O pistilo, contido na flor, contém diferentes tecidos especializados. O estudo da expressão gênica neste órgão é fundamental para um melhor entendimento do processo reprodutivo vegetal. Experimentos de RT-PCR, utilizando um \"pool\" de cDNAs de estigma/estilete de Nicotiana tabacum, permitiram a clonagem do cDNA MT1. Este transcrito codifica uma proteína com alta similaridade a metiltransferases da família SABATH, e corresponde à seqüência completa do gene NtJAMT (Nicotiana tabacum Jasmonic Acid Methyltransferase). Metiltransferases são enzimas capazes de transferir radicais metil, a partir de um substrato doador (SAM - S-adenosil-L-metionina), para grupamentos carboxílicos livres em diversos metabólitos secundários de plantas, tais como os ácidos salicílico, benzóico, jasmônico e dihidro jasmônico. Os compostos metilados resultantes estão envolvidos em processos fisiológicos cruciais para as plantas, como por exemplo, desenvolvimento do vegetal, polinização, respostas de defesa, e sinalização química, entre outros. Através da abordagem de MEFS, ensaios de captação de compostos voláteis usando flores de Nicotiana tabacum no estádio 11 do desenvolvimento floral, foram realizados. Análises por CG-EM mostraram que apenas os compostos MeJa e dihidroMeJa foram identificados, nos três períodos de amostragem (manhã , tarde e noite). Ensaios adicionais in vivo, utilizando pistilos inteiros macerados em solução saturada de CaCl2 5M, foram realizados. Após análises por MEFS/CG-EM, foi detectada a presença apenas do composto dihidroMeJa, e nenhum traço dos outros três compostos foi identificado. O cDNA MT1 foi clonado nos vetores pDEST17 e pETSUMO, resultando nas construções pEXP17-MT1 e pETSUMO-MT1 que produziram, respectivamente, as proteínas recombinantes rMT1 e rS-MT1. A proteína rMT1 foi utilizada em ensaios enzimáticos in vitro, na presença de diferentes substratos (ácidos salicílico/benzóico/jasmônico/dihidro jasmônico), em quantidades equimolares (10mM). Dois tipos de ensaios foram realizados: 1) os ácidos foram adicionados, separadamente, no meio de cultura bacteriano induzido, e também no lisado celular (ensaio individual); e 2) dois diferentes ácidos foram adicionados, em cada frasco, no meio de cultura bacteriano induzido (ensaio de competição). Análises por CG-EM mostraram que, nos ensaios individuais, a proteína rMT1 foi capaz de produzir o composto metiljasmonato (MeJa) predominantemente, tanto nos ensaios em meio de cultura, quanto nos ensaios utilizando o lisado celular, sendo que neste último obteve-se o melhor resultado. No ensaio em meio de cultura, o composto metilbenzoato (MeBa) foi obtido em baixa quantidade, o composto metilsalicilato (MeSa) foi produzido em uma quantidade extremamente baixa, e o composto dihidro metiljasmonato (dihidroMeJa) não foi detectado. Nos ensaios de competição enzimática, o composto MeJa foi o único a ser produzido, nos frascos onde o ácido jasmônico foi adicionado juntamente com outro ácido. A proteína rS-MT1, purificada em resina de níquel, foi capaz de produzir apenas os compostos MeJa e dihidroMeJa, como demonstrado pelas análises por CG-EM. Ensaios enzimáticos in vitro, utilizando as proteínas r46B11 e r134B02, correspondendo aos putativos transcritos de processamento alternativo do gene NtJAMT, foram realizados. Utilizando os mesmos ácidos como substratos, nas mesmas concentrações daquelas usadas para rMT1, mostrouse que r46B11 produziu MeJa predominantemente, MeSa e MeBa em quantidades extremamente baixas, e o dihidroMeJa não foi produzido. De acordo com os resultados de CG-EM, a proteína r134B02 foi capaz de produzir apenas o MeJa. Anticorpos policlonais, produzidos contra a proteína rMT1 em camundongos Balb/C, foram utilizados em ensaios de ELISA e western blot. O anticorpo anti-rMT1 foi capaz de reconhecer as três proteínas, rMT1, r46B11 r134B02, em ensaios de western blot, demonstrando alta imunoreatividade. Ensaios adicionais de ELISA e western blot, com proteínas totais extraídas dos tecidos do estigma/estilete, ovário e folha, e o anticorpo antirMT1 como anticorpo primário, foram capazes de demonstrar a presença de metiltransferases nos tecidos do estigma/estilete e ovário, que estão ausentes em folhas. Esses resultados corroboram os experimentos de northern blot previamente realizados (Ângelo, 2001). A proteína r134B02 foi também utilizada para a produção de anticorpos policlonais em camundongos Balb/C. Em ensaios de western blot, esses anticorpos foram capazes de reconhecer a proteína r134B02, demonstrando alta imunoreatividade. Proteínas totais extraídas dos tecidos do estigma/estilete, ovário e folha foram usadas em um novo ensaio de western blot, com o anticorpo anti-r134B02. O resultado mostrou que esse anticorpo foi capaz de reconhecer uma banda correspondente à proteína MT1 nativa nos tecidos do estigma/estilete e ovário, assim como proteínas adicionais com massas variando de 18kDa a 32kDa nos mesmos tecidos, mas não reconheceu uma banda correspondente a proteína 134B02 nativa. Análises adicionais, realizadas em nosso banco de dados TOBEST, utilizando o programa TBlastX identificaram os clones TOBS114G06, TOBS040E09, TOBS076D02, codificando proteínas com alta similaridade às enzimas lipoxigenase (LOX), allene oxide cyclase (AOC) e 12-oxophytodienoate reductase (12-OPR), respectivamente, cruciais para a biossíntese do ácido jasmônico. Nenhum clone com similaridade significativa à enzima AOS foi encontrado durante esta análise. Além disso, uma pesquisa adicional no TOBEST identificou o clone TOBC130F10, codificando uma proteína com alta similaridade a fosfolipases do tipo A2, que são enzimas fundamentais nos primeiros passos da via de biossíntese do JA. Tomados juntos, os resultados apresentados aqui sugerem a existência de uma via de biossíntese do ácido jasmônico específica do pistilo, voltada para a produção de compostos jasmonatos nas flores de N. tabacum. É sugerido que tais compostos, atuando em sua forma volátil, estariam envolvidos em mecanismos de comunicação entre pistilos e estames da mesma flor, flores diferentes da mesma planta, ou em uma comunicação