Diese Arbeit befasst sich mit der katalytischen Umsetzung von oxygenierten Kohlenwasserstoffen in einem Strömungsrohrreaktor bei 500 °C an mikroporösem Alumosilicat ZSM-5, an dem mesoporösem Alumosilicat Al-MCM-41 sowie an deren Mischphasen. Anhand der katalytischen Untersuchungen ist es möglich, für verschiedene Anforderungen an das Produktspektrum Empfehlungen an die Eigenschaften des zu verwendeten Katalysatorsystems zu formulieren. Hierfür wurden Untersuchungen zum Einfluss relevanter Syntheseprozessparameter auf die Zusammensetzung von Al-MCM-41/ZSM-5-Mischphasen vorgenommen. Die Synthese solcher Mischphasen wurde über einen 'Zwei-Template/Ein-Schritt“-Ansatz durchgeführt, der es erlaubte, die an das Katalysatorsystem gestellten Anforderungen durch eine geeignete Wahl der Syntheseparameter zu genügen. Während der Synthese der Al-MCM-41/ZSM-5-Mischphasen beobachtet man drei sich gegenseitig beeinflussenden Vorgänge, die durch, in der wässrigen Syntheselösung vorliegende, alumosilicatische Komponenten miteinander verknüpft sind: Die Auflösung und anschließende Restrukturierung einer nicht-porösen amorphen Phase, die Auflösung und Restrukturierung einer mesoporösen Al-MCM-41-Phase und die Kristallisation einer mikroporösen ZSM-5-Phase. Durch die Erhöhung des Al-Anteils im Synthesegel werden die ZSM-5-Kristallisation verlangsamt und der Schwerpunkt des Gleichgewichts dieser drei Vorgänge für einen gegebenen Reaktionszeitpunkt in Richtung der Bildung der mesoporösen Al-MCM-41-Phase verlagert. Der Einfluss des, in das jeweilige Katalysatorsystem eingebauten Aluminiums auf die katalytische Umsetzung von Oxygenaten manifestiert sich für die beiden Alumosilicate ZSM¬ 5 und Al MCM-41 auf verschiedene Weise. Eine Erhöhung des Al-Anteils in einem mikroporösen ZSM-5-Katalysatorsystem begünstigt den Verlauf von bimolekularen Reaktionen. Dies äußert sich in einem verstärkten Auftreten von Paraffin-bildenden Raktionen wie die Wasserstoff-Transfer-Reaktionen und/oder die Carboniumionen-Spaltung sowie in einer Dominanz von Aromaten-bildenen Reaktionen wie die Cyclisierung mit anschließender Dehydrierung und Aromatisierung. Dieser Effekt kann bei einer Erhöhung des Al-Anteils in einem mesoporösen Al-MCM-41-Katalysatorsystem nur im geringen Maße beobachtet werden. Jedoch nimmt mit sinkendem Si/Al-Verhältnis in beiden Katalysatorsystemen der Anteil an Produkten mit drei oder vier Kohlenstoffatomen zu. Zudem kann dabei eine beginnende Unabhängigkeit des gebildeten Produktspektrums von der Kettenlänge und der funktionellen Gruppe des umgesetzten Oxygenats beobachtet werden.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung und Problemstellung 1 2 Grundlagen 4 2.1 Hydrothermale Synthese von Alumosilicaten 4 2.1.1 WÄSSRIGE CHEMIE UND HYDROTHERMALE BEHANDLUNG VON ALUMOSILICATEN 4 2.1.2 STRUKTUR UND BILDUNGSMECHANISMUS VON AL-MCM-41 5 2.1.3 STRUKTUR UND BILDUNGSMECHANISMUS VON ZSM-5 6 2.2 Katalytische Spaltung von Kohlenwasserstoffen an Alumosilicaten 9 2.2.1 NATUR UND LOKALISIERUNG VON SÄUREZENTREN 9 2.2.2 KOHLENWASSERSTOFF-POOL-MECHANISMUS UND VERKOKUNG 10 3 Experimentelles Vorgehen und analytische Messverfahren 14 3.1 Syntheseroute zur Herstellung von Al MCM 41/ZSM 5-Mischphasen, Al MCM 41 und ZSM-5 14 3.1.1 AL MCM 41/ZSM 5 MISCHPHASEN 14 3.1.2 AL-MCM-41 17 3.1.3 ZSM-5 17 3.2 Datenerhebung und -auswertung relevanter physikalisch-chemischer und festkörperanalytischer Charakterisierungsmethoden 17 3.2.1 PULVER-RÖNTGENDIFFRAKTOMETRIE 17 3.2.2 N2-PHYSISORPTION 19 3.2.3 TEMPERATUR-PROGRAMMIERTE AMMONIAK-DESORPTION 21 3.2.4 ELEMENTARANALYSE 23 3.2.5 27AL MAS NMR 24 3.2.6 THERMOGRAVIMETRISCHE ANALYSE 25 3.3 Katalytische Austestung und Analyse der Messdaten 26 3.3.1 VERSUCHSDURCHFÜHRUNG 26 3.3.2 ANALYSE UND AUSWERTUNG KATALYTISCHER MESSDATEN 27 3.3.3 DURCHGEFÜHRTE KATALYTISCHE TESTMESSUNGEN 29 4 Untersuchungen zum Bildungsmechanismus von Al MCM 41/ZSM 5-Mischphasen 33 4.1 Mechanistische Deutung 33 4.1.1 VORBETRACHTUNG 33 4.1.2 REAKTIONSABLAUF 34 4.1.3 UNTERSUCHUNG DER MESOPOROSITÄT 39 4.1.4 MORPHOLOGISCHE BETRACHTUNG 43 4.2 Wechselwirkungen der „Beeinflussungsfaktoren“ 45 4.2.1 EFFEKT VERSCHIEDENER AUTOKLAV-TYPEN 45 4.2.2 EFFEKT DES AL-ANTEILS IM SYNTHESEGEL 48 4.2.3 SYMBIOTISCHE EINFLUSSNAHME VON ALUMINIUM UND TENSIDEN 50 5 Charakterisierung verwendeter Katalysatormaterialien 52 5.1 ZSM-5 52 5.2 Al-MCM-41 57 5.3 Physikalische Mischungen aus Al-MCM-41 und ZSM-5 60 6 Katalytisches Spalten von Oxygenaten an ZSM 5 64 6.1 Katalytisches Spalten von Alkohol-Oxygenaten an ZSM 5 in Abhängigkeit des Si/Al Verhältnisses 64 6.1.1 PRODUKTANALYSE ANHAND DER KOHLENSTOFFANZAHL IM PRODUKTMOLEKÜL 65 6.1.2 PRODUKTANALYSE ANHAND EINZELNER STOFFGRUPPEN 68 6.2 Katalytisches Spalten von Carbonyl-Oxygenaten an ZSM 5 in Abhängigkeit des Si/Al Verhältnisses 71 6.2.1 PRODUKTANALYSE ANHAND DER KOHLENSTOFFANZAHL IM PRODUKTMOLEKÜL 72 6.2.2 PRODUKTANALYSE ANHAND EINZELNER STOFFGRUPPEN 76 6.3 Ableitung eines Kohlenwasserstoff-Pool Mechanismus zur Beschreibung des katalytischen Spaltens von Oxygenaten an ZSM 5 80 6.3.1 VEREINHEITLICHUNG DES