Eine häufige Komplikation diverser Malignome ist die Hirnmetastasierung. Im Verlauf einer Krebserkrankung kommt es bei mehr als einem Drittel aller Patienten mit einem soliden Tumor zur Absiedelung von Tochterzellen ins Gehirn. Therapeutisch einzuleitenden Maßnahmen hängen maßgeblich davon ab, wie zahlreich und wie groß die vorhandenen Hirnmetastasen sind. Zumeist wird so zwischen eine lokalen Therapie oder Ganzhirnbestrahlung entschieden. Nichtsdestotrotz bleibt die Prognose oft mit einer medianen Überlebenszeit von maximal 12 Montane sehr schlecht. Faktoren, die die Anzahl und Größe von Hirnmetastasen beeinflussen, sind bis heute nur wenig definiert. Die Metastasierung eines Primärtumors in das zentrale Nervensystem (ZNS) scheint von hämatogener Tumorzellaussaat und einer Affinität zum ZNS abhängig zu sein. Eine gesicherte Blutversorgung ist unerlässlich für das Wachstum von Metastasen im ZNS. Ob Neoangiogenese oder die Anpassung an vorhandene Gefäße durch Patienten-abhängige Faktoren beeinflusst werden, ist nicht detailliert untersucht. Ziel dieser Studie war die retrospektive Beurteilung des Einflusses von Alter und zerebraler Mikroangiopathie auf die Anzahl und Große von Hirnmetastasen diverser Tumortypen. Initial wurden alle Patienten, bei denen von Oktober 2004 bis Januar 2016 am Universitätsklinikum Leipzig die Diagnose „Hirnmetastase oder Hirnmetastasierung“ gestellt wurde, gesammelt. Basierend auf zwei Hauptkriterien wurden diese anschließend selektiert. Voraussetzungen für die Aufnahme in diese Studie waren eine vollständige Krankenakte mit allen biologischen Daten, als auch ein 3D-T1 gewichtete MRT-Aufnahme vor und nach Kontrastmittelgabe, und eine T2/FLAIR Aufnahme vor begonnener Behandlung. Ein 3-Tesla MRT wurde hierzu verwendet; die Schichtdicke betrug 1 bis 1.5 mm. Die MRT-Aufnahmen wurden hinsichtlich der Anzahl und Größe der Hirnmetastasen, sowie des Grades der Läsionen der weißen Hirnsubstanz (White Matter Lesions, WML) analysiert. Die Patienten wurden anschließend basierend auf Altersgruppen- und WML-Grad Zugehörigkeit univariat und multivariat betrachtet. Zur Untersuchung des Alters, im Rahmen des WML Grades, erfolgten zwei Untergruppierung: 1) Patienten  65 vs. Patienten >65 Jahre; 2) Einteilung nach Dekaden, beginnend bei 30 und endend bei 100 Jahren. Der Grad der Läsionen der weißen Hirnsubstanz – als Marker der zerebralen Mikroangiopahie – wurde basierend auf der vierstufigen Fazekas-Skala (0-3) (Fazekas et al. 1987) ermittelt. Patienten ohne hyperintense Läsionen der weißen Substanz wurden dem WML Grad 0, mit punktförmigen Läsionen dem Grad 1, mit beginnend konfluierenden punktförmigen Läsionen dem WML Grad 2 und großen konfluierenden Läsionen dem WML Grad 3 zugeordnet. Innerhalb dieser Untergruppen wurden durchschnittliche Metastasenzahl und der mittlere Durchmesser der Raumforderungen berechnet. Zur statistischen Analyse wurde die Software SPSS V22.0 von IBM eingesetzt. Zu Beginn wurden alle Daten mittels Kolmogorov-Smirnov Test auf Normalverteilung überprüft. Da die gemessenen Daten höchst signifikant (p=0.001) keiner Normalverteilung folgten, wurden alle weiteren Analysen mittels nicht-parametrischer statistischer Tests (Mann-Whitney U-Test bei N=2, Independent Samples Kruskal-Wallis-Test bei N>2) durchgeführt. Univariate und multivariate Analysen wurden zur Beurteilung individueller und kumulativer Effekte verwendet. Die statistische Signifikanz wurde bei einem p-Wert < 0.05 akzeptiert. Diese wurde mit zusätzlichen Korrelationsanalysen verschiedener Parameter mittels Pearson’s Chi-Square Test of