entre plantas vizinhas. Tal comunicação permitiria um controle temporal de amadurecimento dos órgãos reprodutivos (sincronização), favorecendo um processo de fertilização bem-sucedido / The pistil, enclosed in the flower, contains different specialized tissues. The study of gene expression in this organ is crucial to a better understanding of plant reproductive process. RT-PCR experiments, using a Nicotiana tabacum stigma/style cDNA pool from allowed the cloning of the MT1 cDNA. This transcript encodes a protein with high similarity to methyltransferases of the SABATH family and corresponds to the full-length sequence of NtJAMT (Nicotiana tabacum Jasmonic Acid Methyltransferase) gene. Methyltransferases are enzymes capable of transferring methyl radicals, from a donor substrate (SAM - S-adenosyl-L-methionine), to free carboxylic groups in several plant secondary metabolites such as salicylic/benzoic/jasmonic/dihydrojasmonic acids. The resulting methylated compounds are involved in crucial physiological process to plants as, for example, plant development, pollination, defense responses, and chemical signaling, among others. Through SPME approach, assays of volatile compounds capture using Nicotiana tabacum flowers at stage 11 of floral development were performed. GC-MS analyses have shown that only MeJa and dihydroMeJa compounds were identified, in the three sampling periods (morning, afternoon and evening). Additional in vivo assays, using whole pistils ground in a 5M CaCl2 saturated solution were performed. After SPME/GC-MS, only the dihydroMeJa compound was detected and no trace of the other three compounds was identified. The MT1 cDNA was cloned in the pDEST17 and pETSUMO vectors resulting in the pEXP17-MT1 and pETSUMO-MT1 constructions, which ge) given produced, respectively, the rMT1 and rS-MT1 recombinant proteins. The rMT1 protein was used in in vitro enzymatic assays, in the presence of equimolar amounts (10mM) of the different substrates (salicylic/benzoic/jasmonic/dihydrojasmonic acids). Two different kinds of assays were performed: 1) the acids were added separately in each vial containing the induced bacterial culture medium and also in the cell lysate (individual assay); and 2) two different acids were added, in each vial, in the induced bacterial culture medium (competition assay). GC-MS analyses have shown tha in the individual assays the rMT1 protein was capable of producing the methyljasmonate compound (MeJa) predominantly, in the culture medium assay, as well as in the cell lysate, in which a better result was obtained. In the culture medium assay, the methylbenzoate (MeBa) compound was obtained in low amount, the methylsalicilate (MeSa) compound was produced in an extremely low amount, and the dihydro methyljasmonate (dihydroMeJa) was not detected. In the competition enzymatic assays, the MeJa was the only compound produced, in the flasks in which jasmonic acid was added along with another acid. The rS-MT1 protein, purified in niquel resin, was capable of producing only the MeJa and dihydroMeJa compounds, as demonstrated by the GC-MS analysis. In vitro enzymatic assays, using the r46B11 and r134B02 proteins, corresponding to the putative alternative spliced transcripts from NtJAMT gene, were performed. Using the same acids as substrates, in the same concentrations used for rMT1, it was shown that r46B11 produced MeJa predominantly, MeSa and MeBA in extremely low amounst and the dihydroMeJa was not produced. According the GC-MS results, the r134B02 protein was capable of producing only MeJa. Policlonal antibodies produced against the rMT1 protein in Balb/C mice were used in ELISA and western blot assays. The anti-rMT1 antibody was capable to recognize the three proteins, rMT1, r46B11 and r134B02, in the western blot assay, demonstrating a high immunoreactivity. Additional ELISA and western blot assays, with total protein extracts from stigma/style, ovary and leaf tissues using the antir-MT1 as primary antibody were, capable to demonstrate the presence of methyltransferases in the stigma/style tissues, which are absent in leaves. These results corroborate the northern blot experiments previously performed (Ângelo, 2001). The r134B02 protein was also used to produce polyclonal antibodies in Balb/C mice. In western blot assays, this polyclonal antibody was capable of recognizing the r134B02 protein, demonstrating high immunoreactivity. Total protein extracts from stigma/style, ovary and leaf were used in a new western blot assay, using the anti-r134B02 antibody. The result has shown that this antibody is capable to recognize a band corresponding to the native MT1 protein in stigma/style and ovary tissues, as well as additional proteins with masses ranging from 18kDa to 32kDa in the same tissues, but did not recognized a band corresponding to the native 134B02 protein. Additional analysis, performed in our TOBEST database, using the TBlastX program, identified the TOBS114G06, TOBS040E09, TOBS076D02 clones, encoding proteins with high similarity to lipoxygenase (LOX), allene oxide cyclase (AOC) and 12- oxophytodienoate reductase (12-OPR) enzymes, respectively, crucial to the jasmonic acid (JA) biosynthesis pathway. No clone with significant similarity to the AOS enzyme was found during this analysis. Moreover, an additional search in the TOBEST identified the TOBC130F10 clone, encoding a protein with high similarity to type A2 phospholipases, which are fundamental enzymes in the first steps of JA biosynthesis pathway. Taken together, the results presented here suggest the existence of a pistil-specific JA biosynthesis pathway, towards the production of jasmonates compounds in the N. tabacum flowers. It is suggested that such compounds, acting in their volatile form, would be involved in a communication mechanism between pistils and stamens of the same flower, different flowers of the same plant, or in a communication between neighboring plants. Such communication would enable a temporal control of the reproductive organs ripening (synchronization), favoring a successful fertilization process