OXYGENAT FEEDS ÜBER DESSEN DEOXYGENIERUNG 81 6.3.2 ASSIMILATION KURZKETTIGER OLEFINE DURCH EINEN KATALYTISCH AKTIVEN BEREICH 83 6.3.3 EINFLUSS DES PORENSYSTEMS UND AL-ANTEILS IM KATALYSATORSYSTEMS 85 6.3.4 BESCHREIBUNG DER PRODUKTBILDUNG EINZELNER STOFFGRUPPEN IN ABHÄNGIGKEIT WESENTLICHER REAKTIONSBEDINGUNGEN 87 7 Katalytisches Spalten von Triacylglyceriden an Al MCM 41 und physikalischen Mischungen aus Al-MCM-41 und ZSM-5 92 7.1 Gegenüberstellung des katalytischen Spaltens von Ethyloctanoat an Al MCM 41 und ZSM 5 in Abhängigkeit des Si/Al Verhältnisses 92 7.2 Anwendung des Kohlenwasserstoff-Pool Mechanismus zur Beschreibung des katalytischen Spaltens von Triacylglyceriden an physikalischen Mischungen aus Al MCM-41 und ZSM-5 97 7.3 Synthese-Struktur-Wirkungsprinzip 103 8 Zusammenfassung und Ausblick 106 Literatur 112 Abbildungsverzeichnis 127 Tabellenverzeichnis 139 Abkürzungsverzeichnis 141 Anhang 142 Veröffentlichungen 165 Eidesstattliche Erklärung 168

The 2-oxoglutarate and ferrous ion dependent oxygenases are a super family of enzymes that are involved in a wide range of biological processes regulated trough the mechanism of post-translational modification (PTM). Such biological processes include hypoxia sensing (through regulating HIF transcription), fatty acid metabolism (through carnitine production), transcriptional regulation (through demethylation of histones), and collagen structure formation (through proline and lysine hydroxylation). To understand the underlying mechanisms of such regulatory processes, and to develop clinically useful inhibitors, and thereby regulate these processes in living organisms, requires sensitive methods for monitoring enzyme activity. The use of indirect methods such as quantification of reaction products (14CO2 or succinate) can be problematic, as both products can result from competitive reactions. Alternative direct measurement of substrate modifications using mass spectrometry-based proteomics can be applied; however, (1) for this technique the limit of detection is often prohibitive, (2) the method is best suited for the confirmation of known modifications, rather than for the discovery of new modifications, and (3) sequence coverage may often be only 60%, and therefore many modifications can be missed. The aim of the research presented in this thesis was to develop amino acid analysis and to apply these methods to the identification and quantification of PTMs catalysed by 2-oxoglutarate and ferrous ion dependent oxygenases. A range of LC-MS approaches were investigated including: (1) C18 reversed phase chromatography of quinoline derivatised amino acids, (2) ion paring chromatography, and (3) mixed mode chromatography with either UV, or conventional molecular MS, or isotope ratio mass spectrometry detection. Analysis of the elution patterns for those separation techniques enabled estimation of the retention parameters of modified amino acids and the identification of the modifications, where no standards were available. The most sensitive approach developed employed mixed mode chromatography coupled to isotope ratio mass spectrometry which was optimised for the analysis of modified amino acids. This was shown to have a limit of detection two orders of magnitude lower (0.01μM) than other conventional mass spectrometry techniques. Using amino acid labelling in cell culture, a quantification protocol was developed which employed a non-labelled internal standard and selectively labelled cell culture. The method was shown to be suitable for both very accurate quantification at low concentration levels and metabolic studies, allowing us to track back the modifications to their precursors. The analytical methods developed for amino acid analysis were successfully applied to the analysis of modifications resulting from 2-oxoglutarate and Fe dependent oxygenase activity. Stereochemistry of lysyl hydroxylation in the splicing regulatory protein Luk7L2 by JmjD6 as well as of the self hydroxylation of the JmjD6 was identified. The stereochemistry was shown to be different from that of previously reported for the collagen hydroxyline, hydroxylated by the another member of this enzyme family. mbP4H enzyme was shown to catalyse prolyl hydroxylation of taODD resulting in 4R-hydroxyprolyl. Amino acid analysis was used in order to verify the mechanism of the hBBOX catalysed rearrangement of Mildronate. Using the method developed for the analysis of non-derivatised amino acids the screening of potential substrates of hBBOX enzyme was carried out and two new substrates were identified. The isotope ratio mass spectrometry protocol was applied to the study of histones from cell culture; low levels of hydroxylated and methylated amino acids were quantified. The analytical methods described were developed to complement to the well established proteomics techniques. The methods developed enable investigation into the region- and stereo- chemistry of the modified groups within the modified AA residue and has proved to be a powerful tool of exploratory PTM analysis.

