Colorectal cancer is the third leading cause of cancer-related mortality. Much progress has been achieved in combating this disease with surgical resection and chemotherapy in combination with targeted drugs. However, most metastatic patients develop drug resistance so new modalities of treatment are needed. Notch signaling plays a vital role in intestinal homeostasis, self-renewal, and cell fate decisions during post-development and is activated in colorectal adenocarcinomas. Under debate is its role in carcinomas and metastatic disease. In theory, blocking Notch activation using gamma-secretase inhibitors (GSIs) may show efficacy alone or in combination with chemotherapy in the treatment of colon cancer. In Chapter Three, we tested the capacity for GSIs to synergize with oxaliplatin in colon cancer cell lines and evaluated the underlying molecular mechanisms. GSI alone had no effect on colon cancer cell lines. Surprisingly, we show that GSIs blocked oxaliplatin-induced apoptosis through increased protein levels of the anti-apoptotic Bcl-2 proteins Mcl-1 and/or Bcl-xL. Restoration of apoptosis was achieved by blocking Mcl-1 and/or Bcl-xL with obatoclax (an anti-apoptotic Bcl-2 agonist) or siRNA. An unexpected result was the induction of cell death with the combination of GSI and obatoclax. In Chapter Four, we examined the mechanism of GSI + obatoclax-mediated cell death. We found that apoptosis played a minimal role. Rather, we identified blockage of cytoprotective autophagy played a causative role. Interestingly, we also saw autophagy induction in GSI-treated cells, which could explain the insensitivity of colon cancer cells to GSI. When autophagy was blocked in GSI-treated cells, cells became sensitive to GSI and cell death was elicited. The mechanism by which induction of autophagy occurs in GSI- treated cells is an area for further research. Overall, our work questions the validity of the use of GSIs in the treatment of colorectal cancers. We show that GSIs may block apoptosis and induce cytoprotective autophagy simultaneously, resulting in increased drug resistance and cellular survival. Whether these two cellular survival processes occurs in patients needs to be examined before GSIs can be utilized in a clinical setting. If so, these two hurdles must be overcome.

Le neuroblastome (NB) est la tumeur solide extracranienne la plus fréquente chez le jeune enfant. En dépit de plusieurs avancements thérapeutiques, seulement 60% survivront à long terme. Cette résistance aux traitements est possiblement due, en partie, à la présence des cellules souches cancéreuses (CSC). PARP-1 joue un rôle important dans la chimiorésistance de certaines tumeurs et son inhibition a montré une potentialisation des agents anticancéreux conventionnels. De plus, Bcl-2 est surexprimé dans le NB et son expression accrue contribuerait à la résistance à la chimiothérapie. Le but de notre travail était de déterminer les effets in vitro d’un PARP inhibiteur, AG-014699 (AG), et d’un inhibiteur de Bcl-2, Obatoclax (Obx), in vitro et in vivo, en monothérapie ou en combinaison avec de la Doxorubicine (Doxo) ou du Cisplatin (Cis), deux agents anticancéreux classiquement utilisés dans le traitement du NB. Afin de déterminer l’expression de PARP-1 dans les tumeurs de NB, nous avons analysé une cohorte de 132 tumeurs. Nous avons utilisé le test MTT afin d’évaluer la sensibilité de 6 lignées cellulaires de NB et des CSC à un traitement avec AG seul ou en combinaison avec de la Doxo ou du Cis. Nous avons déterminé l’étendue de la mort cellulaire par Annexin-V et caractérisé les dommages à l’ADN à l’aide d’un marquage γH2aX. De plus, les modulations des voies de signalisation intracellulaire ont été analysées par Western Blot. La sensibilité des cellules à l’Obx a été analysée par MTT sur 6 lignées cellulaires de NB et sa combinaison avec le Cis a également été déterminée dans 2 lignées cellulaires. Le marquage Annexin-V et des combinaisons avec ZVAD-FMK ont aussi été utilisés pour caractériser les effets d’Obx sur l’apoptose. Des expériences in vivo ont également été faites. Nos résultats démontrent que l’expression de PARP-1 est associée aux tumeurs moins agressives. AG n’a peu ou pas effet sur la croissance tumorale et ne potentialise pas significativement les effets de la Doxo ou de Cis. AG combiné à la Doxo semble sensibiliser les CSC dans une lignée cellulaire. L’Annexin-V et le marquage γH2aX ne révèlent pas d’effets synergiques de cette combinaison et les dommages à l’ADN et la mort cellulaire observés sont attribués à la Doxo. Cependant, on observe une augmentation d’apoptose et de bris d’ADN dans une lignée cellulaire (SK-N-FI) lorsqu’AG