Independence (pχ2) ergänzt. Die Patienten dieser Studie waren überwiegend männlich (60.5 %, n=121) und - in einem Bereich von 32 bis 91 Jahren - im Median 64,5 Jahre alt. Die Kohorte bestand aus Patienten mit nicht-kleinzelligem Bronchialkarzinom (NSCLC, n=89), kleinzelligem Bronchialkarzinom (SCLC, n=14), Mammakarzinom (BC, n=20), malignen Melanom (MM, n=30), Nierenzellkarzinom (RCC, n=17), kolorektalen Karzinom (CRC, n=10) und anderen Tumorarten (OT, n=20). Ein Anteil von 31 der 200 Patienten (15.5 %) hatte eine Hirnmetastase, 42 Patienten (21 %) zeigten zwei und 91 (45.5 %) 3–9 Metastasen. 36 Patienten hatten über 9 Metastasen. Die Analyse des cMRT ergab, dass insgesamt 88 Patienten (44%) keine WML zeigten, wohingegen 74 (37%) dem WML Grad 1, 37 (18.5%) Grad 2 und nur 1 Fall (0.5%) Grad 3 zugeordnet werden konnte. Die Veränderungen der weißen Substanz waren wesentlich häufiger und gravierender in Patienten mit NSCLC, RCC und CRC (Median: WML1) anzutreffen, als im Vergleich zu Patienten mit MM, BC oder SCLC (WML0). Die durchschnittliche Anzahl (pNoM=0.832) und der mittlere Durchmesser (pmDM=0.662) der Hirnmetastasen waren nicht signifikant verschieden zwischen Patienten 65 und >65 Jahren oder bei einer Einteilung nach Dekaden. In monovariater Analyse zeigten Patienten mit einem WML Grad 1 (NoM: 5.595.68; p=0.009) und Grad 2 (NoM: 3.683.81; p = 0.002) signifikant weniger Hirnmetastasen als Patienten ohne WML (NoM: 6.996.04; pNoM= 0.013). Mit zunehmendem Alter war der WML-Grad signifikant höher (p=0.001, r=0.422). Innerhalb der Patienten mit NSCLC (p=0.048) und bei Patienten mit anderen Tumorarten (SCLC, MM, BC, RCC, CRC, OT, n=111, p=0.05) war mit zunehmendem WML-Grad die Anzahl von Hirnmetastasen signifikant geringer. Im Gegensatz zur Anzahl, war der Durchmesser der Hirnmetastasen zwischen WML-Graden nicht unterschiedlich (p=0.0806). Weiterhin konnte kein Zusammenhang zwischen WML-Grad und Metastasierung in die weiße Hirnsubstanz festgestellt werden. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass sich ein hoher Grad an WML bei verschiedenen Tumorarten reduzierend auf die Anzahl von Hirnmetastasen auswirkt, während das Patientenalter keinen Einfluss hat. Veränderungen der Hirngefäße im Rahmen zerebraler Mikroangiopathie, können somit die Absiedelung von Tumorzellen in das zentrale Nervensystem erschweren. Dieser Sachverhalt könnte auch für die Therapie von Hirnmetastasen mit Ganzhirnbestrahlung relevant sein. So hat die Ganzhirnbestrahlung von Hirnmetastasen neben einem lokaltherapeutischen Effekt auf die sichtbaren Hirnmetastasen auch einen prophylaktischen Einfluss auf makroskopisch nicht-befallene Hirnbereiche. Dieser prophylaktische Effekt ist nach unseren Daten bei Patienten mit Mikroangiopathie mutmaßlich weniger relevant, was eher für die Anwendung lokaler Therapien (stereotaktische Bestrahlung, Resektion) statt Ganzhirnbestrahlung bei diesen Patienten spricht.:INHALTSVERZEICHNIS VORWORT 4 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 7 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 9 TABELLENVERZEICHNIS 9 1 EINFÜHRUNG 10 1.1 Anatomie der Blutversorgung des Gehirns 10 1.1.1 Arterielle zerebrale Gefäßversorgung 10 1.1.1.1 Karotisstromgebiet (KSG) 10 1.1.1.2 Vertebrobasilläres Stromgebiet (VBS) 12 1.1.2 Venöse zerebrale Gefäßversorgung 12 1.1.3 Kleinkalibrige Gefäßversorgung des Gehirns 13 1.2 Die zerebrale Mikroangiopathie 14 1.2.1 Definition 14 1.2.2 Inzidenz, Pathologie und Pathogenese 15 1.2.3 Zusammenfassende Epikrise zerebraler Mikroangiopathie 20 1.2.4 Hirnschäden durch Mikroangiopathien 22 1.3 Zerebrale Mikroangiopathie in der Magnetresozanztomographie 24 1.4 Zerebrale Metastasierung 30 1.5 Zielsetzung und Rationale der Untersuchung 33 2 VORBEMERKUNG ZU VERÖFFENTLICHUNG 35 3 PUBLIKATION 37 4 ZUSAMMENFASSUNG 44 5 LITERATURVERZEICHNIS 48 6 ANLAGEN 68 DARSTELLUNG DES EIGENEN BEITRAGS 68 SELBSTÄNDIGKEITSERKLÄRUNG 69 CURRICULUM VITAE 70 PUBLIKATIONSLISTE DES PROMOVENDEN 73 DANKSAGUNG 75

