Universiẗat, Diss., 2004--Mainz.

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Two enzymatic systems from the lactic acid bacterium Oenococcus oeni, isolated from wine, have been studied. The first one is the H+-ATPase for which the activity was characterized under various conditions of growth. The activity gradually increased by l.6 to 1.9-fold upon inoculation at pH 3.5. The H+-ATPase activity did not vary significantly in function of the growth rate or with and without malic acid. However, acidification of the medium in the absence of malic acid induced the activity by 1.5 to 2.2-fold depending on the initial pH. The partially cloned H+-ATPase genes shared high homologies with those from other bacterial F0F1-ATPases. A mRNA of about 7 kb was detected by Northern blot and its size suggests that the genetic organization of O. oeni atp operon is similar to most F0F 1-ATPases. Furthermore, the amount of atp mRNA was shown to increase in acidic conditions. O. oeni H +-ATPase activity was pH-inducible and regulation of the expression seems to occur at the level of mRNA synthesis. Thus, the results confirmed the proposed role of the H+-ATPase in acid tolerance in O. oeni. / The second system studied was a chromosome-encoded P-type ATPase (CopB) and its putative transcriptional regulator (CopR). The copB gene encodes a protein showing great similarities with other Cu2+-ATPases of the CPx-type family of heavy-metal ATPases like Enterococcus hirae copB. Another gene (copR) was found 250 bp upstream of copB and displays great similarities with proteins of the MecI/BlaI family of transcriptional regulators, including En. hirae CopY repressor. O. oeni was shown to be highly resistant to copper and growth occurred in up to 30 mM CuSO4. Northern blot analyses indicated that the amount of copB mRNA increased upon a 0.2 to 4.0 mM copper stress suggesting that expression of the enzyme might be regulated at the level of mRNA synthesis. Whether CopR is involved in this regulation remains to be determined, but the results suggest that copRB genes might be involved in copper resistance in O. oeni.

La faisabilité d'un réacteur à enzyme malolactique pour effectuer et contrôler la fermentation malolactique (FML) des vins est étudiée. Des bactéries lactiques du vin, <i>Leuconostoc oenos</I> 84-06, sont cultivées en fermenteur de 10 litres, sur un milieu induisant la. fabrication de l'enzyme malolactique. La production d'enzyme est de 0,5 à 0,7 U/ml de milieu de culture, en 60 heures. L'enzyme malolactique est extraite par désintégration des bactéries aux ultrasons. Après action de la DNase 1 et précipitations au sulfate d'ammonium à 35% puis à 70%, l'extrait est filtré sur une colonne de chromatographie d'ultrogel AcA 34. L'enzyme obtenue a une activité spécifique de 8,9 U/mg ; elle a été purifiée à 3,3 fois avec un rendement de 75%. Sa masse moléculaire relative est d'environ 132 000, son point isoélectrique se situe à pH 4,35 et son pH optimum d'activité est de 5,5. Cette enzyme est utilisée pour fabriquer le réacteur (demande de brevet Français No 13131, déposée le 16 octobre 1990). Il s'agit d'un module d'ultrafiltration en fibres creuses de polyamide composé de deux circuits. Dans le circuit interne, le NAD est fixé et l'enzyme circule librement dans un milieu à pH 6 (milieu synthétique ou vin). Le milieu à traiter (milieu synthétique ou vin à pH 3) circule dans le circuit externe. Après passage dans le réacteur d'un milieu synthétique, le rendement de la FML est de 80% à 95% pendant 3 jours. Avec le vin, le rendement est de 50% à 60%. Nous avons montré que la FML des vins est maintenant techniquement réalisable avec un réacteur à enzyme malolactique et NAD. Il faut optimiser chaque étape de façon à pouvoir appliquer cette technique à la FML en continu pour de plus grandes quantités de vin.