien funktionell zu charakterisieren, wurden isogene Zelllinien etabliert. Hierbei wurde mittels Genomeditierung der patientenspezifischen iPS-Zellen die krankheitsassoziierte Mutation behoben und auf diese Weise isogene Zelllinien mit identischem genetischen Hintergrund generiert, die sich lediglich durch die Anwesenheit oder das Fehlen der krankheitsrelevanten Mutation unterscheiden. Unter Nutzung verschiedener molekularbiologischer Methoden wurden die patientenspezifischen neuronalen Zellen näher untersucht. Um die in Patienten-Fibroblasten nachgewiesene erhöhten Typ 1-IFN-Aktivität auch im neuronalen Zellmodell zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit AGS-patientenspezifische neuronale Zellen und deren Vorläufer auf eine Erhöhung der IFN-Signatur überprüft. Um die etablierten neuronalen Zellmodelle eines AGS auf zellulären Stress in Form von ROS zu untersuchen, wurden patientenspezifische NPCs im Vergleich zu WT-Linien mittels DHR-Assay analysiert. Weiterhin wurde aus neuronalen Zellen mit AGS-spezifischen Mutationen mittels einer speziellen Kultivierungsmethode zur in vitro Separation von Axonen und Dendriten in proximale und distale Bereiche und einem nachfolgenden Tracking von Lysosomen und Mitochondrien per Live cell imaging die subzelluläre Verteilung dieser Organellen untersucht. Mittels immunhistochemischer Färbungen wurden zudem aus iPSC bzw. NPCs gewonnene neuronale Zellen mit AGS-spezifischen Mutationen die zelluläre Expression von Proteinen, die eine Rolle bei neurodegenerativen Krankheiten spielen, untersucht. Ergebnisse Die Nutzung der iPSC-Technologie eröffnet besonders für neurodegenerative Krankheiten die Möglichkeit, geeignete zelluläre Krankheitsmodelle zu schaffen. So existieren bereits eine Reihe iPSC-basierter Studien für Alzheimer, Parkinson, Chorea Huntington oder amyotropher Lateralsklerose. Mit der vorliegenden Arbeit wurden iPSC-basierte Modelle für das AGS entwickelt. Als Grundstein dieser Arbeit konnten aus somatischen Zellen von AGS-Patienten pluripotente Stammzellen erzeugt und als iPSCLinien etabliert werden. Die funktionelle Charakterisierung der patientenspezifischen Zellen erfolgte durch die Etablierung isogener Kontrollen mit identischem genetischen Hintergrund, um phänotypische Unterschiede direkt auf die krankheitsspezifischen Mutationen zurückzuführen. Die vorhandenen SAMHD1- und TREX1-Mutationen in den iPS-Zellen der Patienten wurden zunächst mittels Genomeditierung korrigiert. Anschließend wurden iPSC-Linien etabliert. Die patientenspezifischen iPS-Zellen sowie die isogenen Kontrollen wurden über neuronale Vorläuferzellen zu Neuronen differenziert, validiert und funktionell untersucht. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass die etablierten Zellmodelle teilweise den Phänotyp eines AGS rekapitulieren. So entsprach die im AGS-Modell neuronaler Vorläuferzellen untersuchte Expression von IFN-stimulierten Genen (ISGs) weitgehend dem typischen Bild einer Interferonopathie und konnte durch den Vergleich mit isogenen Zelllinien auf die TREX1-Mutation der neuronalen Vorläuferzellen zurückgeführt werden. Eine Variabilität der ISG-Expression in ausdifferenzierten neuronalen Zellen könnte verschiedene Ursachen haben. Die Untersuchungen auf zellulären Stress in Form von ROS konnten zeigen, dass sowohl in TREX1- als auch SAMHD1-defizienten neuronalen Vorläuferzellen ein erhöhtes zelluläres Level an ROS vorliegt. Möglicherweise ist dies mit dem festgestellten langsamen Zellwachstum der patientenspezifischen Vorläuferzellen assoziiert. Weiterhin konnte mittels Live cell imaging ein verringertes Mobilitätsverhalten von Lysosomen und Mitochondrien in patienten- spezifischen neuronalen Zellen festgestellt werden, was die Vermutung nahelegt, dass die untersuchten AGS-verursachenden Mutationen in TREX1 und SAMHD1 ursächlich an der Neurodegeneration bei AGS-Patienten beteiligt sind. Ausblick: Die in dieser Arbeit erfolgreich etablierten reprogrammierten neuronalen AGS-Modelle können zukünftig dazu dienen, pathogenetische Prozesse im Gehirn zu untersuchen. Es konnten Grundlagen zur Aufklärung bisher unbekannter molekularer Mechanismen der Neurodegeneration bei AGS-Patienten geschaffen werden. Weiterführend kann das etablierte Modell zur Untersuchung weiterer Aspekte wie der Messung von transkriptomweiten Expressionsprofilen verwendet werden und somit neue Einblicke in die zellintrinsische Aktivierung der Typ 1-IFN-Achse von AGS-Patienten liefen. Um die Rolle von neuronal vorkommenden Proteinen oder Vesikeln bei neuronalen Erkrankungen, insbesondere bei AGS,zu untersuchen, stellt das patientenspezifische AGS-Modell eine wichtige Grundlage dar. Die hier aufgeführten immunhistochemischen Untersuchungen neuronaler Proteine können vertieft und in einem größeren Umfang ausgewertet werden. Die vorteilhaften Eigenschaften der iPSC-basierten neurodegenerativen Modelle ermöglichen neben grundlagenwissenschaftlichen Untersuchungen zur Krankheitsursache auch die Bearbeitung von Fragestellungen zur Behandlung von AGS-Patienten.

