京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(薬学) / 甲第18553号 / 薬博第815号 / 新制||薬||238(附属図書館) / 31453 / 京都大学大学院薬学研究科生命薬科学専攻 / (主査)教授 中山 和久, 教授 竹島 浩, 教授 根岸 学 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Pharmaceutical Sciences / Kyoto University / DFAM

Glioblastome représente la tumeur la plus courante du cerveau primaire avec une survie de moins de 2 ans. Ces tumeurs sont très infiltrantes et angiogéniques et contiennent une sous population de cellules souches cancéreuses. Nkx2.2 est un homéodomaine facteur de transcription, impliqué dans la formation d'oligodendrocytes au cours du développement. Nkx2.2 joue un rôle central dans la tumorogenèse de Ewing'sarcoma. L'utilisation de la QPCR et de la matrice du tissu de gliome, nous a permis de mettre en évidence la forte expression de Nkx2 dans le glioblastome. Nkx2.2 a également été détecté dans 3 cultures de cellules de gliomes où il est co-exprimé avec des marqueurs de cellules souches tels que CD133 et CD15. Il a été récemment proposé que la surexpression de Nkx2.2 pourrait induire à la différenciation oligodendrocytaire de la cellule du gliome tige-comme et au blocage de la formation des tumeurs dans la xénotransplantation (Cancer Res fév 2011 1; 71 (3): 1135-1145). Pour explorer cette possibilité, nous avons utilisé des rétrovirus pour surexprimer Nkx2.2 dans nos cultures cellulaires. De manière surprenante, nous avons trouvé que Nkx2.2, induit la prolifération des cellules souches du gliome et n'a en conséquent aucun effet de différenciation. Microarray analyses a confirmé que la surexpression de Nkx2.2 n'a en effet aucune influence sur la différenciation des oligodendrocytes. Cette analyse a également révélé que Nkx2.2 était capable d'induire une forte expression de YKL-40 40 dans le surnageant des cellules souches du gliome. YKL-40 est en fait, une glycoprotéine sécrétée et impliquée dans l'inflammation, l'angiogenèse et la prolifération. Elle est souvent associée à un mauvais pronostic dans plusieurs types de cancers. En outre, nous avons effectué une transplantation orthotopique afin d'explorer le rôle de Nkx2.2 dans la gliomagenèse in vivo et avons constaté que Nkx2.2 ne réduit pas l'agressivité du glioblastome.Dans l'autre partie de ma thèse, nous avons utilisé la gamme Taqman à basse densité et la validation des miRNA par la Qpcr afin de chercher ces derniers dans la culture cellulaire du glioblastome humain. Nous avons ensuite étudié le rôle des miARN dans la transcription de 3'UTR de Nkx2.2. Les résultats d'analyse de la mutagénèse dirigée (SDM) et de la double-luciférase ont montré que l'expression de Nkx2.2 est régulée par la diminution de mir-133b ainsi que celle de mir-202. / Glioblastoma represent the most common primary brain tumor with an overall survival of less than 2 years. These tumors are highly infiltrative and angiogenic and contain a sub population of cancer stem cells. Nkx2.2 is a homeodomain transcription factor which is implicated in the formation of oligodendrocytes during development. Nkx2.2 is central in tumorogenesis of Ewing'sarcoma. Using QPCR and glioma tissue array, we found that Nkx2.2 is highly expressed in glioblastoma. Nkx2.2 was also detected in 3 glioma stem-like cell cultures (neurospheres) where it is co-expressed with stem cell markers such as CD133 and CD15. It was recently proposed that overexpression of Nkx2.2 could induce terminal oligodendrocytic differentiation of glioma stem-like cell and inhibit tumor formation in xenotransplantation (Cancer Res. 2011 Feb 1;71(3):1135-45).To explore this possibility further, we used retroviruses to overexpress Nkx2.2 in our cell cultures. Surprisingly, we found that Nkx2.2, induce glioma stem cell proliferation and had no oligodendrocyte differentiating effect. Microarray analyses confirmed that Nkx2.2 overexpression had no influence in oligodendrocyte differentiation. This analysis further revealed that Nkx2.2 was able to induce a strong expression of YKL40 protein in the supernatant of glioma stem cells and increase YKL-40 promoter activity. YKL-40 is a secreted glycoprotein which is involved in inflammation, angiogenesis and proliferation and which is often associated with a bad prognosis in several cancers. In addition, we performed orthotopic transplantation to explore the role of Nkx2.2 in gliomagenesis in vivo and found that Nkx2.2 did not reduce the aggressiveness of glioblastoma. In the other part of my thesis we used Taqman low-density arrays (TLDA) and individual miRNA QPCR validation to find the microRNA (miRNA) signature in human glioblastoma cell cultures. Then we investigated the role of miRNA in the 3'UTR of Nkx2.2 transcript. Site directed mutagenesis (SDM) and dual-Luciferase reporter assay results showed that the Nkx2.2 expression is downregulated by mir-133b and mir-202.