Student Number : 9400913V - MSc (Eng) dissertation - School of Chemical and Metallurgical Engineering - Faculty of Engineering and the Built Environment / Natural zeolites are finding applicability in a broad range of industrial processes. This study assesses the potential applications of a South African natural zeolite, Clinoptilolite, and develops a methodology to quickly screen and assess these applications. Zeolites are known to have ion exchange and adsorption properties. Wastewater treatment has been identified as a potentially important opportunity in South Africa, since South Africa - and particularly Gauteng - is a water scarce region. The wastewater treatment industry in this region can be divided into two main categories of effluent: namely chemicals from coal and the metal recovery and finishing related to the mining industry. The focus of this work was to find a method to screen for potential uses of Clinoptilolite in these industries. The major effluent treatment issue in respect of the effluents from coal-based processes was identified to be the removal of oxygenate organics that are highly soluble in water, such as ethanol and acetone. This problem cannot be solved using vapour-liquid equilibrium based processes due to high energy costs, and liquid-liquid equilibrium based processes inherently introduce new contaminants into the wastewater. We therefore screened the zeolite for application in the removal of soluble organics via adsorption. The zeolite was found to be unsuitable for the adsorption of acetone and ethanol due to the preferential adsorption of water. As a result we tested the potential of the zeolite as a drying agent for ethanol and acetone. It was found that this zeolite could find application in the dehydration of ethanol, but not acetone. In effluent from the mining and metals based industries, heavy metals frequently occur and are usually toxic, such as lead, zinc and nickel. Such contaminated water must be disposed of as toxic waste, and this is very costly. Thus being able to selectively remove these metals allows for the possible recovery and recycling of a potentially valuable metal. If no application can be found for the recovered metal, the loaded zeolite would need to be disposed of as toxic waste, but the volume of this waste is significantly smaller than that of the original effluent due to the concentration effect of ion exchange processes. All of the metals were ion exchanged onto the zeolite successfully. The zeolite exhibited exceptional selectivity for the removal of lead, and reduced the concentration of lead in the water to levels below detection by Atomic Adsorption. The selectivity for the uptake of the metals in decreasing order was lead, zinc and lastly nickel. Therefore, provided the zeolite can be regenerated, it could be used for effluent treatment in mining activities that have traces of lead in the ore body, such as zinc and silver deposits, and in the battery industry. As a result of the work presented in this dissertation, a further project was undertaken to investigate the regeneration of the zeolite. Preliminary findings indicate that although it can be regenerated, the zeolite capacity decreases with each successive regeneration cycle. More work is required on regeneration to improve the lifespan of the zeolite.

A novel chromatographic method was devised that makes use of the superb group separation power of normal phase supercritical fluid chromatography (SFC) combined with a fast second separation by a resistively heated gas chromatograph (GC). The SFC was operated isothermally with stopped flow to provide the time required for the GC analysis. The GC analysis had a typical cycle time of 1 minute. During this time the GC column was independently heated at a rate of 450°C/min to 250°C and actively cooled down again to -50°C before the next GC injection takes place. This was achieved with an in-house designed, resistively heated, temperature programmable gas chromatograph. Various temperature measurement circuits were also evaluated. An interface was developed that allows transfer between the SFC and the GC in such a way that the entire eluent from the first separation is analysed by the second separator. Chromatographic resolution was not lost during the transfer process from the first to the second separation stages. The interface also allows for the exchange of the carrier gas used in the second gas chromatographic separation to provide for the maximum separation speed. In the first separation, a silica gel packed column and the novel application of a silica gel porous layer open tubular capillary column was used for SFC group separation. The SFCxGCftp was applied to petrochemical samples and essential oils and the results were compared to that obtained with a commercially available GCxGC system. / Thesis (PhD)--University of Pretoria, 2003. / Chemistry / unrestricted

The switch to unleaded fuels in the 1970s and the high air pollution in areas of high population density due to traffic particularly since the 1990s required the use of alternative fuel additives to achieve an improvement of the combustion. The utilization of oxygenated hydrocarbons as antiknock additives and so-called oxygenates provided a more complete and efficient combustion with simultaneously less harmful and polluting emissions. These include the synthetic ethers methyl tert-butyl ether (MTBE), ethyl tert-butyl ether (ETBE), tert-amyl methyl ether (TAME) and tert-amyl ethyl ether (TAEE). MTBE has a particular position as within some years it became the dominant oxygenate worldwide. Since then, over 100.000 leakages, most often in close proximity to gas stations, resulted in just as many oxygenate-contaminated sites of soil and groundwater within few years. The high water solubility of these ethers leads to an especially fast and extensive spread of the contamination plumes. Ether-contaminated groundwater has a turpentine-like taste that is noticed already in really low concentrations. Thus, such water can no longer serve as drinking water and requires a counter-measure. The chemical parameters of oxygenates decrease the efficiency of otherwise successfully applied techniques such as adsorption or aeration. In addition the ethers