PII-Proteine, zu denen GlnB und GlnK zählen, sind ubiquitär verbreitete kleine Regulatorproteine, die den internen Stickstoffzustand der Zelle sensieren und weiterleiten und hierdurch maßgeblich an der Regulation des Stickstoffmetabolismus beteiligt sind.Ziel dieser Arbeit war es, das GlnK1-Protein aus dem methanogenen Archeaon Methanosarcina mazei Stamm Gö1 umfassend zu charakterisieren und seine potentielle Rolle in der Regulation des Stickstoffmetabolismus aufzuklären. Das M. mazei GlnK1-Protein weist den typischen Tyrosin51-Rest auf, der in Bakterien stickstoffabhängig posttranslationell modifiziert wird. Sowohl in vitro als auch in vivo Experimente haben jedoch gezeigt, dass GlnK1 in M. mazei nicht stickstoffabhängig modifiziert wird. Weitere strukturelle Unterschiede zu bakteriellen PII-Proteinen haben Experimente zur Bildung von Heterotrimeren aufgezeigt. Trotz dieser deutlichen Unterschiede haben Komplementationsversuche ergeben, dass das archaeelle GlnK-Protein in der Lage ist, E. coli GlnK funktionell zu komplementieren. Dieses läßt darauf schließen, dass das GlnK1-Protein in M. mazei auch in der Regulation des Stickstoffmetabolismus involviert ist. Um dieses zu bestätigen, wurde eine chromosomale M. mazei glnK1-Mutante generiert. Hierfür war es erforderlich, zunächst ein funktionelles System zur Transformation von M. mazei Gö1 zu entwickeln. Es gelang, (i) durch Selektion einer potentiellen spontanen Zellwandmutante von M. mazei, die eine stark verbesserte Plattierungseffizienz aufwies, sowie (ii) durch mehrere Modifizierungen des von W. Metcalf (Urbana) entwickelten Liposomen-vermittelten Transformationsprotokolls für Methanosarcina-Stämme M. mazei Gö1 genetisch zugänglich zu machen. Wachstumsanalysen des konstruierten M. mazei glnK1-Mutantenstamms zeigten einen partiell reduzierten Wachstumsphänotyp unter stickstofflimitierenden Bedingungen. Quantitative Reverse Transkriptions-PCR Analysen ausgewählter Gene ergaben allerdings, dass das GlnK1 keinen Einfluss auf die Transkription stickstoffregulierter Gene ausübt.Sowohl biochemische Experimente mit gereinigtem Enzym als auch in vivo Versuche zeigten jedoch, dass das GlnK1-Protein mit der Glutamin-Synthetase (GlnA) interagiert und hierdurch deren Enzymaktivität inhibiert. Ein aktivierender Effekt auf die GlnA Enzymaktivität wurde hingegen bei Anwesenheit von 2-Oxoglutarat beobachtet, welches den internen Stickstoffstatus wiederspiegelt. Aus der Gesamtheit der Ergebnisse läßt sich folgendes hypothetisches Regulationsmodel ableiten: Unter Stickstofflimitierung wird 2-Oxoglutarat akkumuliert, welches die Glutamine-Synthetase Aktivität stark stimuliert; bei einem Übergang zu Stickstoffüberschuss wird die Glutamine-Synthetase sowohl durch einen reduzierten 2-Oxoglutarat-Spiegel als auch durch direkte Protein-Interaktion mit GlnK1 inaktiviert. Letzteres dient der Feinregulation und ermöglicht schnell auf eine veränderte Stickstoffversorgung reagieren zu können.