Les Glioblastomes (Gb) sont des tumeurs primaires du SNC les plus fréquentes et sont particulièrement agressives car résistantes à la radio/chimiothérapie. Elles présentent généralement une composante solide et infiltrante. Cette dernière étant difficile à éliminer par la chirurgie sera en partie responsable de la récurrence de la tumeur. Une des avancées majeures du domaine est la mise en évidence dans les Gb de sous populations présentant des caractéristiques de précurseurs neuraux. Ces cellules cancéreuses utilisent des réseaux de gènes spécifiques pour maintenir leur prolifération et leur état indifférencié. Une approche possible pour éliminer ces cellules cancéreuses serait de cibler les facteurs de transcription impliqués dans la prolifération ou encore de forcer leur différenciation. Dans ce but, j'ai étudié le rôle de NKX2.2 et NGN2 à partir de 3 cultures primaires multipotentes. Les résultats montrent que l'expression de NKX2.2 dans ces cultures est nécessaire pour la survie, la prolifération et la capacité à former des neurosphères. A l'inverse, la surexpression de NGN2 conduit à une apoptose massive, à un arrêt de la prolifération avec formation de neurones dont certains sont électrophysiologiquement actifs. Une approche différente consisterait à cibler une des protéines impliquées dans la migration pour limiter la composante infiltrante. Des études antérieures ont montrées un rôle clef de DCX dans la migration des jeunes neurones au cours du développement. La forte expression de DCX dans certains Gb m'a conduit à étudier la régulation et le rôle de ce gène. In vitro, les résultats obtenus montrent que DCX est exprimé par une sous population de cellules. La purification des cellules Dcx+ ainsi qu'une étude clonale a permis de montrer qu'elles se comportent comme des progéniteurs multipotents avec une capacité d'autorenouvellement restreinte. Par ailleurs, j'ai montré que les cellules Dcx+ peuvent réverter vers un état Dcx- et que le gène Dcx est régulé par les voies NOTCH et SHH. / Glioblastomas (GB) are the most common primary tumors of the CNS and are particularly resistant to radio/chemotherapy. They generally have a solid and infiltrative component. The latter being difficult to remove by surgery will be partly responsible for tumor recurrence. One of the major advances in the field is highlighted in the Gb of subpopulations with features of neural precursors. Cancer cells use specific gene networks to maintain their proliferation and undifferentiated state. One approach to eliminate these cancer cells would be to target transcription factors involved in the proliferation or to force their differentiation. To this end, I studied the role of NKX2.2 and NGN2 from 3 primary multipotent cultures. The results show that NKX2.2 expression in these cultures is necessary for survival, proliferation and ability to form neurospheres. Conversely, overexpression of NGN2 led to massive apoptosis, proliferation arrest with formation of neurons, some of which are electrophysiologically active. A different approach would be to target proteins involved in migration to limit the invasive component. Previous studies have shown a key role of DCX in the migration of young neurons during development. The strong expression of DCX in some Gb led me to study the regulation and the role of this gene. In vitro, the results show that DCX is expressed by a subpopulation of cells. Purification of Dcx+ cells and clonal study has shown that they behave as multipotent progenitors with limited self-renewal capacity. I also found that Dcx+ cells can revert back to a Dcx- state and that DCX is regulated by SHH and NOTCH pathways.