proved recalcitrant against microbial attack. The search for microorganisms that could degrade these synthetic oxygenates indeed resulted in the enrichment of many isolates. The majority of these isolates oxidize the ethers in a cometabolic manner either partially or completely to CO2. However, only few cultures are capable of independent growth on these oxygenates. These include the beta-proteobacteria Methylibium petroleiphilum PM1 and Aquincola tertiaricarbonis L108, of which the latter is of particular interest for the present work. Strain L108 is characterized by good growth on MTBE and is presently the only known isolate which is able to mineralize ETBE, TAME and TAEE at similar rates. This work examined the seemingly particularly well adapted oxygenate ether metabolism of strain L108, that was formerly isolated from an aquifer highly contaminated with MTBE. Via diverse deletion studies key enzymes of the degradative metabolism and their genetic background were clearly identified. Hence, the results of this work contribute to verify so far just hypothesized metabolic steps by detailed enzymatic and genetic studies. Based on detected metabolites, first studies on MTBE biodegradation already postulated an oxidative pathway via TBA, 2-methyl-1,2-propane-diol (MPD) and 2-HIBA. In case of a monoxygenatic hydroxylation of the methoxy group of MTBE a hemiacetale results as reaction product, from which the tertiary alcohol TBA can be formed easily in subsequent reactions. By comparing wild type strain L108 with the spontaneous mutant strain L10, we were now able to clearly show that the cytochrome P-450 monoxygenase system EthABCD accounts solely for this MTBE-oxidizing activity. It is also the only enzyme catalyzing the corresponding hydroxylation of ETBE, TAME and TAEE. In strain L108 this enzyme complex is expressed constitutively. TBA, which is also generated from hydroxylation of ETBE, is, as postulated and verified by this study, degraded by a different monoxygenase resulting in MPD. Via Tn5-mediated mutations this enzyme was confirmed as Rieske non-heme mononuclear iron monooxygenase MdpJ. MPD is further altered to the corresponding branched acid 2-HIBA, presumably by two dehydrogenation reactions. For the degradation of 2-HIBA, diverse hypotheses exist on the basis of known enzymatic reactions. Another Tn5 mutation now gave evidence, that in the mentioned beta-proteobacteria the novel mutase HcmAB linearizes 2-HIBA to 3-hydroxybutyric acid (3-HB) dependent on cobalamin and coenzyme A (CoA). Sequence comparison revealed, that strain L108 acquired all three key enzyme complexes, EthABCD, MdpJ and HcmAB via horizontal gene transfer (HGT). For TAME and TAEE a completely new degradation pathway was found. In strain L108, the resulting degradation product tert-amyl alcohol (TAA) of these ethers is, like TBA, also specifically oxidized by MdpJ. In Tn5-deletion studies and metabolite analyzes, however, no hydroxylation could be detected. Instead, TAA is rather desaturated. Therefore within the metabolism no diols or acids analogue to MPD or 2-HIBA were formed. Instead, via MdpJ TAA is initially degraded to the unsaturated tertiary alcohol and hemiterpene 2-methyl-3-butene-2-ol. Prenol (3-methyl-2-buten-2-ol), prenal (3-methyl-2-buten-2-al) and 3-methyl crotonic acid were detected as additional metabolites. Hence, an isomerization of the branched acid by HcmAB is apparently irrelevant in TAA biodegradation. Accordingly it could be shown, that deletion mutants for HcmAB indeed could not grow on TBA, but are still able to grow on TAA, just as fast as the wild type, in fact. The tertiary alcohol 2-methyl-3-butene-2-ol is presumably transformed via another isomerase resulting in the primary alcohol prenol. Prenol is further oxidized by postulated dehydrogenases to 3-methyl crotonic acid. This would also be in correlation to the already observed degradation pathway of the monoterpene linalool in other bacteria. However, the responsible enzymes in strain L108 are not yet identified. Besides this principal gain of knowledge in the degradation of xenobiotic ether structures and the evolution of degradative microorganism, the now confirmed key enzymes EthB, MdpJ and HcmAB, respectively their coding genes, can be used as specific markers to monitor natural degradation processes in in situ studies. On this basis, the presence of active microorganisms and additionally - derived from the confirmed single key enzymes - a potentially complete degradation can be concluded. In the long run, it might be possible to stimulate the natural microbiological activity, e.g. via bioaugmentation with degradation specialists. Furthermore, regarding the potential progress of remediation procedures, potentially limiting steps can be distinguished via respective markers and narrowed down as possible cause of deficient degradation activity. However, such function-based monitoring requires specific verification. Therefore, subsequent studies have to analyze, if there is a sequence diversity among these three key enzymes. Previous sequence comparisons hypothesize that up to 60% accordance in the protein sequence in homologues of MdpJ and HcmA they can still be assumed to possess the same enzymatic function. This diversity has to be considered in the development of specific probes. / Die Einführung bleifreien Benzins in den 1970er-Jahren und die hohe Emissionsbelastung von Ballungszentren durch den Straßenverkehr insbesondere seit den 1990er-Jahren erforderte den Einsatz alternativer Benzinadditive, um eine Verbesserung der Verbrennung zu erreichen. Die Nutzung sauerstoffhaltiger Kohlenwasserstoffe als Antiklopfmittel und als sogenannte Oxygenate bot sich an, da diese eine effizientere Verbrennung mit gleichzeitig niedrigeren gesundheits- und umweltschädigenden Emissionen fördern. Zu den Oxygenaten gehören die synthetischen Ether Methyl-tert-butylether (MTBE), Ethyl-tert-butylether (ETBE), tert-Amylmethylether (TAME) und tert-Amylethylether (TAEE). Eine herausragende Stellung nimmt MTBE ein. Innerhalb weniger Jahre wurde es zum hauptsächlich verwendeten Oxygenat weltweit. Seitdem führten jedoch über 100.000 Leckagen, zumeist in Tankstellennähe, innerhalb weniger Jahre zu ebenso zahlreichen Kontaminationen des