O pistilo, contido na flor, contém diferentes tecidos especializados. O estudo da expressão gênica neste órgão é fundamental para um melhor entendimento do processo reprodutivo vegetal. Experimentos de RT-PCR, utilizando um \"pool\" de cDNAs de estigma/estilete de Nicotiana tabacum, permitiram a clonagem do cDNA MT1. Este transcrito codifica uma proteína com alta similaridade a metiltransferases da família SABATH, e corresponde à seqüência completa do gene NtJAMT (Nicotiana tabacum Jasmonic Acid Methyltransferase). Metiltransferases são enzimas capazes de transferir radicais metil, a partir de um substrato doador (SAM - S-adenosil-L-metionina), para grupamentos carboxílicos livres em diversos metabólitos secundários de plantas, tais como os ácidos salicílico, benzóico, jasmônico e dihidro jasmônico. Os compostos metilados resultantes estão envolvidos em processos fisiológicos cruciais para as plantas, como por exemplo, desenvolvimento do vegetal, polinização, respostas de defesa, e sinalização química, entre outros. Através da abordagem de MEFS, ensaios de captação de compostos voláteis usando flores de Nicotiana tabacum no estádio 11 do desenvolvimento floral, foram realizados. Análises por CG-EM mostraram que apenas os compostos MeJa e dihidroMeJa foram identificados, nos três períodos de amostragem (manhã , tarde e noite). Ensaios adicionais in vivo, utilizando pistilos inteiros macerados em solução saturada de CaCl2 5M, foram realizados. Após análises por MEFS/CG-EM, foi detectada a presença apenas do composto dihidroMeJa, e nenhum traço dos outros três compostos foi identificado. O cDNA MT1 foi clonado nos vetores pDEST17 e pETSUMO, resultando nas construções pEXP17-MT1 e pETSUMO-MT1 que produziram, respectivamente, as proteínas recombinantes rMT1 e rS-MT1. A proteína rMT1 foi utilizada em ensaios enzimáticos in vitro, na presença de diferentes substratos (ácidos salicílico/benzóico/jasmônico/dihidro jasmônico), em quantidades equimolares (10mM). Dois tipos de ensaios foram realizados: 1) os ácidos foram adicionados, separadamente, no meio de cultura bacteriano induzido, e também no lisado celular (ensaio individual); e 2) dois diferentes ácidos foram adicionados, em cada frasco, no meio de cultura bacteriano induzido (ensaio de competição). Análises por CG-EM mostraram que, nos ensaios individuais, a proteína rMT1 foi capaz de produzir o composto metiljasmonato (MeJa) predominantemente, tanto nos ensaios em meio de cultura, quanto nos ensaios utilizando o lisado celular, sendo que neste último obteve-se o melhor resultado. No ensaio em meio de cultura, o composto metilbenzoato (MeBa) foi obtido em baixa quantidade, o composto metilsalicilato (MeSa) foi produzido em uma quantidade extremamente baixa, e o composto dihidro metiljasmonato (dihidroMeJa) não foi detectado. Nos ensaios de competição enzimática, o composto MeJa foi o único a ser produzido, nos frascos onde o ácido jasmônico foi adicionado juntamente com outro ácido. A proteína rS-MT1, purificada em resina de níquel, foi capaz de produzir apenas os compostos MeJa e dihidroMeJa, como demonstrado pelas análises por CG-EM. Ensaios enzimáticos in vitro, utilizando as proteínas r46B11 e r134B02, correspondendo aos putativos transcritos de processamento alternativo do gene NtJAMT, foram realizados. Utilizando os mesmos ácidos como substratos, nas mesmas concentrações daquelas usadas para rMT1, mostrouse que r46B11 produziu MeJa predominantemente, MeSa e MeBa em quantidades extremamente baixas, e o dihidroMeJa não foi produzido. De acordo com os resultados de CG-EM, a proteína r134B02 foi capaz de produzir apenas o MeJa. Anticorpos policlonais, produzidos contra a proteína rMT1 em camundongos Balb/C, foram utilizados em ensaios de ELISA e western blot. O anticorpo anti-rMT1 foi capaz de reconhecer as três proteínas, rMT1, r46B11 r134B02, em ensaios de western blot, demonstrando alta imunoreatividade. Ensaios adicionais de ELISA e western blot, com proteínas totais extraídas dos tecidos do estigma/estilete, ovário e folha, e o anticorpo antirMT1 como anticorpo primário, foram capazes de demonstrar a presença de metiltransferases nos tecidos do estigma/estilete e ovário, que estão ausentes em folhas. Esses resultados corroboram os experimentos de northern blot previamente realizados (Ângelo, 2001). A proteína r134B02 foi também utilizada para a produção de anticorpos policlonais em camundongos Balb/C. Em ensaios de western blot, esses anticorpos foram capazes de reconhecer a proteína r134B02, demonstrando alta imunoreatividade. Proteínas totais extraídas dos tecidos do estigma/estilete, ovário e folha foram usadas em um novo ensaio de western blot, com o anticorpo anti-r134B02. O resultado mostrou que esse anticorpo foi capaz de reconhecer uma banda correspondente à proteína MT1 nativa nos tecidos do estigma/estilete e ovário, assim como proteínas adicionais com massas variando de 18kDa a 32kDa nos mesmos tecidos, mas não reconheceu uma banda correspondente a proteína 134B02 nativa. Análises adicionais, realizadas em nosso banco de dados TOBEST, utilizando o programa TBlastX identificaram os clones TOBS114G06, TOBS040E09, TOBS076D02, codificando proteínas com alta similaridade às enzimas lipoxigenase (LOX), allene oxide cyclase (AOC) e 12-oxophytodienoate reductase (12-OPR), respectivamente, cruciais para a biossíntese do ácido jasmônico. Nenhum clone com similaridade significativa à enzima AOS foi encontrado durante esta análise. Além disso, uma pesquisa adicional no TOBEST identificou o clone TOBC130F10, codificando uma proteína com alta similaridade a fosfolipases do tipo A2, que são enzimas fundamentais nos primeiros passos da via de biossíntese do JA. Tomados juntos, os resultados apresentados aqui sugerem a existência de uma via de biossíntese do ácido jasmônico específica do pistilo, voltada para a produção de compostos jasmonatos nas flores de N. tabacum. É sugerido que tais compostos, atuando em sua forma volátil, estariam envolvidos em mecanismos de comunicação entre pistilos e estames da mesma flor, flores diferentes da mesma planta, ou em uma comunicação entre plantas