Glioblastome machen etwa 47% aller intrinsischen Tumore des zentralen Nervensystems aus. Sie sind durch ein aggressives und invasives Wachstumsverhalten gekennzeichnet. Als erster wegweisender Schritt zur Therapie der Glioblastome gilt die frühe und möglichst vollständige Resektion, gefolgt von einer simultanen Radiochemotherapie. Dennoch sind Tumorrezidive binnen weniger Monate die Regel und es bestehen trotz intensiver Forschung bis heute kaum alternative Behandlungsoptionen. Das Verständnis für die Pathogenese der Glioblastome erfuhr in den letzten Jahren tiefgreifende Änderungen. Nach Berücksichtigung der molekularen Marker in der WHO- Klassifikation, wurden Glioblastome in zwei molekulare Gruppen unterteilt: die IDH-Wildtyp (95% der Fälle) und die IDH-mutierten Glioblastome. IDH-Wildtyp Glioblastome treten bei Patienten mit einem medianen Alter von 64 Jahren auf und gehen mit einer ungünstigen Prognose (medianes Überleben 14,2 Monate) einher. IDH-mutierte Glioblastome kommen vor allem bei jüngeren Patienten mit einem medianen Alter von 45 Jahren vor und weisen eine vergleichsweise bessere Prognose mit einem medianen Überleben von 4-5 Jahren auf. Bei IDH-Wildtyp Glioblastomen wurden am häufigsten TERTp-, und PTEN-Mutationen sowie EGFR-Amplifikationen beschrieben. Dabei stellt die TERTp-Mutation die häufigste somatische Alteration im Genom der IDH-Wildtyp Glioblastome dar. Die oben genannten molekularen Marker bieten eine solide Grundlage für die molekulare Diagnose der IDH- Wildtyp Glioblastome. Dennoch bleibt die Frage unbeantwortet, warum IDH-Wildtyp Glioblastome vor allem bei älteren Patienten auftreten und jüngere Patienten eine bessere Prognose besitzen. Unter der Annahme, dass IDH-Wildtyp Glioblastome ein altersspezifisches molekulargenetisches Profil aufweisen, welches wohlmöglich die Prognose beeinflusst, wurden daher die Tumor- und korrespondierenden Blutproben von 55 Patienten mittels Whole Exome Sequencing untersucht. Nach Filterung der Rohdaten wurden verschiedene Mutationen und Copy Number Variations identifiziert. Zur Validierung der Methode wurde zum einen ein Literaturabgleich der detektierten Alterationen durchgeführt und zum anderen einzelne Kandidatengene mittels Sanger Sequenzierung manuell bestätigt. Insgesamt wurden 1841 Mutationen auf 1544 verschiedenen Genen detektiert. Obwohl viele der 1544 Mutationen ohne Relevanz für die Pathogenese waren, konnte eine enorme Vielzahl an verschiedenen Treibermutationen nachgewiesen werden. Die manuell sequenzierte TERTp-Mutation war mit 76,4% am häufigsten aufgetreten. Weitere Treibermutationen, beispielsweise EGFR, TP53, PTEN, PI3K-Gruppe, NF1 und PDGFRA zeigten mit der Literatur vergleichbare Prävalenzen und betonten die Validität der Methode. Die aufgetretenen Copy Number Variations belegten sowohl auf chromosomaler (Chromosom 7-Amplifikation und Chromosom 10-Deletion), als auch auf genspezifischer Ebene (EGFR-, CDK6-, MET-, PDGFRA-Amplifikation und CDKN2A/B-, und PTEN-Deletion) die molekulargenetischen Charakteristika des IDH-Wildtyp Glioblastoms. Über eine Clusterung dieser Alterationen und Gegenüberstellung mit klinischen Eigenschaften konnten die typischen, publizierten