Grundwassers mit Oxygenaten. Aufgrund der hohen Wasserlöslichkeit kommt es dabei zu einer besonders schnellen und großflächigen Ausbreitung der Ether. Derart belastetes Grundwasser weist schon bei geringsten Etherkonzentrationen einen als terpentinartig wahrgenommenen Geruch und Geschmack auf und kann daher nicht mehr als Trinkwasserzufuhr genutzt werden. Es bedarf einer Lösung dieses Problems. Die chemischen Parameter der Ether senken allerdings die Effizienz anderweitig erfolgreich genutzter technischer Sanierungsverfahren auf Basis von z. B. Adsorption oder Aerisierung. Auch gegenüber mikrobiellen Abbau erweisen sie sich als rekalzitrant. Die Suche nach oxygenatabbauenden Mikroorganismen führte zwar zur Anreicherung vieler Isolate, welche die Oxygenate cometabolisch partiell oder sogar komplett oxidieren, nur sehr wenige Kulturen sind aber zu autarkem Wachstum auf diesen Ethern fähig. Dazu gehören die Beta-Proteobacteria Methylibium petroleiphilum PM1 und der dieser Arbeit zugrunde liegende Aquincola tertiaricarbonis L108. Der Stamm L108 zeichnet sich durch ein vergleichsweise gutes Wachstum auf MTBE aus und ist als bisher einzig bekanntes Isolat in der Lage, auch ETBE, TAME und TAEE ähnlich schnell zu mineralisieren. Die vorliegende Arbeit handelt von dem scheinbar besonders gut an den Oxygenatabbau adaptierten Stoffwechsel des ursprünglich aus MTBE-kontaminiertem Grundwasser angereicherten Stammes L108. Durch verschiedene Deletionsstudien wurden Schlüsselenzyme des Abbaus und deren genetischer Hintergrund eindeutig identifiziert. Die Ergebnisse der genetischen, enzymatischen und physiologischen Studien des Wildtyps im Vergleich zu den erzeugten Deletionsstämmen tragen dazu bei, bisher nur postulierte Reaktionsschritte zu verifizieren. Schon seit den ersten Studien zum MTBE-Abbau wird anhand markanter Metabolite ein oxidativer Abbau via TBA, 2-Methyl-1,2-propandiol (MPD) und 2-Hydroxyisobuttersäure (2-HIBA) vermutet. Im Fall einer Hydroxylierung der Methoxygruppe von MTBE wird ein Hemiacetal als Reaktionsprodukt erzeugt, aus dem nachfolgend leicht der tertiäre Alkohol TBA entstehen kann. Durch den Vergleich des Wildtyps mit der Spontanmutante Stamm L10 konnte jetzt gezeigt werden, dass hierfür allein das Cytochrom-P450-Monooxygenasesystem EthABCD verantwortlich ist. Dieses katalysiert auch exklusiv die entsprechende Hydroxylierung von ETBE, TAME und TAEE. In Stamm L108 wird das Enzym konstitutiv exprimiert. TBA, das auch aus der Hydroxylierung von ETBE resultiert, wird, wie postuliert und in dieser Arbeit verifiziert, durch eine weitere Monooxygenase zu MPD abgebaut. Durch eine Tn5-Transposon-vermittelte Mutation konnte verifiziert werden, dass es sich bei diesem Enzym um die Rieske-nicht-Häm-Monooxygenase MdpJ handelt. MPD wird im weiteren Verlauf voraussichtlich durch zwei Dehydrogenierungen zur korrespondierenden, verzweigten Säure 2-HIBA gewandelt. Zum 2-HIBA-Abbau gibt es, basierend auf bekannten Enzymreaktionen, diverse Hypothesen. Anhand einer weiteren Tn5-Mutation konnte jetzt bestätigt werden, dass in den genannten beta-Proteobacteria die neuartige Mutase HcmAB wirksam ist, welche 2-HIBA abhängig von Cobalamin und Coenzym A (CoA) zu 3-Hydroxybuttersäure (3-HB) linearisiert. Sequenzvergleiche ergaben, dass Stamm L108 die Schlüsselenzyme des Etherabbaus, EthABCD, MdpJ und HcmAB, durch horizontalen Gentransfer erworben hat. Für TAME und TAEE wurde ein völlig neuer Abbauweg gefunden. In Stamm L108 wird der beim Abbau dieser Ether entstehende tert-Amylalkohol (TAA) wie TBA ebenfalls exklusiv durch MdpJ oxidiert. Durch die Tn5-Deletionsstudien und durch Analyse der Metabolite konnte allerdings keine Hydroxylierung nachgewiesen werden. TAA wird durch MdpJ vielmehr desaturiert. Somit entstehen im Abbauweg keine zu MPD und 2-HIBA analogen Diole und Säuren, sondern TAA wird zunächst durch MdpJ zu einem ungesättigten tertiären Alkohol, dem Hemiterpen 2-Methyl-3-buten-2-ol, abgebaut. Prenol (3-Methyl-2-buten-2-ol), Prenal (3-Methyl-2-buten-2-al) und 3-Methylcrotonsäure wurden als weitere Metabolite des TAA-Stoffwechsels detektiert. Somit spielt eine Isomerisierung einer tertiär verzweigten Säure durch HcmAB im TAA-Abbauweg offensichtlich keine Rolle. Entsprechend konnte gezeigt werden, dass Deletionsmutanten für hcmAB zwar nicht mehr auf TBA, aber immer noch auf TAA wachsen können, und das genauso schnell, wie der Wildtyp. Der tertiäre Alkohol 2-Methyl-3-buten-2-ol wird wahrscheinlich durch eine andere Isomerase zum primären Alkohol Prenol umgewandelt und dieser dann durch Dehydrogenasen zur Methylcrotonsäure oxidiert. Dies würde dem bereits in anderen Bakterien beobachteten Abbauweg des Monoterpens Linalool entsprechen. Die in Stamm L108 dafür verantwortlichen Enzyme wurden aber noch nicht identifiziert. Neben diesem grundsätzlichen Erkenntnisgewinn zum Abbau der xenobiotischen Etherverbindungen und der Evolution degradativer Mikroorganismen, können die hier bestätigten Schlüssel-enzyme EthABCD, MdpJ und HcmAB bzw. deren codierende Gene als spezifische Marker zum Monitoring natürlicher Abbauprozesse für in-situ-Untersuchungen genutzt werden. Auf dieser Basis kann auf die Anwesenheit aktiver Mikroorganismen und zudem noch - abgeleitet aus der Präsenz der einzelnen Schlüsselenzyme - auf einen potenziell kompletten Abbau geschlossen werden. Darauf aufbauend kann die natürliche mikrobiologische Aktivität durch nachfolgende biotechnologische Maßnahmen stimuliert werden, zum Beispiel durch eine Bioaugmentation mit Abbauspezialisten. Des weiteren können mögliche limitierende Schritte hinsichtlich des potenziellen Verlaufs der Sanierungsmaßnahme über Präsenztiter der betreffenden Marker gezielter verfolgt und als etwaige Ursachen defizitärer Abbauleistungen eingegrenzt werden. Voraussetzung für dieses funktionsbasierte Monitoring ist allerdings der spezifische Nachweis. Somit sollte in nachfolgenden Studien analysiert werden, ob es bei den drei Schlüsselenzymen eine Sequenzdiversität gibt. Die bisherigen Sequenzvergleiche lassen zumindest vermuten, dass bis etwa 60% Übereinstimmung der Proteinsequenzen bei Homologen von MdpJ und HcmA noch mit der gleichen Enzymfunktion zu rechnen ist. Diese Diversität sollte bei der Entwicklung von spezifischen Sonden berücksichtigt werden.