vizinhas. Tal comunicação permitiria um controle temporal de amadurecimento dos órgãos reprodutivos (sincronização), favorecendo um processo de fertilização bem-sucedido / The pistil, enclosed in the flower, contains different specialized tissues. The study of gene expression in this organ is crucial to a better understanding of plant reproductive process. RT-PCR experiments, using a Nicotiana tabacum stigma/style cDNA pool from allowed the cloning of the MT1 cDNA. This transcript encodes a protein with high similarity to methyltransferases of the SABATH family and corresponds to the full-length sequence of NtJAMT (Nicotiana tabacum Jasmonic Acid Methyltransferase) gene. Methyltransferases are enzymes capable of transferring methyl radicals, from a donor substrate (SAM - S-adenosyl-L-methionine), to free carboxylic groups in several plant secondary metabolites such as salicylic/benzoic/jasmonic/dihydrojasmonic acids. The resulting methylated compounds are involved in crucial physiological process to plants as, for example, plant development, pollination, defense responses, and chemical signaling, among others. Through SPME approach, assays of volatile compounds capture using Nicotiana tabacum flowers at stage 11 of floral development were performed. GC-MS analyses have shown that only MeJa and dihydroMeJa compounds were identified, in the three sampling periods (morning, afternoon and evening). Additional in vivo assays, using whole pistils ground in a 5M CaCl2 saturated solution were performed. After SPME/GC-MS, only the dihydroMeJa compound was detected and no trace of the other three compounds was identified. The MT1 cDNA was cloned in the pDEST17 and pETSUMO vectors resulting in the pEXP17-MT1 and pETSUMO-MT1 constructions, which ge) given produced, respectively, the rMT1 and rS-MT1 recombinant proteins. The rMT1 protein was used in in vitro enzymatic assays, in the presence of equimolar amounts (10mM) of the different substrates (salicylic/benzoic/jasmonic/dihydrojasmonic acids). Two different kinds of assays were performed: 1) the acids were added separately in each vial containing the induced bacterial culture medium and also in the cell lysate (individual assay); and 2) two different acids were added, in each vial, in the induced bacterial culture medium (competition assay). GC-MS analyses have shown tha in the individual assays the rMT1 protein was capable of producing the methyljasmonate compound (MeJa) predominantly, in the culture medium assay, as well as in the cell lysate, in which a better result was obtained. In the culture medium assay, the methylbenzoate (MeBa) compound was obtained in low amount, the methylsalicilate (MeSa) compound was produced in an extremely low amount, and the dihydro methyljasmonate (dihydroMeJa) was not detected. In the competition enzymatic assays, the MeJa was the only compound produced, in the flasks in which jasmonic acid was added along with another acid. The rS-MT1 protein, purified in niquel resin, was capable of producing only the MeJa and dihydroMeJa compounds, as demonstrated by the GC-MS analysis. In vitro enzymatic assays, using the r46B11 and r134B02 proteins, corresponding to the putative alternative spliced transcripts from NtJAMT gene, were performed. Using the same acids as substrates, in the same concentrations used for rMT1, it was shown that r46B11 produced MeJa predominantly, MeSa and MeBA in extremely low amounst and the dihydroMeJa was not produced. According the GC-MS results, the r134B02 protein was capable of producing only MeJa. Policlonal antibodies produced against the rMT1 protein in Balb/C mice were used in ELISA and western blot assays. The anti-rMT1 antibody was capable to recognize the three proteins, rMT1, r46B11 and r134B02, in the western blot assay, demonstrating a high immunoreactivity. Additional ELISA and western blot assays, with total protein extracts from stigma/style, ovary and leaf tissues using the antir-MT1 as primary antibody were, capable to demonstrate the presence of methyltransferases in the stigma/style tissues, which are absent in leaves. These results corroborate the northern blot experiments previously performed (Ângelo, 2001). The r134B02 protein was also used to produce polyclonal antibodies in Balb/C mice. In western blot assays, this polyclonal antibody was capable of recognizing the r134B02 protein, demonstrating high immunoreactivity. Total protein extracts from stigma/style, ovary and leaf were used in a new western blot assay, using the anti-r134B02 antibody. The result has shown that this antibody is capable to recognize a band corresponding to the native MT1 protein in stigma/style and ovary tissues, as well as additional proteins with masses ranging from 18kDa to 32kDa in the same tissues, but did not recognized a band corresponding to the native 134B02 protein. Additional analysis, performed in our TOBEST database, using the TBlastX program, identified the TOBS114G06, TOBS040E09, TOBS076D02 clones, encoding proteins with high similarity to lipoxygenase (LOX), allene oxide cyclase (AOC) and 12- oxophytodienoate reductase (12-OPR) enzymes, respectively, crucial to the jasmonic acid (JA) biosynthesis pathway. No clone with significant similarity to the AOS enzyme was found during this analysis. Moreover, an additional search in the TOBEST identified the TOBC130F10 clone, encoding a protein with high similarity to type A2 phospholipases, which are fundamental enzymes in the first steps of JA biosynthesis pathway. Taken together, the results presented here suggest the existence of a pistil-specific JA biosynthesis pathway, towards the production of jasmonates compounds in the N. tabacum flowers. It is suggested that such compounds, acting in their volatile form, would be involved in a communication mechanism between pistils and stamens of the same flower, different flowers of the same plant, or in a communication between neighboring plants. Such communication would enable a temporal control of the reproductive organs ripening (synchronization), favoring a successful fertilization process

No description available.