est utilisé en monothérapie. On observe une surexpression de pAKT et pERK suite à la combinaison Doxo et AG. Les cellules de NB sont sensibles à l’Obx à des concentrations à l’échelle nanomolaire. De plus, Obx active la mort cellulaire par apoptose. Aussi, Obx a un effet synergique avec le Cis in vitro. In vivo, l’Obx diminue significativement la taille tumorale. Nous concluons que l’Obx présente une avenue thérapeutique prometteuse dans le traitement du NB alors que l’utilisation d’AG ne semble pas être aussi encourageante. / Neuroblastoma (NB) is the most common extracranial solid tumour of childhood. In spite of many therapeutic improvements, only 60% survive long term. Presence of cancer stem cell (CSCs) is thought to mediate such resistance. PARP-1 plays an important role in the chemoresistance of certain tumours and its inhibition is shown to potentiate cells to routinely used anticancer agents. Moreover, Bcl-2 is over-expressed in NB and that its increased expression would contribute to chemotherapy resistance. Our goal was to determine the efficacy in vitro of a PARP inhibitor, AG-014699 (AG), and a Bcl-2 inhibitor, Obatoclax (Obx), in vitro and in vivo, in monotherapy or in combination to Doxorubicine (Doxo) and Cisplatine (Cis), classical chemotherapeutic agents used in NB treatment. In order to determine PARP-1 expression in NB tumours, 132 tumours were analyzed. We used an MTT test to evaluate 6 NB cell line and CSC sensitivity to AG alone or in combination to Doxo and Cis. We investigated the extent of cell death by Annexin-V and determined the degree of DNA damage by γH2aX staining. Also, signalling pathway modulations were analyzed by Western Blots. Obx sensitivity was determined by MTT test on 6 NB cell lines and its combination to Cis was also examined in 2 NB cell lines. Annexin-V and combinations to ZVAD-FMK also evaluated its effect on apoptosis. In vivo experiments were also done. Our results show that PARP-1 is associated to less aggressive tumors. AG has little to no effect on tumour growth when used alone and does not potentiate the effects of Doxo and Cis although more experiments will be needed. AG combined to Doxo seems to sensitize CSC in one cell line. Annexin-V and γH2aX staining reveal no effects of AG combination and Doxo mostly confers all cell damage and death. However, we do observe an increase in DNA damage and apoptosis in one cell line (SK-N-FI) when AG is used in monotherapy. pAKT and pERK are upregulated by Doxo and AG combination. NB cells are sensitized to Obx at nanomolar concentrations. Also, Obx activates apoptotic cell death. Moreover, Obx synergizes with Cis in vitro. In vivo, Obx significantly decreases tumor size. We conclude that Obx seems like a promising therapeutic approach in NB treatment whilst AG does not look so encouraging.

Le neuroblastome (NB) est la tumeur solide extracranienne la plus fréquente chez le jeune enfant. En dépit de plusieurs avancements thérapeutiques, seulement 60% survivront à long terme. Cette résistance aux traitements est possiblement due, en partie, à la présence des cellules souches cancéreuses (CSC). PARP-1 joue un rôle important dans la chimiorésistance de certaines tumeurs et son inhibition a montré une potentialisation des agents anticancéreux conventionnels. De plus, Bcl-2 est surexprimé dans le NB et son expression accrue contribuerait à la résistance à la chimiothérapie. Le but de notre travail était de déterminer les effets in vitro d’un PARP inhibiteur, AG-014699 (AG), et d’un inhibiteur de Bcl-2, Obatoclax (Obx), in vitro et in vivo, en monothérapie ou en combinaison avec de la Doxorubicine (Doxo) ou du Cisplatin (Cis), deux agents anticancéreux classiquement utilisés dans le traitement du NB. Afin de déterminer l’expression de PARP-1 dans les tumeurs de NB, nous avons analysé une cohorte de 132 tumeurs. Nous avons utilisé le test MTT afin d’évaluer la sensibilité de 6 lignées cellulaires de NB et des CSC à un traitement avec AG seul ou en combinaison avec de la Doxo ou du Cis. Nous avons déterminé l’étendue de la mort cellulaire par Annexin-V et caractérisé les dommages à l’ADN à l’aide d’un marquage γH2aX. De plus, les modulations des voies de signalisation intracellulaire ont été analysées par Western Blot. La sensibilité des cellules à l’Obx a été analysée par MTT sur 6 lignées cellulaires de NB et sa combinaison avec le Cis a également été déterminée dans 2 lignées cellulaires. Le marquage Annexin-V et des combinaisons avec ZVAD-FMK ont aussi été utilisés pour caractériser les effets d’Obx sur l’apoptose. Des expériences in vivo ont également été faites. Nos résultats démontrent que l’expression de