Glioblastomsignaturen (proneural, klassisch, mesenchymal) beschrieben und mit dem Erkrankungsalter in Verbindung gebracht werden. Besonders eindrücklich zeigten unsere Daten, übereinstimmend mit der Literatur, dass eine proneurale Signatur mit einem jungen Erkrankungsalter und günstiger Prognose assoziiert war. Unerwartet zeigte ein Patient mit pädiatrischer Signatur und hohem Erkrankungsalter dennoch ein überdurchschnittlich vorteilhaftes Überleben, verglichen mit seiner Altersgruppe. Unabhängig von molekulargenetischen Alterationen, war ein junges Erkrankungsalter alleinstehend mit einer günstigeren Prognose verknüpft. Für einzelne molekulargenetische Alterationen konnte kein Zusammenhang mit dem Erkrankungsalter oder dem (Progressionsfreien-) Überleben hergestellt werden. Ein alterspezifisches, prognosebeeinflussendes Mutationsmuster konnte demnach nicht identifiziert werden. Limitierend muss dabei die geringe Kohortengröße (n=55) angemerkt werden. Eine Vergrößerung der Studienpopulation war aufgrund der geringen Inzidenz von jungen Patienten mit IDH-Wildtyp Glioblastomen in diesem Studiendesign nicht möglich und könnte perspektivisch in einem multizentrischen Ansatz oder einer langen Akquirierungsphase verwirklicht werden. Die Fülle an identifizierten Treibermutationen verdeutlichte nichtsdestotrotz die große intratumorale Heterogenität des Glioblastoms. Zusätzlich ermöglichte die enorme diagnostische Tiefe der verwendeten Methode die Identifikation der bisher nicht im Zusammenhang mit dem IDH-Wildtyp Glioblastom beschriebenen TET1-Deletion. Obwohl die detaillierte Rolle der TET1-Deletion für das Glioblastom nicht verstanden ist, liefern unsere Daten einen vielversprechenden Hinweis, dass ein Funktionsverlust des TET1-Enzyms, in Kombination mit EGFR-Amplifikation oder Deletion von PTEN oder CDKN2A/B, eine Auswirkung auf die Pathogenese des IDH-Wildtyp Glioblastoms besitzt und die Prognose negativ beeinflusst. Zukünftige molekulargenetische Sequenzierungen sind indiziert, um die Rolle der TET1- Deletion zu bestätigen und darüber hinaus die Pathogenese des Glioblastoms auf molekulargenetischer Ebene noch besser zu verstehen und weitere individualisierte Therapieansätze abzuleiten.:Abkürzungsverzeichnis 5 1 Einleitung 8 1.1 Klinische Grundlagen des Glioblastoms 8 1.1.1 Epidemiologie/Ätiologie 8 1.1.2 Symptomatik und Diagnostik 9 1.1.3 Therapie 10 1.1.4 Prognose 12 1.2 Pathologie und Molekulargenetische Veränderungen des Glioblastoms 12 1.2.1 Treibergene 13 1.2.2 Subgruppen 17 1.3 Fragestellung 18 2 Materialien 19 3 Methoden 23 3.1 Patientenrekrutierung 23 3.1.1 Erweiterte Einschlusskriterien 25 3.1.2 Ausschlusskriterien 25 3.2 Kohortendesign 25 3.3 Klinische Daten 26 3.4 Materialgewinnung 27 3.4.1 Proben-Lagerung 27 3.4.2 DNA-Extraktion 27 3.5 Sanger Sequenzierung Prä-WES 29 3.5.1 Primer-Design 29 3.5.2 Polymerase Kettenreaktion 29 3.5.3 Elektrophorese 31 3.5.4 Aufreinigung PCR-Produkt 33 3.5.5 Sequenzierreaktion 35 3.6 WES 38 3.6.1 Datensatz 41 3.6.2 CNV-Analyse 42 3.7 Sanger Sequenzierung Validierung 42 3.8 Statistische Auswertung 45 4 Ergebnisse 47 4.1 Deskriptive klinisch-pathologische Beschreibung der Kohorte 47 4.1.1 Klinisch-pathologische Zusammenhänge 54 4.2 TERTp-Sequenzierung 58 4.3 Datensatz WES 58 4.3.1 Somatische Mutationen 59 4.3.2 CNV-Analyse 67 4.4 Altersbezogene molekulargenetische Unterschiede 74 4.5 Zusammenhang zwischen Genotyp und OS sowie PFS 77 4.5.1 Somatische Mutationen 77 4.5.2 CNV-Analyse 78 5 Diskussion 82 5.1 Klinische Charakteristika von Patienten mit IDH-Wildtyp Glioblastom 82 5.2 Der prognostische