M.Tech. / The tobacco species Nicotiana tabacum has been cultivated in South Africa since 1657, South Africa is considered to be a major producer and exporter of tobacco worldwide. The chlorine percentage of the leaf is very important to cigarette manufacturers when purchasing tobacco from farmers, as a high chlorine percentage value affects the burning quality of the cigarette. The chlorine percentage of the leaves depends on many factors such as rainfall, fertilizer, soil content of chlorine and irrigation. If tobacco with a high chlorine content is not phased out, South African tobacco will lose its export value and the value of the farmers crop may decrease by up to 35%. The research study was undertaken to establish the effect of an isopathically prepared treatment, Chlorine 9CH, on the chlorine percentage levels of (growing) Nicotiana tabacum plants. The research was conducted on the farm J151 in Marble Hall, Mpumalanga from 15 November 2004 to 4 March 2005. Two groups each containing fifty plants were randomly chosen to serve as the Control and Experimental group. There was an initial control period of four weeks during which two Pre-tests were performed on ten plants in each group at two week intervals. The experimental component of the study took place over two months during which the Experimental group was treated with Chlorine 9CH via a knapsack and the Control group was treated with filtered water only via a knapsack sprayer. Both groups were treated twice daily. During the experimental component, two Post-tests were performed on ten plants from each group (at week 8 and week 12) and the third Post-test was performed on the cured leaves the final row of each group (at week 12 and week 14).

Ureases (EC 3.5.1.5) são amplamente distribuídas em bactérias, fungos e plantas onde sua função biológica não é completamente conhecida. Acredita-se que ureases estejam envolvidas na biodisponibilidade de nitrogênio e mecanismos de defesa contra predadores e patógenos. Plantas de soja Glycine max (L.) Merril contêm duas isoformas de urease. Neste trabalho, clonamos e seqüenciamos um fragmento de 300 pb que corresponde a uma região interna do gene de urease. Relatamos, também, a utilização de um gene de soja como modo de gerar resistência a doenças fúngicas em plantas. Plantas transgênicas de tabaco (Nicotiana tobacum var. Turkish) contendo o cDNA codificador completo da urease ubíqua de soja sob a regulação do promotor 35S do vírus do mosaico da couveflor (CaMV) e do terminador do gene da nopalina sintase, foram geradas a partir da transformação de discos foliares por Agrobacterium tumefaciens. Extratos proteicos obtidos a partir das folhas das plantas transgênicas foram analisados quanto à atividade ureásica e à imunorreatividade contra anticorpos da urease do feijão-de-porco. A habilidade dos extratos proteicos em inibir o crescimento de fungos fitopatogênicos foi comparada com a atividade fungicida da urease embrião-específica isolada de sementes tipo-selvagem. Nossos resultados demonstraram a atividade antifúngica de ambas as isoformas de urease e apresentaram uma correlação positiva entre a inibição do crescimento de fungos e o conteúdo/atividade da urease ubíqua de soja recombinante. Os dados sugerem que a superexpressão da urease, em plantas transgências, pode auxiliar na resistência das plantas contra fungos fitopatogênicos, além de seus efeitos conhecidos sobre insetos. / Ureases (EC 3.5.1.5) are largely distributed in bacterial, fungi and plants, where theis physiological role is not completely understood. It is thought that ureases are involved in nitrogen bioavailability and defense mechanisms against predators and pathogens. Soybean [Glycine max (L.) Merril] plants contain two isoforms of urease. Here we describe the cloning and sequencing of a fragment of 300 bp corresponding to an internal region of one of the soybean urease genes. Here we also reported the employment of a gene from soybean as a tool to confer resistance to fungal diseases in plants. Transformed tobacco (Nicotiana tobacum var. Turkish) plants harbouring the full length cDNA encoding the soybean ubiquitous urease under the control of the Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) 35S promoter and the nopaline synthase gene (nos) terminator were obtained after leaf disc transformation by Agrobacterium tumefaciens. Leaf protein extracts of transgenic plants were analyzed for urease activity and immunoreactivity against antibodies to the jackbean urease. The ability of leaf protein extracts to impair growth of selected phytopathogens was compared to the fungicidal activity of the embryo-specific urease isolated from wild-type seeds. Our results demonstrated the antifungal activity of both soybean ureases and showed a positive correlation between the inhibiton of fungal growth and content/activity of the recombinant soybean ubiquitous urease in leaves of transgenic tobacco. The data suggest that urease overexpression in transgenic plants may help to improve plant resistance against phytopathogenic fungi, besides its known effect on insects.