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Os genes ntrB e ntrC codificam, respectivamente, a histidina quinase (HK) e o regulador de respostas (RR), pertencentes a um sistema de dois componentes (TCSs), que atuam no sistema regulador de nitrogênio (NTR). Porém, o possível papel desses genes na virulência da XccA e de outros fitopatógenos ainda não foi elucidado. Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos dos genes ntrB e ntrC no desenvolvimento do cancro cítrico em limão-cravo (Citrus limonia Osbeck), bem como a possível relação desses genes com a regulação da expressão de genes do sistema de secreção tipo 3 (SST3), considerado um dos principais fatores de virulência da XccA. Os mutantes ΔntrB e ΔntrC foram obtidos pela técnica de mutagênese sítio-dirigida por reação em cadeia da polimerase de extensão por sobreposição. A mutação dos genes causou redução na sintomatologia do cancro cítrico e diminuição da população bacteriana no espaço intercelular do tecido foliar da planta. A análise das curvas de crescimento in vitro revelou que a ausência do gene ntrB não alterou a viabilidade da bactéria, enquanto a mutação do gene ntrC afetou o “fitness” bacteriano em meio de cultura NB. Análises in vitro indicaram que o mutante ΔntrC formou duas vezes mais biofilme e produziu cinco vezes mais goma xantana do que a XccA 306 in vitro. A expressão dos genes (hpa1, hrpG, hrpX, hrpE, hrpW e hrpD6) do SST3 avaliados foi significativamente maior (p < 0,05) no mutante ΔntrC do que na XccA 306 e no ΔntrB, indicando que ntrC possa atuar na regulação do SST3. Porém, o nível de expressão desses genes no mutante ΔntrB não apresentou diferença significativa (p > 0,05) em relação à XccA 306. A modelagem molecular revelou semelhança estrutural entre as regiões receptoras de NtrC e HrpG, sugerindo que a fosforilação de HrpG por NtrB possa ocorrer in vivo. Em síntese, os resultados obtidos neste estudo indicam que a mutação dos genes ntrB e ntrC afeta o desenvolvimento do cancro cítrico em limão-cravo e que o gene ntrC pode atuar na regulação dos mecanismos de formação de biofilme, produção de goma xantana e expressão de genes do SST3 e/ou que a ausência desse gene ocasione um desequilíbrio celular na XccA 306, resultando na alteração desses mecanismos, enquanto NtrB pode apresentar papel na regulação de genes do SST3 por meio da fosforilação de HrpG. / The citrus canker type A, provoked by the bacterium Xanthomonas citri subsp. citri (XccA), is one of themost important citrus diseases, affecting all the commercial cultivars, for which there are no effective control strategies. The ntrB and ntrC genes encode a histidine kinase (HK) and the response regulator (RR), respectively, belong to a two-component system (TCSs), related to the nitrogen regulatory system (NTR). However, the possible role of ntrB and ntrC genes in the virulence of XccA and other phytopathogens has not yet been elucidated. Therefore, the aim of this study was to investigate the impact of the ntrB and ntrC genes on the development of citrus canker in rangpur lime (Citrus limonia Osbeck), as well as the possible relation of ntrB and ntrC genes with the regulation of the type 3 secretion system (T3SS) gene expression, which is considered one of the main virulence factors of XccA. The ΔntrB and ΔntrC were obtained by site-directed mutagenesis through overlap extension polymerase chain reaction. The mutation of the ntrB and ntrC genes caused a reduction of the citrus canker symptoms, and decrease of the bacterial population in the intracellular space of the foliar tissue of the plant. In vitro growth curves analysis revealed that the ΔntrB did not affect the viability of the bacterium, whereas the ΔntrC affected the bacterial fitness in NB culture medium. In vitro analysis indicated that the ΔntrC formed 2x more biofilm, and produced 5x xanthan gum compared to the XccA 306. The T3SS related genes (hpa1, hrpG, hrpX, hrpE, hrpW and hrpD6) expression was significantly higher (p <0.05) in the ΔntrC than in the XccA 306 and the ΔntrB, indicating that ntrC can modulate the regulation of T3SS. However, the level of expression of these genes in the ΔntrB did not differ (p> 0.05) in relation to the XccA 306. Molecular modeling revealed structural similarity between NtrC and HrpG receptors motifs, suggesting that phosphorylation of HrpG by NtrB may occur in vivo. Overall, the results obtained in this study strongly suggest that the mutation of the ntrB and ntrC genes affect the development of rangpur lime citrus canker and that ntrC gene may play an important role in the regulation of the mechanisms of biofilm formation, xanthan gum production and T3SS gene expression and/or that the absence of this gene causes a cellular imbalance in XccA 306 resulting in the alteration of these mechanism, whereas the NtrB may have a role with the regulation of T3SS genes by phosphorylation of HrpG. / 3385/2013