The pentameric ligand gated ion channel super family plays a central role in fast synaptic communication between neurons and at the neuromuscular junction. Extensive studies on the prototypic pLGIC, the Torpedo nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) have revealed an exquisite lipid sensitivity, with the nAChR adopting a novel uncoupled conformation in membranes lacking activating anionic and neutral lipids. The lipid-exposed transmembrane alpha-helix, M4, in each homologous subunit likely acts as a lipid sensor. One model proposes that activating lipids promote M4 “binding” to the adjacent alpha-helices, M1 and M3, to enhance interactions between the M4 C-terminus and the Cys-loop of the agonist-binding domain, with such interactions promoting coupling between the agonist site and channel gate. The first part of my thesis indirectly tests this hypothesis by exploring the effects of membrane hydrophobic thickness on nAChR function. Specifically, I tested the hypothesis that thicker membranes, which should promote alignment of M4 parallel to M1/M3 and thus helix-helix interactions, favor a coupled conformation. Although I found that the nAChR is uncoupled in all membranes tested, regardless of hydrophobic thickness, thicker membranes promote transitions from uncoupled to ultimately the desensitized state over the minutes to hours time frame. In contrast to anionic lipids, which influence function primarily via a conformational selection mechanism, membrane hydrophobic thickness influences function via a kinetic mechanism - thick membranes lower the activation energy between uncoupled and coupled conformations to promote conformational transitions. In the second part of my thesis, I used the two prokaryotic homologs, GLIC and ELIC, to explore how amino acid interactions at the interface between M4 and M1/M3 influence channel activity. Alanine scanning mutagenesis of this interface shows that disruption of almost any interaction in GLIC leads to a loss of folding and/or function, while analogous mutations in ELIC typically lead to no change or produce gains in function. Sequence comparisons with other members of the pLGIC superfamily suggest that the transmembrane domains of GLIC and ELIC represent two distinct archetypes. Each archetype may strike a different balance between the need for strong M4 binding to M1/M3 to promote folding and pentamer assembly, and the need for weaker interactions that allow for greater conformational flexibility during function.

Au niveau de la synapse, la liaison des neurotransmetteurs aux récepteurs membranaires induit l’ouverture de canaux ioniques. Le Récepteur de la Glycine (RGly) est un récepteur ionotrope impliqué dans des troubles neuronaux tels que l’addiction, la douleur chronique, ou l’hyperekplexie ; pour cette raison il est important de développer des nouveaux traitements ciblant ce récepteur. Nous avons utilisé des simulations de Dynamiques Moléculaire (DM) et d’électrophysiologie numérique afin d’évaluer la fonction des structures du RGly disponibles et montré qu’aucune d’entre elles ne satisfait les propriétés fonctionnelles de l’état ouvert. Grâce aux simulations de DM, nous avons caractérisé une nouvelle conformation du RGly, qui est compatible avec cet état. Nous avons souligné le rôle majeur des portails latéraux pour la perméation des ions. Nous avons proposé un protocole, nommé pharmacologie dépendante de l’état, pour identifier des molécules modulatrices de protéines allostériques. / Signals within neurons are mostly transmitted through chemical synapses. Signal transduction arises from the binding of neurotransmitters to membrane receptors in order to open ion channels. The Glycine Receptor (GlyR) is an ionotropic receptor which is involved in several neurological disorders such as addiction, chronic pain, or hyperekplexia. Because of its implication in human diseases, it is interesting to design novel drugs targeting this receptor. We used Molecular Dynamics (MD) simulations and computational electrophysiology to probe the function of available GlyR structures. We showed that none of the experimental structures display the physiological behavior of the conductive state. Using MD simulations, we captured a novel conformation of the GlyR compatible with a conductive state and demonstrated the importance of lateral portals for ionic permeation. Lastly, we proposed an original protocol, named state-based pharmacology, to discover modulators of allosteric proteins.