Ureases (EC 3.5.1.5) são amplamente distribuídas em bactérias, fungos e plantas onde sua função biológica não é completamente conhecida. Acredita-se que ureases estejam envolvidas na biodisponibilidade de nitrogênio e mecanismos de defesa contra predadores e patógenos. Plantas de soja Glycine max (L.) Merril contêm duas isoformas de urease. Neste trabalho, clonamos e seqüenciamos um fragmento de 300 pb que corresponde a uma região interna do gene de urease. Relatamos, também, a utilização de um gene de soja como modo de gerar resistência a doenças fúngicas em plantas. Plantas transgênicas de tabaco (Nicotiana tobacum var. Turkish) contendo o cDNA codificador completo da urease ubíqua de soja sob a regulação do promotor 35S do vírus do mosaico da couveflor (CaMV) e do terminador do gene da nopalina sintase, foram geradas a partir da transformação de discos foliares por Agrobacterium tumefaciens. Extratos proteicos obtidos a partir das folhas das plantas transgênicas foram analisados quanto à atividade ureásica e à imunorreatividade contra anticorpos da urease do feijão-de-porco. A habilidade dos extratos proteicos em inibir o crescimento de fungos fitopatogênicos foi comparada com a atividade fungicida da urease embrião-específica isolada de sementes tipo-selvagem. Nossos resultados demonstraram a atividade antifúngica de ambas as isoformas de urease e apresentaram uma correlação positiva entre a inibição do crescimento de fungos e o conteúdo/atividade da urease ubíqua de soja recombinante. Os dados sugerem que a superexpressão da urease, em plantas transgências, pode auxiliar na resistência das plantas contra fungos fitopatogênicos, além de seus efeitos conhecidos sobre insetos. / Ureases (EC 3.5.1.5) are largely distributed in bacterial, fungi and plants, where theis physiological role is not completely understood. It is thought that ureases are involved in nitrogen bioavailability and defense mechanisms against predators and pathogens. Soybean [Glycine max (L.) Merril] plants contain two isoforms of urease. Here we describe the cloning and sequencing of a fragment of 300 bp corresponding to an internal region of one of the soybean urease genes. Here we also reported the employment of a gene from soybean as a tool to confer resistance to fungal diseases in plants. Transformed tobacco (Nicotiana tobacum var. Turkish) plants harbouring the full length cDNA encoding the soybean ubiquitous urease under the control of the Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) 35S promoter and the nopaline synthase gene (nos) terminator were obtained after leaf disc transformation by Agrobacterium tumefaciens. Leaf protein extracts of transgenic plants were analyzed for urease activity and immunoreactivity against antibodies to the jackbean urease. The ability of leaf protein extracts to impair growth of selected phytopathogens was compared to the fungicidal activity of the embryo-specific urease isolated from wild-type seeds. Our results demonstrated the antifungal activity of both soybean ureases and showed a positive correlation between the inhibiton of fungal growth and content/activity of the recombinant soybean ubiquitous urease in leaves of transgenic tobacco. The data suggest that urease overexpression in transgenic plants may help to improve plant resistance against phytopathogenic fungi, besides its known effect on insects.

Ureases (EC 3.5.1.5) são amplamente distribuídas em bactérias, fungos e plantas onde sua função biológica não é completamente conhecida. Acredita-se que ureases estejam envolvidas na biodisponibilidade de nitrogênio e mecanismos de defesa contra predadores e patógenos. Plantas de soja Glycine max (L.) Merril contêm duas isoformas de urease. Neste trabalho, clonamos e seqüenciamos um fragmento de 300 pb que corresponde a uma região interna do gene de urease. Relatamos, também, a utilização de um gene de soja como modo de gerar resistência a doenças fúngicas em plantas. Plantas transgênicas de tabaco (Nicotiana tobacum var. Turkish) contendo o cDNA codificador completo da urease ubíqua de soja sob a regulação do promotor 35S do vírus do mosaico da couveflor (CaMV) e do terminador do gene da nopalina sintase, foram geradas a partir da transformação de discos foliares por Agrobacterium tumefaciens. Extratos proteicos obtidos a partir das folhas das plantas transgênicas foram analisados quanto à atividade ureásica e à imunorreatividade contra anticorpos da urease do feijão-de-porco. A habilidade dos extratos proteicos em inibir o crescimento de fungos fitopatogênicos foi comparada com a atividade fungicida da urease embrião-específica isolada de sementes tipo-selvagem. Nossos resultados demonstraram a atividade antifúngica de ambas as isoformas de urease e apresentaram uma correlação positiva entre a inibição do crescimento de fungos e o conteúdo/atividade da urease ubíqua de soja recombinante. Os dados sugerem que a superexpressão da urease, em plantas transgências, pode auxiliar na resistência das plantas contra fungos fitopatogênicos, além de seus efeitos conhecidos sobre insetos. / Ureases (EC 3.5.1.5) are largely distributed in bacterial, fungi and plants, where theis physiological role is not completely understood. It is thought that ureases are involved in nitrogen bioavailability and defense mechanisms against predators and pathogens. Soybean [Glycine max (L.) Merril] plants contain two isoforms of urease. Here we describe the cloning and sequencing of a fragment of 300 bp corresponding to an internal region of one of the soybean urease genes. Here we also reported the employment of a gene from soybean as a tool to confer resistance to fungal diseases in plants. Transformed tobacco (Nicotiana tobacum var. Turkish) plants harbouring the full length cDNA encoding the soybean ubiquitous urease under the control of the Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) 35S promoter and the nopaline synthase gene (nos) terminator were obtained after leaf disc transformation by Agrobacterium tumefaciens. Leaf protein extracts of transgenic plants were analyzed for urease activity and immunoreactivity against antibodies to the jackbean urease. The ability of leaf protein extracts to impair growth of selected phytopathogens was compared to the fungicidal activity of the embryo-specific urease isolated from wild-type seeds. Our results demonstrated the antifungal activity of both soybean ureases and showed a positive correlation between the inhibiton of fungal growth and content/activity of the recombinant soybean ubiquitous urease in leaves of transgenic tobacco. The data suggest that urease overexpression in transgenic plants may help to improve plant resistance against phytopathogenic fungi, besides its known effect on insects.

