Utilitzant un mètode de síntesi prèviament desenvolupat s'han obtingut una sèrie d'oligodesoxiribonucleòtids cíclics de seqüència complementària al mRNA de la dihidrofolat reductasa (DHFR). Els oligonucleòtids cíclics sintetitzats han mostrat activitat citotòxica sobre cèl·lules de hàmster xinès, presumiblement per un mecanisme antisentit que implica la inhibició de l'expressió de la DHFR. La mida de l'oligonucleòtid cíclic influeix en la seva activitat citotòxica i per a tots ells existeix una concentració a la que l'activitat és més gran. L'activitat dels oligonucleòtids cíclics, que és menor que la dels oligonucleòtids lineals amb unions internucleosídiques de tipus fosforotioat, i és molt major que la dels lineals que contenen unions naturals fosfodiester, és atribuïble al seu caràcter cíclic i a la conseqüent resistència front a les exonucleases.Per a possibilitar l'obtenció d'oligonucleòtids cíclics que també siguin resistents a l'acció de les endonucleases, s'ha comprovat que la metodologia general de síntesi és aplicable a l'obtenció d'oligonucleòtids cíclics amb unions internucleosídiques fosforotioat en totes les posicions, excepte en la que uneix l'oligòmer al suport sòlid en el precursor lineal.D'altra banda, s'ha desenvolupat un esquema de síntesi per a, a partir de 5-bromouracil i en 8 etapes, obtenir dos nous monòmers d'àcid nucleic peptídic que incorporen com a nucleobase modificada a anàlegs de citosina, anomenats abraçadores de guanina. Aquests són potencialment capaços de formar fins a quatre i cinc enllaços d'hidrogen amb una guanina d'una seqüència complementària.L'elaboració de l'anell de fenoxazina de les abraçadores de guanina té com a etapa clau la incorporació del 2-aminoresorcinol en la posició 4 de l'uracil. Per a això, es parteix del N1-tert-butoxicarbonilmetil derivat del 5-bromouracil i s'activa la posició 4 del 5-bromouracil en forma de triazole derivat per a la substitució nucleòfila amb el 2-aminoresorcinol.En l'esquema desenvolupat, la ciclació de l'aminoresorcinol derivat del 5-bromouracil per a formar la fenoxazina i la incorporació dels apèndixs de 2-etanolamina i 2-hidroxietilguanidina, condueix a millors resultats si es duu a terme en aquest ordre degut a que els esquemes de síntesi de les dues abraçadores tenen un intermedi més comú i els rendiments globals són superiors. S'ha dut a terme la síntesi en fase sòlida mitjançant l'estratègia Fmoc/Bhoc d'una sèrie de decàmers de PNA, uns que contenen únicament nucleobases naturals i uns altres en els que alguna citosina de les anteriors seqüències ha estat substituïda per abraçadores de guanina. En els acoblaments dels monòmers s'ha emprant HATU com a agent activant i han tingut lloc amb rendiments entre el 95 i el 98% per als que contenen nucleobases naturals i lleugerament inferiors (aproximadament del 90%) per als monòmers modificats amb les abraçadores. Per primer cop s'ha posat a punt la utilització de l'energia de microones per a activar les reaccions d'acoblament en la síntesi de PNA. La qualitat dels productes crus de síntesis de PNA és millor que quan les reaccions es realitzen a temperatura ambient. Finalment, per tal d'avaluar l'afinitat dels decàmers de PNA sintetitzats per les seves seqüències de DNA complementàries s'han enregistrat les corbes de fusió per espectroscòpia d'UV dels corresponents dúplexs PNA-DNA a partir de les quals s'han determinat les temperatures de fusió, TM.Per als PNAs que contenen únicament nucleobases naturals s'ha observat una bona correlació lineal entre les temperatures de fusió i el nombre de parells de bases G-C del dúplex.La substitució en els PNAs d'alguna citosina per abraçadores de guanina, tant si contenen un grup amino com un grup guanidino, produeix una pronunciada desestabilització dels corresponents dúplexs. S'interpreta que la capacitat de les abraçadores de guanina per a estabilitzar dúplexs PNA-DNA és enormement dependent del seu entorn (seqüència i tipus d'àcid nucleic).