The switch to unleaded fuels in the 1970s and the high air pollution in areas of high population density due to traffic particularly since the 1990s required the use of alternative fuel additives to achieve an improvement of the combustion. The utilization of oxygenated hydrocarbons as antiknock additives and so-called oxygenates provided a more complete and efficient combustion with simultaneously less harmful and polluting emissions. These include the synthetic ethers methyl tert-butyl ether (MTBE), ethyl tert-butyl ether (ETBE), tert-amyl methyl ether (TAME) and tert-amyl ethyl ether (TAEE). MTBE has a particular position as within some years it became the dominant oxygenate worldwide. Since then, over 100.000 leakages, most often in close proximity to gas stations, resulted in just as many oxygenate-contaminated sites of soil and groundwater within few years. The high water solubility of these ethers leads to an especially fast and extensive spread of the contamination plumes. Ether-contaminated groundwater has a turpentine-like taste that is noticed already in really low concentrations. Thus, such water can no longer serve as drinking water and requires a counter-measure. The chemical parameters of oxygenates decrease the efficiency of otherwise successfully applied techniques such as adsorption or aeration. In addition the ethers proved recalcitrant against microbial attack. The search for microorganisms that could degrade these synthetic oxygenates indeed resulted in the enrichment of many isolates. The majority of these isolates oxidize the ethers in a cometabolic manner either partially or completely to CO2. However, only few cultures are capable of independent growth on these oxygenates. These include the beta-proteobacteria Methylibium petroleiphilum PM1 and Aquincola tertiaricarbonis L108, of which the latter is of particular interest for the present work. Strain L108 is characterized by good growth on MTBE and is presently the only known isolate which is able to mineralize ETBE, TAME and TAEE at similar rates. This work examined the seemingly particularly well adapted oxygenate ether metabolism of strain L108, that was formerly isolated from an aquifer highly contaminated with MTBE. Via diverse deletion studies key enzymes of the degradative metabolism and their genetic background were clearly identified. Hence, the results of this work contribute to verify so far just hypothesized metabolic steps by detailed enzymatic and genetic studies. Based on detected metabolites, first studies on MTBE biodegradation already postulated an oxidative pathway via TBA, 2-methyl-1,2-propane-diol (MPD) and 2-HIBA. In case of a monoxygenatic hydroxylation of the methoxy group of MTBE a hemiacetale results as reaction product, from which the tertiary alcohol TBA can be formed easily in subsequent reactions. By comparing wild type strain L108 with the spontaneous mutant strain L10, we were now able to clearly show that the cytochrome P-450 monoxygenase system EthABCD accounts solely for this MTBE-oxidizing activity. It is also the only enzyme catalyzing the corresponding hydroxylation of ETBE, TAME and TAEE. In strain L108 this enzyme complex is expressed constitutively. TBA, which is also generated from hydroxylation of ETBE, is, as postulated and verified by this study, degraded by a different monoxygenase resulting in MPD. Via Tn5-mediated mutations this enzyme was confirmed as Rieske non-heme mononuclear iron monooxygenase MdpJ. MPD is further altered to the corresponding branched acid 2-HIBA, presumably by two dehydrogenation reactions. For the degradation of 2-HIBA, diverse hypotheses exist on the basis of known enzymatic reactions. Another Tn5 mutation now gave evidence, that in the mentioned beta-proteobacteria the novel mutase HcmAB linearizes 2-HIBA to 3-hydroxybutyric acid (3-HB) dependent on cobalamin and coenzyme A (CoA). Sequence comparison revealed, that strain L108 acquired all three key enzyme complexes, EthABCD, MdpJ and HcmAB via horizontal gene transfer (HGT). For TAME and TAEE a completely new degradation pathway was found. In strain L108, the resulting degradation product tert-amyl alcohol (TAA) of these ethers is, like TBA, also specifically oxidized by MdpJ. In Tn5-deletion studies and metabolite analyzes, however, no hydroxylation could be detected. Instead, TAA is rather desaturated. Therefore within the metabolism no diols or acids analogue to MPD or 2-HIBA were formed. Instead, via MdpJ TAA is initially degraded to the unsaturated tertiary alcohol and hemiterpene 2-methyl-3-butene-2-ol. Prenol (3-methyl-2-buten-2-ol), prenal (3-methyl-2-buten-2-al) and 3-methyl crotonic acid were detected as additional metabolites. Hence, an isomerization of the branched acid by HcmAB is apparently irrelevant in TAA biodegradation. Accordingly it could be shown, that deletion mutants for HcmAB indeed could not grow on TBA, but are still able to grow on TAA, just as fast as the wild type, in fact. The tertiary alcohol 2-methyl-3-butene-2-ol is presumably transformed via another isomerase resulting in the primary alcohol prenol. Prenol is further oxidized by postulated dehydrogenases to 3-methyl crotonic acid. This would also be in correlation to the already observed degradation pathway of the monoterpene linalool in other bacteria. However, the responsible enzymes in strain L108 are not yet identified. Besides this principal gain of