Les chitooligosaccharides (COS) présentent des propriétés biologiques intéressantes telles que l'activité antimicrobienne, antifongique et antitumorale. Dans ce travail, nous avons utilisé les COS pour des applications très diverses, telles que l'ingénierie des cellules neuronales (blocage de la formation du réseau périneuronal), la complexation des cations Fe2+ et Fe3+ pour la synthèse de particules supermagnatiques et enfin pour le développement de conjugués fonctionnels à base de COS. Dans le cadre de ces études en partenariat, nous avons travaillé sur l'élaboration de chitooligosaccharides à structure contrôlée afin d’étudier leurs propriétés physico-chimiques ou biologiques. Des modifications de chitooligosaccharides ont été effectuées dans ce travail de deux façons: la modification par N-substitution et la modification par le groupe aldéhyde du résidu 2,5-anhydro-D-mannofuranose (amf) à l'extrémité réductrice des chitooligosaccharides. Les premiers types de COS consistent en la désamination suivie d'une réaction de N-réacétylation afin de contrôler (partiellement) à la fois le degré moyen d'acétylation et le degré moyen de polymérisation. La seconde stratégie consiste en la synthèse de nouveaux COS fonctionnalisés à leur extrémité réductrice par amination réductrice et oximation avec différents groupes chimiques cliquables (c'est-à-dire alcyne, alcène, azide, thiol et hydrazide). En fonction des COS fonctionnalisé ciblé, différentes techniques d'analyse ont été réalisées pour analyser pleinement leurs caractéristiques structurales telles que la spectroscopie RMN, la spectrométrie de masse MALDI-TOF, la chromatographie HPLC, la spectroscopie RAMAN et la chromatographie SEC. Des structures chimiques spécifiques de chitooligosaccharides modifiés ont été étudiées dans le but de les utiliser pour moduler le réseau périneural de neurones et l'établissement de connexions synaptiques. Nous avons également montré que les COS solubles permettent la précipitation des nanoparticules supramagnétiques de Fe3O4 avec un revêtement COS en les rendant moins toxiques. Enfin, les COS fonctionnalisés à leur extrémité réductrice pourraient être des intermédiaires utiles pour le développement de nouveaux conjugués fonctionnels à base de chitosane / Chitooligosaccharides (COS) classically present several biological properties such as anti-microbial, anti-tumor and anti-fungal activity. In this work, we used COS for widely different applications, such as tissue engeneering of neuronal cells (blocking of perineuronal net formation), the complexation of iron cations (Fe2+ and Fe3+) for the synthesis of supermagnatic particle and finally for the development of advanced functional COS-based conjugates. In this partnership studies, we worked on the elaboration of controlled structure chitooligosaccharides in order to decipher their physico-chemical or biological properties. Further modification of chitooligosaccharides was performed in this thesis in two ways: modification via amine N-substitution and the modification via the 2,5-anhydro-D-mannofuranose (amf) aldehyde group located at the reducing end of chitooligosaccharides. The first COS types consist in the nitrous depolymerization followed by N-acetylation in order to (partly) control both the mean degree of N-acetylation and the degree of polymerization. The second consist in the synthesis of new COS-based building blocks functionalized at their reducing end by reductive amination and oximation with different clickable chemical groups (i.e. alkyne, alkene, azide, thiol, and hydrazide). Depending on the targeted functionalized COS, different analysis techniques were carried out to fully characterize such as NMR spectroscopy, MALDI-TOF mass spectrometry, HPLC-chromotography, RAMAN spectroscopy and SEC chromatography. Specific chitooligosaccharides were studied in the objective to use them to modulate the perineuronal net of neurons, and the establishment of synaptic connections. We also showed that water soluble COS permit the precipitation of supramagnetic Fe3O4 nanoparticles with a COS coating and succeded in decreasing their toxicity. Finally we have shown that COS-based building blocks could be useful intermediates for the development of advanced functional COS-based conjugates such as COS-b-PEG diblock copolymers