Els àcids nucleics poden existir a la natura en una varietat de formes estructurals potencialment rellevants per al funcionament i la regulació dels gens. Aquesta tesi doctoral versa sobre una estructura no canònica del DNA: l'estructura quàdruplex anomenada bi-loop. Es tracta d'un motiu que implica la interacció de dues cadenes que es disposen antiparal·lelament i es mantenen unides per quatre parells de bases intermoleculars. Els parells s'enfronten pel solc menor formant dues tètrades no planes. Aquest motiu havia estat observat en l'estructura cristal·logràfica d'un heptàmer lineal i en les estructures en solució de diversos octàmers cíclics.Un dels objectius d'aquesta tesi doctoral era aprofundir en l'estudi del bi-loop per tal de determinar-ne els requeriments seqüencials i intentar observar-lo per primera vegada en solució amb oligonucleòtids lineals.Inicialment s'estudià el motiu bi-loop heterolineal, format per un oligonucleòtid cíclic i un altre lineal, partint de l'heterodímer d<pCAGTCCCT>+d<pCCTTCGGT>. Mitjançant RMN, s'observà que la formació del complex heterolineal és més favorable quan l'oligonucleòtid lineal es troba tallat entre els nucleòtids aparellats. Tot i així, el seu extrem 3' és flexible i un dels parells de bases només es troba parcialment format. En tenir un oligonucleòtid lineal tallat pel llaç, sembla que també s'estructura en forma de bi-loop en presència del motlle cíclic, però aquesta estructuració es perd en allargar-ne els extrems. Per altra banda, s'ha vist que el bi-loop pot estar estabilitzat per parells no canònics, com els GT. Les dades de RMN permeten afirmar que l'octàmer cíclic d<pCCTTCGGT> s'estructura en forma de bi-loop estabilitzat per una tètrada GTGT directa i una GCGC desplaçada. Un altre octàmer cíclic, d<pTCGTATGT>, pot autoassociar-se de dues formes diferents donant lloc a dos dímers: un estabilitzat per dues tètrades mixtes GCGT desplaçades i el segon estabilitzat per una tètrada GTGT desplaçada i una GCGC desplaçada. L'observació del motiu en fragments lineals en solució seria de gran importància com a pas previ per a establir-ne la rellevància biològica. Amb aquest objectiu es dissenyaren cinc seqüències lineals derivades d'octàmers cíclics que formen bi-loops força estables però que no poden formar estructures monomèriques. D'aquestes, només dues d'elles s'estructuren en solució en forma de bi-loop: d(TGCTTCGT) i d(TCGTTGCT). La seva estructura es va determinar mitjançant dinàmica molecular restringida i s'assembla molt a totes les estructures de la mateixa família. Aquests dímers, però, són molt menys estables que el seu anàleg cíclic degut al cost entròpic de doblegar les cadenes. El segon objectiu d'aquesta tesi era emprar el motiu bi-loop com a motlle per a la ciclació assistida. Inicialment es va assajar la ciclació d'oligonucleòtids lineals fosforilats en un dels seus extrems en presència d'un motlle cíclic que afavorís la formació d'un motiu heterolineal, sense èxit. S'observà la massa del producte de ciclació, però aquest no es va poder aïllar, de manera que es conclou que el motiu no és prou estable o és massa flexible. Posteriorment es va assajar la ciclació d'oligonucleòtids lineals fosforilats en 3' que s'autoestructuren en forma de bi-loop. Usant EDC o bromur de cianogen es va poder observar la formació del motiu tant per espectrometria de masses com per electroforesi en gel de poliacrilamida.Per últim, s'ha intentat aplicar la ciclació assistida per motlle a la fase sòlida, per superar les limitacions de mida del cicle i aprofitar els avantatges de treball i purificació de la fase sòlida, especialment el desancoratge selectiu de les cadenes. No s'ha pogut assolir l'objectiu desitjat degut a la dificultat d'activar un fosfat diester en un medi aquós. / Non-canonical forms of DNA may play important roles in gene function and regulation. This thesis is focused on a type of non-canonical quadruplex called bi-loop. The bi-loop results from interaction of two chains and it is stabilized by four intermolecular base pairs. The base pairs face each other through their minor groove sides giving rise to two non-planar tetrads. This motif has been observed in the crystal structure of a lineal heptamer and in the solution structures of several cyclic octamers.In this thesis we wished to further define the sequence requirements for the bi-loop formation, and to observe it in solution with linear oligonucleotides for the first time. The study started with the so-called heterolineal complexes, formed by a cyclic octamer and a linear one. Using NMR, we observed that the formation of the bi-loop is favoured when the nick is between the base pairs, although the 3'-end is flexible. We also observed that the bi-loop can be stabilized by non-canonical base-pairs, such as GT. The cyclic octamers d<pCCTTCGGT> and d<pTCGTATGT> form bi-loops stabilized by GT and GC pairs, giving rise to three new types of tetrads (direct GTGT, slipped GTGT and slipped GCGT).Observation of the motif in solution with linear oligonucleotides would be very important to reinforce its potential biological relevance. For this purpose, five linear sequences that cannot form hairpins were designed. Two of these sequences were found to form a bi-loop motif in solution: d(TGCTTCGT) and d(TCGTTGCT). Their structures were solved by RMD and proved to be very similar to those formed by cyclic molecules, though less stable due to the entropic cost.Secondly, we wanted to use the bi-loop motif as a template for assisted cyclization. We started with the heterolineal complexes and we were not lucky in achieving the ligation. In contrast, we succeeded in the cyclization of linear phosphorylated oligonucleotides that formed bi-loop homodimers. Finally, the solid-phase template-directed cyclization of oligonucleotides was also assayed. We were not successful because of the difficulty in activating a phosphate diester moiety in an aqueous medium.