knowledge in the degradation of xenobiotic ether structures and the evolution of degradative microorganism, the now confirmed key enzymes EthB, MdpJ and HcmAB, respectively their coding genes, can be used as specific markers to monitor natural degradation processes in in situ studies. On this basis, the presence of active microorganisms and additionally - derived from the confirmed single key enzymes - a potentially complete degradation can be concluded. In the long run, it might be possible to stimulate the natural microbiological activity, e.g. via bioaugmentation with degradation specialists. Furthermore, regarding the potential progress of remediation procedures, potentially limiting steps can be distinguished via respective markers and narrowed down as possible cause of deficient degradation activity. However, such function-based monitoring requires specific verification. Therefore, subsequent studies have to analyze, if there is a sequence diversity among these three key enzymes. Previous sequence comparisons hypothesize that up to 60% accordance in the protein sequence in homologues of MdpJ and HcmA they can still be assumed to possess the same enzymatic function. This diversity has to be considered in the development of specific probes.:Bibliographische Darstellung Eidesstattliche Erklärung Danksagung Abstract Kurzfassung Abkürzungsverzeichnis 1. Einleitung 1.1. Tertiäre Ether als Benzin-Oxygenate - Hintergrund und Umweltproblematik 1.2. Mikrobiologischer Abbau tertiärer Ether 1.3. Postulierter Abbauweg 1.4. Monitoring-Tools für biologischen Abbau 1.5. Ziel dieser Arbeit 1.6. Referenzen der Einleitung 2. Die initiale Etherspaltung des Stammes L108 2.1. Die Ethermonooxygenase EthB 2.2. Supplemental Material 3. Die spezifische Alkoholmonooxygenase MdpJ 3.1. Die Alkoholmonooxygenase MdpJ als Hydroxylase und Reduktase 3.2. Supplemental Material 4. Die 2-HIBA-Mutase HcmAB des Stammes L108 4.1. Die 2-HIBA-Mutase HcmAB 4.2. Supplemental Material 5. Der TAA-Abbau des Stammes L108 5.1. Der TAA-Abbau des Stammes L108 5.2. Supplemental Material 6. Diskussion 6.1. Nachweis der Schlüsselenzyme in Stamm L108 durch Mutation 6.2. Nutzen für den Nachweis natürlichen Abbaus 6.3. Der TAA-Metabolismus als neuartiger Abbauweg 6.4. Mikrobiologische Anpassung an Xenobiotika am Beispiel MTBE 6.5. Ausblick 6.6. Referenzen der Diskussion Anhang Curriculum Vitae Publikationsverzeichnis Tagungsbeiträge Nachweis über Anteile der Co-Autoren / Die Einführung bleifreien Benzins in den 1970er-Jahren und die hohe Emissionsbelastung von Ballungszentren durch den Straßenverkehr insbesondere seit den 1990er-Jahren erforderte den Einsatz alternativer Benzinadditive, um eine Verbesserung der Verbrennung zu erreichen. Die Nutzung sauerstoffhaltiger Kohlenwasserstoffe als Antiklopfmittel und als sogenannte Oxygenate bot sich an, da diese eine effizientere Verbrennung mit gleichzeitig niedrigeren gesundheits- und umweltschädigenden Emissionen fördern. Zu den Oxygenaten gehören die synthetischen Ether Methyl-tert-butylether (MTBE), Ethyl-tert-butylether (ETBE), tert-Amylmethylether (TAME) und tert-Amylethylether (TAEE). Eine herausragende Stellung nimmt MTBE ein. Innerhalb weniger Jahre wurde es zum hauptsächlich verwendeten Oxygenat weltweit. Seitdem führten jedoch über 100.000 Leckagen, zumeist in Tankstellennähe, innerhalb weniger Jahre zu ebenso zahlreichen Kontaminationen des Grundwassers mit Oxygenaten. Aufgrund der hohen Wasserlöslichkeit kommt es dabei zu einer besonders schnellen und großflächigen Ausbreitung der Ether. Derart belastetes Grundwasser weist schon bei geringsten Etherkonzentrationen einen als terpentinartig wahrgenommenen Geruch und Geschmack auf und kann daher nicht mehr als Trinkwasserzufuhr genutzt werden. Es bedarf einer Lösung dieses Problems. Die chemischen Parameter der Ether senken allerdings die Effizienz anderweitig erfolgreich genutzter technischer Sanierungsverfahren auf Basis von z. B. Adsorption oder Aerisierung. Auch gegenüber mikrobiellen Abbau erweisen sie sich als rekalzitrant. Die Suche nach oxygenatabbauenden Mikroorganismen führte zwar zur Anreicherung vieler Isolate, welche die Oxygenate cometabolisch partiell oder sogar komplett oxidieren, nur sehr wenige Kulturen sind aber zu autarkem Wachstum auf diesen Ethern fähig. Dazu gehören die Beta-Proteobacteria Methylibium petroleiphilum PM1 und der dieser Arbeit zugrunde liegende Aquincola tertiaricarbonis L108. Der Stamm L108 zeichnet sich durch ein vergleichsweise gutes Wachstum auf MTBE aus und ist als bisher einzig bekanntes Isolat in der Lage, auch ETBE, TAME und TAEE ähnlich schnell zu mineralisieren. Die vorliegende Arbeit handelt von dem scheinbar besonders gut an den Oxygenatabbau adaptierten Stoffwechsel des ursprünglich aus MTBE-kontaminiertem Grundwasser angereicherten Stammes L108. Durch verschiedene Deletionsstudien wurden Schlüsselenzyme des Abbaus und deren genetischer Hintergrund eindeutig identifiziert. Die Ergebnisse der genetischen, enzymatischen und physiologischen Studien des Wildtyps im Vergleich zu den erzeugten Deletionsstämmen tragen dazu bei, bisher nur postulierte Reaktionsschritte zu verifizieren. Schon seit den ersten Studien zum MTBE-Abbau wird anhand markanter Metabolite ein oxidativer Abbau via TBA, 2-Methyl-1,2-propandiol (MPD) und 2-Hydroxyisobuttersäure (2-HIBA) vermutet. Im Fall einer Hydroxylierung der Methoxygruppe von MTBE wird ein Hemiacetal als