Made available in DSpace on 2018-08-01T22:56:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_9382_Darcy Adriann.pdf: 1067264 bytes, checksum: 04c6250a2beb7cde0fdce121daa52a0f (MD5) Previous issue date: 2015-02-25 / O carrapato bovino tem sido responsável por grandes perdas econômicas na pecuária pela transmissão de doenças e redução da produção de carne e leite. Neste contexto, os produtos naturais constituem uma alternativa potencial aos carrapaticidas comerciais quepodem gerar acúmulo no meio ambiente e resíduos nos alimentos. Sendo assim, objetivou-se determinar o teor de fenóis totais e flavonoides totais e avaliar a eficácia carrapaticida de extratos vegetaisassociados ou não a biofilme sobre Rhipicephalus (Boophilus) microplus (CANESTRINI, 1887). As soluções extrativas deCapsicum chinense, Nicotiana tabacum, Chenopoide ambrosioides, Melia azedarach e Allium sativumforam testadas a 15%. A eficácia carrapaticida foi avaliada pela imersão de teleóginas nas soluções extrativas segundo Drummond (1973). O teste foi realizado em triplicata com 10 carrapatos por repetição. As soluções extrativas que apresentaram a maior eficiência carrapaticida foram incorporadas a 5% em soluções filmogênicas e avaliadas no controle, in vitro, de R. microplus utilizando a metodologia supracitada.Os maiores teores de fenóis totais e flavonóides totais foram encontrados nas soluções extrativas preparadas a partir da casca de cinamomo e das folhas de erva-de-santa-maria. As soluções extrativas a 15%com maior eficácia carrapaticida foram as de fumo (89,02%), casca de cinamomo (85,33%) e alho orgânico (58,36%). O biofilme incorporado com extrato de cinamomo a 5% apresentou o maior efeito carrapaticida (76,41%) quando comparado ao biofilme associado aos extratos de fumo (58,31 %), alho (34,16 %) e biofilme não associado (60,86%). Estudos futuros são importantes para determinar o efeito residual do extrato de cinamomo associado ao biofilme para avaliar seu potencial em assegurar a liberação controlada dos princípios ativos desse extrato.

O Brasil é o maior exportador e o segundo maior produtor de tabaco do mundo, de acordo com a safra de 2013/2014. A planta de tabaco (Nicotiana tabacum L.) é usada na fabricação de todos os derivados e a composição química do tabaco varia de acordo com o tipo de folha, como foram cultivadas, a região do plantio, as características da preparação (compressão, filtro e papel) e a variação de temperatura resultante da combustão incompleta do tabaco. Os derivados do tabaco são os produtos comercializados mais consumidos no mundo, como por exemplo, o cigarro, o charuto e o narguilé. Os efeitos danosos que estes produtos causam a saúde humana são há anos intensivamente discutidos e muitos estudos são realizados mundialmente relacionando o uso dos derivados do tabaco com diversas doenças. Existe pouca informação a respeito da caracterização radiológica da planta de tabaco na literatura internacional e nacional. O objetivo deste trabalho foi determinar a concentração dos radionuclídeos 238U, 234U, 230Th, 226Ra, 210Pb e 210Po, membros da série de decaimento do 238U, e os radionuclídeos 232Th e 228Ra membros da série de decaimento do 232Th nas variedades Burley e Virginia, as quais são as mais cultivadas no Brasil. Estes radionuclídeos naturais foram determinados em plantas adquiridas de produtores da região Sul do Brasil e também em plantas dessas mesmas variedades cultivadas em vasos com substrato orgânico e fertilizante com o objetivo de verificar prováveis influências dos fertilizantes e defensivos agrícolas usados pelos produtores na concentração dos radionuclídeos determinados. Os isótopos de U e Th, além do 210Po foram determinados por espectrometria alfa, após separação radioquímica e os radionuclídeos 226Ra, 228Ra e 210Pb pela medida alfa e beta total, também após separação radioquímica. Todas as partes da planta foram analisadas: raízes, caules e folhas, bem como os substratos orgânicos, fertilizantes e solos usados nos cultivos. Os isótopos de U e Th apresentaram resultados abaixo dos limites de detecção dos métodos para as folhas e caules de todas as plantas analisadas, apresentando resultados mensuráveis apenas nas raízes, solo e substrato. Os radionuclídeos 226Ra, 228Ra, 210Pb e 210Po foram determinados na grande maioria das partes das plantas, sendo os maiores valores obtidos para o 228Ra, o qual apresentou também o maior valor do fator de transferência. As plantas cultivadas no IPEN apresentaram valores inferiores de concentração dos radionuclídeos analisados quando comparados com as plantas cultivadas pelo produtor, pois estas foram cultivadas em potes com substrato orgânico e adição de fertilizante, cuja análise apresentou baixas concentrações dos radionuclídeos estudados. Baseados em dados da literatura nacional que estudou o fertilizante brasileiro, pode-se concluir, para as plantas do produtor, que o fertilizante exerce uma grande influência na concentração dos radionuclídeos estudados. / Brazil is the largest exporter and second largest producer of tobacco worldwide, according to the crop production of 2013/2014. The tobacco plant (Nicotiana tabacum L.) is used to manufacture all derivatives and the chemical composition of the resulting tobacco products varies with the type of tobacco leaves, how they are grown, the region where they are cultivated, the characteristics of preparation (compression, filter and paper) and the temperature variations resulting from the incomplete combustion of tobacco. Tobacco products are extensively used throughout the world, and the most consumed are cigarettes, cigars and narghile. The damaging effects that these products cause to human health are discussed globally, and many surveys are performed with the aim of relating the use of these products with various illnesses. There is a lack of information about the radiological characterization of the tobacco plant both in international and Brazilian literature. The objective of this study was to determine the concentration of radionuclides 238U, 234U, 230Th, 226Ra, 210Pb and 210Po, members from the 238U decay series, and the radionuclides 232Th and 228Ra members of the 232Th decay series in the varieties Burley and Virginia, which are the most cultivated in Brazil. Plants from these varieties were cultivated in pots with organic substrate and fertilizer and also acquired from the producers and analyzed by alpha spectrometry for U and Th isotopes and 210Po determination, and gross alpha and beta counting, 228Ra, 226Ra and 210Pb determination. The whole plant, from both places, was analyzed; root, stem, leaves, as well as the organic substrate, the fertilizers, and the soil. The results for U and Th isotopes presented values below the detection limits of the methods to the leaves and stems of all plants analyzed, with measurable results only in roots, soil, and substrate. The radionuclides 226Ra, 228Ra, 210Pb, and 210Po, were determined in most parts of the plants, with the highest values obtained for 228Ra, which also had the highest value of the transfer factor. Plants grown at IPEN showed lower concentration of radionuclides analyzed when compared with plants grown by the producer, as these were grown in pots with organic substrate and addition of fertilizer, whose analysis showed low concentrations of radionuclides studied. Based on data from national literature who studied the Brazilian fertilizer, it can be concluded, to the plants from the producer, the fertilizer has a great influence in the concentration of radionuclides studied.