Stellenwert von Tumoreigenschaften 84 5.3 Molekulargenetisches Profil des IDH-Wildtyp Glioblastoms 85 5.3.1 Somatische Mutationen und Copy Number Variations 85 5.3.2 Chromosomale Aberrationen 94 5.4 10q21.3-Deletion 95 6 Zusammenfassung 97 6.1 Deutsch 97 6.2 Englisch 99 Anlagen 101 Darstellung zur Geschlechtsneutralität im geschriebenen Wort 101 Erklärung zur Eröffnung des Promotionsverfahren 102 Erklärung zur Einhaltung der gesetzlichen Vorgaben 104 Anhang 105 Literaturverzeichnis 113 Abbildungsverzeichnis 125 Tabellenverzeichnis 127 Danksagung 128 / Glioblastomas account for approximately 47% of all intrinsic central nervous tumors. They are characterized by an aggressive and invasive growth pattern. Early and, if possible, complete resection followed by simultaneous radiochemotherapy is crucial for treatment success. However, tumor recurrence within a few months are very frequent. Despite intensive research, there are still hardly any alternative treatment options. The understanding of the pathogenesis of glioblastomas underwent profound changes in recent years. After considering molecular markers in the WHO classification, glioblastomas have been divided into two molecular groups: IDH-wild-type (95% of cases) and IDH-mutated glioblastomas. IDH-wild-type glioblastomas occur in patients with a median age of 64 years and are associated with an unfavorable prognosis (median survival 14.2 months). On the other hand, IDH-mutated glioblastomas are mainly associated with young patients with a median age of 45 years and have a rather good prognosis with a median survival of 4-5 years. In IDH- wild-type glioblastomas, TERTp-, and PTEN-mutations as well as EGFR-amplifications have been described most frequently. Among them, TERTp-mutation represents the most frequent somatic alteration in the genome of IDH-wild-type glioblastomas. The above molecular markers provide a solid basis for molecular diagnosis of IDH-wild-type glioblastomas. To date, however, the reason why IDH-wild-type glioblastomas appear primarily in older patients with younger patients having a better prognosis remains unclear. Assuming that IDH-wild-type glioblastomas have an age-specific molecular signature with possible impact on the outcome, we analyzed tumor and corresponding blood samples from 55 patients by whole exome sequencing. After filtering the raw data, various mutations and copy number variations were identified. To validate the method, a literature review as well as Sanger Sequencing of selected candidate genes was performed. A total of 1841 mutations on 1544 different genes were detected. Although many mutations appeared to be background mutations with no relevance to pathogenesis, an enormous number of different driver mutations remained. The manually sequenced TERTp-mutation was the most abundant at 76.4%. Other driver mutations, for example EGFR, TP53, PTEN, PI3K group, NF1 and PDGFRA showed prevalence comparable to published data and emphasized the validity of the method. The copy number variations that occurred concurred previously described molecular genetic characteristics of IDH wild-type glioblastoma at both chromosomal (chromosome 7 amplification and chromosome 10 deletion) and gene-specific levels (EGFR-, CDK6-, MET-, PDGFRA-amplification and CDKN2A/B-, and PTEN-deletion). Via clustering of these alterations and juxtaposition with clinical features, the typical glioblastoma signatures (proneural, classic, mesenchymal) could be described and related to age of diagnosis. In line with the literature, our data showed that a proneural signature was