Reaktionsprodukt erzeugt, aus dem nachfolgend leicht der tertiäre Alkohol TBA entstehen kann. Durch den Vergleich des Wildtyps mit der Spontanmutante Stamm L10 konnte jetzt gezeigt werden, dass hierfür allein das Cytochrom-P450-Monooxygenasesystem EthABCD verantwortlich ist. Dieses katalysiert auch exklusiv die entsprechende Hydroxylierung von ETBE, TAME und TAEE. In Stamm L108 wird das Enzym konstitutiv exprimiert. TBA, das auch aus der Hydroxylierung von ETBE resultiert, wird, wie postuliert und in dieser Arbeit verifiziert, durch eine weitere Monooxygenase zu MPD abgebaut. Durch eine Tn5-Transposon-vermittelte Mutation konnte verifiziert werden, dass es sich bei diesem Enzym um die Rieske-nicht-Häm-Monooxygenase MdpJ handelt. MPD wird im weiteren Verlauf voraussichtlich durch zwei Dehydrogenierungen zur korrespondierenden, verzweigten Säure 2-HIBA gewandelt. Zum 2-HIBA-Abbau gibt es, basierend auf bekannten Enzymreaktionen, diverse Hypothesen. Anhand einer weiteren Tn5-Mutation konnte jetzt bestätigt werden, dass in den genannten beta-Proteobacteria die neuartige Mutase HcmAB wirksam ist, welche 2-HIBA abhängig von Cobalamin und Coenzym A (CoA) zu 3-Hydroxybuttersäure (3-HB) linearisiert. Sequenzvergleiche ergaben, dass Stamm L108 die Schlüsselenzyme des Etherabbaus, EthABCD, MdpJ und HcmAB, durch horizontalen Gentransfer erworben hat. Für TAME und TAEE wurde ein völlig neuer Abbauweg gefunden. In Stamm L108 wird der beim Abbau dieser Ether entstehende tert-Amylalkohol (TAA) wie TBA ebenfalls exklusiv durch MdpJ oxidiert. Durch die Tn5-Deletionsstudien und durch Analyse der Metabolite konnte allerdings keine Hydroxylierung nachgewiesen werden. TAA wird durch MdpJ vielmehr desaturiert. Somit entstehen im Abbauweg keine zu MPD und 2-HIBA analogen Diole und Säuren, sondern TAA wird zunächst durch MdpJ zu einem ungesättigten tertiären Alkohol, dem Hemiterpen 2-Methyl-3-buten-2-ol, abgebaut. Prenol (3-Methyl-2-buten-2-ol), Prenal (3-Methyl-2-buten-2-al) und 3-Methylcrotonsäure wurden als weitere Metabolite des TAA-Stoffwechsels detektiert. Somit spielt eine Isomerisierung einer tertiär verzweigten Säure durch HcmAB im TAA-Abbauweg offensichtlich keine Rolle. Entsprechend konnte gezeigt werden, dass Deletionsmutanten für hcmAB zwar nicht mehr auf TBA, aber immer noch auf TAA wachsen können, und das genauso schnell, wie der Wildtyp. Der tertiäre Alkohol 2-Methyl-3-buten-2-ol wird wahrscheinlich durch eine andere Isomerase zum primären Alkohol Prenol umgewandelt und dieser dann durch Dehydrogenasen zur Methylcrotonsäure oxidiert. Dies würde dem bereits in anderen Bakterien beobachteten Abbauweg des Monoterpens Linalool entsprechen. Die in Stamm L108 dafür verantwortlichen Enzyme wurden aber noch nicht identifiziert. Neben diesem grundsätzlichen Erkenntnisgewinn zum Abbau der xenobiotischen Etherverbindungen und der Evolution degradativer Mikroorganismen, können die hier bestätigten Schlüssel-enzyme EthABCD, MdpJ und HcmAB bzw. deren codierende Gene als spezifische Marker zum Monitoring natürlicher Abbauprozesse für in-situ-Untersuchungen genutzt werden. Auf dieser Basis kann auf die Anwesenheit aktiver Mikroorganismen und zudem noch - abgeleitet aus der Präsenz der einzelnen Schlüsselenzyme - auf einen potenziell kompletten Abbau geschlossen werden. Darauf aufbauend kann die natürliche mikrobiologische Aktivität durch nachfolgende biotechnologische Maßnahmen stimuliert werden, zum Beispiel durch eine Bioaugmentation mit Abbauspezialisten. Des weiteren können mögliche limitierende Schritte hinsichtlich des potenziellen Verlaufs der Sanierungsmaßnahme über Präsenztiter der betreffenden Marker gezielter verfolgt und als etwaige Ursachen defizitärer Abbauleistungen eingegrenzt werden. Voraussetzung für dieses funktionsbasierte Monitoring ist allerdings der spezifische Nachweis. Somit sollte in nachfolgenden Studien analysiert werden, ob es bei den drei Schlüsselenzymen eine Sequenzdiversität gibt. Die bisherigen Sequenzvergleiche lassen zumindest vermuten, dass bis etwa 60% Übereinstimmung der Proteinsequenzen bei Homologen von MdpJ und HcmA noch mit der gleichen Enzymfunktion zu rechnen ist. Diese Diversität sollte bei der Entwicklung von spezifischen Sonden berücksichtigt werden.:Bibliographische Darstellung Eidesstattliche Erklärung Danksagung Abstract Kurzfassung Abkürzungsverzeichnis 1. Einleitung 1.1. Tertiäre Ether als Benzin-Oxygenate - Hintergrund und Umweltproblematik 1.2. Mikrobiologischer Abbau tertiärer Ether 1.3. Postulierter Abbauweg 1.4. Monitoring-Tools für biologischen Abbau 1.5. Ziel dieser Arbeit 1.6. Referenzen der Einleitung 2. Die initiale Etherspaltung des Stammes L108 2.1. Die Ethermonooxygenase EthB 2.2. Supplemental Material 3. Die spezifische Alkoholmonooxygenase MdpJ 3.1. Die Alkoholmonooxygenase MdpJ als Hydroxylase und Reduktase 3.2. Supplemental Material 4. Die 2-HIBA-Mutase HcmAB des Stammes L108 4.1. Die 2-HIBA-Mutase HcmAB 4.2. Supplemental Material 5. Der TAA-Abbau des Stammes L108 5.1. Der TAA-Abbau des Stammes L108 5.2. Supplemental Material 6. Diskussion 6.1. Nachweis der Schlüsselenzyme in Stamm L108 durch Mutation 6.2. Nutzen für den Nachweis natürlichen Abbaus 6.3. Der TAA-Metabolismus als neuartiger Abbauweg 6.4. Mikrobiologische Anpassung an Xenobiotika am Beispiel MTBE 6.5. Ausblick 6.6. Referenzen der Diskussion Anhang Curriculum Vitae Publikationsverzeichnis Tagungsbeiträge Nachweis über Anteile der Co-Autoren