Structural biology has become an important part of researching various diseases and drug development. In this thesis, I provide details on how I worked with approaches to structural characterization of a heteromeric GABA(A)R. These pentameric ligand gated ion channels take part in regulating inhibition of action potentials in nerve cells by allowing the passage of Cl- ions when bound by gamma-aminobutyric acid (GABA). They are formed by the assembly of five subunits which can be of various different types, denoted by greek letters and a number. Much is still unknown about how GABA and several other ligands bind to these ion channels and how that impacts function. Obtaining a structure of these proteins can aid in closing those knowledge gaps. It is reasonable to screen the proteins you have before you study their structures by Cryo-EM in order to get the best result, a methodology for which is described here. I have followed this methodology to screen two heteromeric GABA$_A$R that we wish to determine the structure of, alpha 5 beta 3 and rho 1 gamma 2. Neither of the combinations of genes we used to express these proteins proved to produce the desired fully assembled heteromeric protein. In the case of alpha 5 beta 3, we only witnessed building blocks, with no fully assembled channels. In rho 1 gamma 2, we instead only witnessed fully formed homomers of the rho 1 subunit. These findings then exclude the gene constructs used from further structural study, and the methodology described will inform the next steps to be taken. / Strukturbiologi har blivit en viktig del av forskningen kring många sjukdomar samt utveckling av läkemedel. I denna uppsats delger jag hur jag arbetat med metoder för strukturell karakterisering av en heteromerisk GABA(A)R. Dessa pentameriska ligandstyrda jonkanaler deltar i regleringen av hämning av aktionspotentialer i nervceller genom att tillåta passagen av Cl- joner när gamma-aminosmörsyra (GABA) binder. Dessa består av fem subenheter som kan vara en av flera olika typer, vilka anges med en grekisk bokstav och en siffra. Mycket om hur GABA och andra ligander binder till dessa jonkanaler och hur det påverkar dess funktion är fortfarande okänt. Att hitta en struktur av dessa proteiner kan hjälpa oss att stänga kunskapsgapen. Det är klokt att undersöka om genen man ska använda för att uttrycka det sökta proteinet ger det man söker innan man sen börjar studera strukturen. Jag har beskrivit en metodologi för detta och följt den för två heteromeriska proteiner, alpha 5 beta 3 och rho 1 gamma 2. Ingen av kombinationerna av gener vi använt för att uttrycka dessa proteiner har producerat de sökta, fullt ihoppbyggda proteinerna. I fallet för alpha 5 \beta 3 så ser vi endast byggstenar och inga kompletta proteiner, och för rho 1 gamma 2 så ser vi endast homomeriska proteiner av rho 1. Dessa slutsatser exkluderar de genkonstruktioner vi använt från vidare strukturella studier, och stegen som bör tas härnäst beskrivs av den använda metodologin.

GLIC är en pH-känslig pentamerisk ligandstyrd jonkanal (pLGIC) som finns i cellmembranet hos prokaryoten Gloeobacter violaceus. GLIC är en bakteriell homolog till flera receptorer som är viktiga i nervsystemet hos de flesta eukaryotiska organismer. Dessa receptorer fungerar som mallar för utvecklingen av målstyrda bedövnings- och stimulerande läkemedel som påverkar nervsystemet. Förståelsen av ett proteins mekanismer har därför hög prioritet inför läkemedelsutvecklingen. Eukaryota pLGICs är dock mycket komplexa eftersom några av de är heteromera, har flera domäner, och de pågår eftertranslationella ändringar. GLIC, å andra sidan, har en enklare struktur och det räcker att analysera strukturen av en subenhet - eftersom alla subenheter är helt lika. Flertalet möjliga grindmekanismer föreslogs av vetenskapen men riktiga öppningsmekanismen av GLIC är fortfarande oklar. Projektets mål är att genomföra maskininlärning (ML) för att upptäcka nya grindmekanismer med hjälp av datormetoder. Urspungsdatan togs från tidigare forskning där andra ML-redskap såsom molekyldynamik (MD), elastisk nätverksstyrd Brownsk dynamik (eBDIMS) och Markovstillståndsmodeller (MSM) användes. Utifrån dessa redskap simulerades proteinet som vildtyp samt med funktionsförstärkt mutation vid två olika pH värden. Fem makrotillstånd byggdes: två öppna, två stängda och ett mellanliggande. I projektet användes ett annat ML redskap: KL-divergens. Detta redskap användes för att hitta skillnader i avståndfördelning mellan öppet och stängt makrotillstånd. Utifrån ursprungsdatan byggdes en tensor som lagrade alla parvisa aminosyrornas avstånd. Varje aminosyrapar hade sin