O Brasil é o maior exportador e o segundo maior produtor de tabaco do mundo, de acordo com a safra de 2013/2014. A planta de tabaco (Nicotiana tabacum L.) é usada na fabricação de todos os derivados e a composição química do tabaco varia de acordo com o tipo de folha, como foram cultivadas, a região do plantio, as características da preparação (compressão, filtro e papel) e a variação de temperatura resultante da combustão incompleta do tabaco. Os derivados do tabaco são os produtos comercializados mais consumidos no mundo, como por exemplo, o cigarro, o charuto e o narguilé. Os efeitos danosos que estes produtos causam a saúde humana são há anos intensivamente discutidos e muitos estudos são realizados mundialmente relacionando o uso dos derivados do tabaco com diversas doenças. Existe pouca informação a respeito da caracterização radiológica da planta de tabaco na literatura internacional e nacional. O objetivo deste trabalho foi determinar a concentração dos radionuclídeos 238U, 234U, 230Th, 226Ra, 210Pb e 210Po, membros da série de decaimento do 238U, e os radionuclídeos 232Th e 228Ra membros da série de decaimento do 232Th nas variedades Burley e Virginia, as quais são as mais cultivadas no Brasil. Estes radionuclídeos naturais foram determinados em plantas adquiridas de produtores da região Sul do Brasil e também em plantas dessas mesmas variedades cultivadas em vasos com substrato orgânico e fertilizante com o objetivo de verificar prováveis influências dos fertilizantes e defensivos agrícolas usados pelos produtores na concentração dos radionuclídeos determinados. Os isótopos de U e Th, além do 210Po foram determinados por espectrometria alfa, após separação radioquímica e os radionuclídeos 226Ra, 228Ra e 210Pb pela medida alfa e beta total, também após separação radioquímica. Todas as partes da planta foram analisadas: raízes, caules e folhas, bem como os substratos orgânicos, fertilizantes e solos usados nos cultivos. Os isótopos de U e Th apresentaram resultados abaixo dos limites de detecção dos métodos para as folhas e caules de todas as plantas analisadas, apresentando resultados mensuráveis apenas nas raízes, solo e substrato. Os radionuclídeos 226Ra, 228Ra, 210Pb e 210Po foram determinados na grande maioria das partes das plantas, sendo os maiores valores obtidos para o 228Ra, o qual apresentou também o maior valor do fator de transferência. As plantas cultivadas no IPEN apresentaram valores inferiores de concentração dos radionuclídeos analisados quando comparados com as plantas cultivadas pelo produtor, pois estas foram cultivadas em potes com substrato orgânico e adição de fertilizante, cuja análise apresentou baixas concentrações dos radionuclídeos estudados. Baseados em dados da literatura nacional que estudou o fertilizante brasileiro, pode-se concluir, para as plantas do produtor, que o fertilizante exerce uma grande influência na concentração dos radionuclídeos estudados. / Brazil is the largest exporter and second largest producer of tobacco worldwide, according to the crop production of 2013/2014. The tobacco plant (Nicotiana tabacum L.) is used to manufacture all derivatives and the chemical composition of the resulting tobacco products varies with the type of tobacco leaves, how they are grown, the region where they are cultivated, the characteristics of preparation (compression, filter and paper) and the temperature variations resulting from the incomplete combustion of tobacco. Tobacco products are extensively used throughout the world, and the most consumed are cigarettes, cigars and narghile. The damaging effects that these products cause to human health are discussed globally, and many surveys are performed with the aim of relating the use of these products with various illnesses. There is a lack of information about the radiological characterization of the tobacco plant both in international and Brazilian literature. The objective of this study was to determine the concentration of radionuclides 238U, 234U, 230Th, 226Ra, 210Pb and 210Po, members from the 238U decay series, and the radionuclides 232Th and 228Ra members of the 232Th decay series in the varieties Burley and Virginia, which are the most cultivated in Brazil. Plants from these varieties were cultivated in pots with organic substrate and fertilizer and also acquired from the producers and analyzed by alpha spectrometry for U and Th isotopes and 210Po determination, and gross alpha and beta counting, 228Ra, 226Ra and 210Pb determination. The whole plant, from both places, was analyzed; root, stem, leaves, as well as the organic substrate, the fertilizers, and the soil. The results for U and Th isotopes presented values below the detection limits of the methods to the leaves and stems of all plants analyzed, with measurable results only in roots, soil, and substrate. The radionuclides 226Ra, 228Ra, 210Pb, and 210Po, were determined in most parts of the plants, with the highest values obtained for 228Ra, which also had the highest value of the transfer factor. Plants grown at IPEN showed lower concentration of radionuclides analyzed when compared with plants grown by the producer, as these were grown in pots with organic substrate and addition of fertilizer, whose analysis showed low concentrations of radionuclides studied. Based on data from national literature who studied the Brazilian fertilizer, it can be concluded, to the plants from the producer, the fertilizer has a great influence in the concentration of radionuclides studied.