PARP-1 est associée aux tumeurs moins agressives. AG n’a peu ou pas effet sur la croissance tumorale et ne potentialise pas significativement les effets de la Doxo ou de Cis. AG combiné à la Doxo semble sensibiliser les CSC dans une lignée cellulaire. L’Annexin-V et le marquage γH2aX ne révèlent pas d’effets synergiques de cette combinaison et les dommages à l’ADN et la mort cellulaire observés sont attribués à la Doxo. Cependant, on observe une augmentation d’apoptose et de bris d’ADN dans une lignée cellulaire (SK-N-FI) lorsqu’AG est utilisé en monothérapie. On observe une surexpression de pAKT et pERK suite à la combinaison Doxo et AG. Les cellules de NB sont sensibles à l’Obx à des concentrations à l’échelle nanomolaire. De plus, Obx active la mort cellulaire par apoptose. Aussi, Obx a un effet synergique avec le Cis in vitro. In vivo, l’Obx diminue significativement la taille tumorale. Nous concluons que l’Obx présente une avenue thérapeutique prometteuse dans le traitement du NB alors que l’utilisation d’AG ne semble pas être aussi encourageante. / Neuroblastoma (NB) is the most common extracranial solid tumour of childhood. In spite of many therapeutic improvements, only 60% survive long term. Presence of cancer stem cell (CSCs) is thought to mediate such resistance. PARP-1 plays an important role in the chemoresistance of certain tumours and its inhibition is shown to potentiate cells to routinely used anticancer agents. Moreover, Bcl-2 is over-expressed in NB and that its increased expression would contribute to chemotherapy resistance. Our goal was to determine the efficacy in vitro of a PARP inhibitor, AG-014699 (AG), and a Bcl-2 inhibitor, Obatoclax (Obx), in vitro and in vivo, in monotherapy or in combination to Doxorubicine (Doxo) and Cisplatine (Cis), classical chemotherapeutic agents used in NB treatment. In order to determine PARP-1 expression in NB tumours, 132 tumours were analyzed. We used an MTT test to evaluate 6 NB cell line and CSC sensitivity to AG alone or in combination to Doxo and Cis. We investigated the extent of cell death by Annexin-V and determined the degree of DNA damage by γH2aX staining. Also, signalling pathway modulations were analyzed by Western Blots. Obx sensitivity was determined by MTT test on 6 NB cell lines and its combination to Cis was also examined in 2 NB cell lines. Annexin-V and combinations to ZVAD-FMK also evaluated its effect on apoptosis. In vivo experiments were also done. Our results show that PARP-1 is associated to less aggressive tumors. AG has little to no effect on tumour growth when used alone and does not potentiate the effects of Doxo and Cis although more experiments will be needed. AG combined to Doxo seems to sensitize CSC in one cell line. Annexin-V and γH2aX staining reveal no effects of AG combination and Doxo mostly confers all cell damage and death. However, we do observe an increase in DNA damage and apoptosis in one cell line (SK-N-FI) when AG is used in monotherapy. pAKT and pERK are upregulated by Doxo and AG combination. NB cells are sensitized to Obx at nanomolar concentrations. Also, Obx activates apoptotic cell death. Moreover, Obx synergizes with Cis in vitro. In vivo, Obx significantly decreases tumor size. We conclude that Obx seems like a promising therapeutic approach in NB treatment whilst AG does not look so encouraging.

The presented doctoral thesis is focused on the role of the Hedgehog (HH) signaling pathway in cancer pathogenesis. HH signaling pathway is an evolutionarily conserved signaling pathway that plays an essential role in embryonic development. Its activity is strictly limited to stem and progenitor cells for example in brain, lung, skin or prostate. HH pathway also plays a key role in tissue homeostasis and regeneration. Aberrantly activated HH pathway is essential in cancer progression. The aim of the presented thesis was to elucidate new details about the HH signaling pathway. We identified a new target gene of the HH pathway - the anti-apoptotic protein survivin. Survivin is considered to be an important tumor marker associated with a poor prognosis of patients. We showed that the inhibitor of HH pathway effectors GLI1 and GLI2 GANT61 reduced the survivin level in cancer cells. Subsequently, we used GANT61 and the inhibitor of the anti-apoptotic BCL2 protein family obatoclax to inhibit melanoma cells growth. We showed that the combination of these inhibitors was very effective in the eradication of melanoma cells in vitro. We also proved that GANT61 triggers the process of apoptosis in melanoma cells. We found out that the HH signaling pathway is canonically activated in many cell lines of various...