associated with younger patients and favorable prognosis. Unexpectedly, a patient with a pediatric signature and high age of diagnosis, showed a survival above average compared with his age group. Regardless of molecular alterations, young age was an independent characteristic of favorable prognosis. For individual genetic alterations, no association with age of diagnosis or (progression-free) survival could be established. Thus, an age-specific mutational pattern could not be identified. The relatively small cohort size (n=55) must be noted as a limiting factor. An increase of the study population was not possible in this study design due to the low incidence of young patients with IDH wild-type glioblastoma and could be realized in a multicenter approach or a long acquisition phase in the future. Nevertheless, the abundance of identified driver mutations highlighted the large intratumoral heterogeneity of glioblastoma. In addition, the tremendous diagnostic depth of the method used enabled the identification of the TET1-deletion not previously described in the context of IDH wild-type glioblastoma. Although the detailed role of TET1-deletion in glioblastoma is not yet understood, our data provides promising evidence that loss of function of the TET1-enzyme in combination with EGFR-amplification or deletion of PTEN or CDKN2A/B has an impact on the pathogenesis of IDH wild-type glioblastoma and negatively affects prognosis. Future genetic sequencing is indicated to confirm the role of TET1-deletion and moreover to get further understanding of the genomic pathogenesis of glioblastoma with the aim to derive individualized therapeutic approaches.:Abkürzungsverzeichnis 5 1 Einleitung 8 1.1 Klinische Grundlagen des Glioblastoms 8 1.1.1 Epidemiologie/Ätiologie 8 1.1.2 Symptomatik und Diagnostik 9 1.1.3 Therapie 10 1.1.4 Prognose 12 1.2 Pathologie und Molekulargenetische Veränderungen des Glioblastoms 12 1.2.1 Treibergene 13 1.2.2 Subgruppen 17 1.3 Fragestellung 18 2 Materialien 19 3 Methoden 23 3.1 Patientenrekrutierung 23 3.1.1 Erweiterte Einschlusskriterien 25 3.1.2 Ausschlusskriterien 25 3.2 Kohortendesign 25 3.3 Klinische Daten 26 3.4 Materialgewinnung 27 3.4.1 Proben-Lagerung 27 3.4.2 DNA-Extraktion 27 3.5 Sanger Sequenzierung Prä-WES 29 3.5.1 Primer-Design 29 3.5.2 Polymerase Kettenreaktion 29 3.5.3 Elektrophorese 31 3.5.4 Aufreinigung PCR-Produkt 33 3.5.5 Sequenzierreaktion 35 3.6 WES 38 3.6.1 Datensatz 41 3.6.2 CNV-Analyse 42 3.7 Sanger Sequenzierung Validierung 42 3.8 Statistische Auswertung 45 4 Ergebnisse 47 4.1 Deskriptive klinisch-pathologische Beschreibung der Kohorte 47 4.1.1 Klinisch-pathologische Zusammenhänge 54 4.2 TERTp-Sequenzierung 58 4.3 Datensatz WES 58 4.3.1 Somatische Mutationen 59 4.3.2 CNV-Analyse 67 4.4 Altersbezogene molekulargenetische Unterschiede 74 4.5 Zusammenhang zwischen Genotyp und OS sowie PFS 77 4.5.1 Somatische Mutationen 77 4.5.2 CNV-Analyse 78 5 Diskussion 82 5.1 Klinische Charakteristika von Patienten mit IDH-Wildtyp Glioblastom 82 5.2 Der prognostische Stellenwert von Tumoreigenschaften 84 5.3 Molekulargenetisches Profil des IDH-Wildtyp Glioblastoms 85 5.3.1 Somatische Mutationen und Copy Number Variations 85 5.3.2 Chromosomale Aberrationen 94 5.4 10q21.3-Deletion 95 6 Zusammenfassung 97 6.1 Deutsch 97 6.2 Englisch 99 Anlagen 101 Darstellung zur Geschlechtsneutralität im geschriebenen Wort 101 Erklärung zur Eröffnung des Promotionsverfahren 102 Erklärung zur Einhaltung der gesetzlichen Vorgaben 104 Anhang 105 Literaturverzeichnis 113 Abbildungsverzeichnis 125 Tabellenverzeichnis 127 Danksagung 128