egen metadata som i sin tur användes för att frambringa alla fem avståndsfördelningar fråm MSMs som byggdes i förväg. Sedan bräknades medel-KL-divergens mellan två avståndfördelningar av intresse för att filtrera bort aminosyropar med överlappande avståndsfördelningar. För att se till att aminosyror inom aminosyrapar som låg kvar kan påverka varandra, filtrerades bort alla par vars minsta och medelavstånd var stora. De kvarvarande aminosyroparen utvärderades i förhållande till alla fem makrotillstånd Viktiga nya grindmekanismer som hittades genom både KL-divergens och makrotillståndsfördelningar innefattade loopen mellan M2-M3 helixarna av en subenhet och både loopen mellan sträckor β8 och β9 (Loop F)/N-terminal β9-sträckan och pre-M1/N-terminal M1 av närliggande subenheten. Loopen mellan sträckor β8 och β9 (Loop F) visade höga KL-värden också med loopen mellan sträckor β1 och β2 loop samt med loopen mellan sträckor β6 och β7 (Pro-loop) och avståndet mellan aminosyror minskade vid kanalens grind. Övriga intressanta grindmekanismer innefattade parning av aminosyror från loopen β4-β5 (Loop A) med aminosyror från sträckor β1 och β6 samt böjning av kanalen porangränsande helix. KL-divergens påvisades vara ett viktigt redskap för att filtrera tillgänglig data och de nya grindmekanismer kan bli användbara både för akademin, som vill reda ut GLIC:s fullständiga grindmekanismer, och läkemedelsföretag, som letar efter bindningsställen inom molekylen för att utveckla nya läkemedel. / GLIC is a transmembrane proton-gated pentameric ligand-gated ion channel (pLGIC) that is found in the prokaryote Gloeobacter violaceus. GLIC is the prokaryotic homolog to several receptors that are found in the nervous system of many eukaryotic organisms. These receptors are targets for the development of pharmaceutical drugs that interfere with the gating of these channels - such drugs involve anesthetics and stimulants. Understanding the mechanism of a drug’s target is a high priority for the development of a novel medicine. However, eukaryotic pLGICs are complex to analyse, because some of them are heteromeric, have more domains, and because of their post-translational modifications (PTMs). GLIC, on the other hand, has a simpler structure and it is enough to study the structure of only one subunit - since all subunits are identical. Several possible gating mechanisms have been proposed by the scientific community, but the complete gating of GLIC remains unclear. The goal of this project is to implement machine learning (ML) to discover novel gating mechanisms by computational approaches. The starting data was extracted from a previous research where computational tools like unbiased molecular dynamics (MD), elastic network-driven Brownian Dynamics (eBDIMS), and Markov state models (MSMs) were used. From those tools, the protein was simulated in wild-type and in a gain-of-function mutation at two different pH values. Five macrostates were constructed: two open, two closed, and an intermediate. In this project another ML tool was used: KL divergence. This tool was used to score the difference between the distance distributions of one open and one closed macrostate. The starting data was used to create a tensor that stored all residue-residue distances. Each residue pair had its own metadata, which in turn was used to yield the distance distributions of all five pre-build MSMs. Then the average KL scores between two states of interest were calculated and were used to filter out the residue pairs with overlapping distance distributions. To make sure that the residues within a pair can interact with each other, all residue pairs with very high minimum and average distance were filtered out as well. The residue pairs that remained were later evaluated across all five macrostates for further studies. Important novel mechanisms discovered in this project through both the KL divergence and the macrostate distributions involved the M2-M3 loop of one subunit and both the β8-β9 loop/N-terminal β9 strand and the preM1/N-terminal M1 region of the neighboring subunit. The β8-β9 loop (Loop F) showed high KL scores with the β1-β2 and β6-β7 (Pro-loop) loops as well with decreasing distances upon the channel’s opening. Other notable gating mechanisms involved are the pairing of residues from the β1-β2 loop (Loop A) with residues from the strands β1 and β6, as well as the kink of the pore-lining helix. KL divergence proved a valuable tool to filter available data and the novel mechanisms can prove useful both to the academic community that seeks to unravel the complete gating mechanism of GLIC and to the pharmaceutical companies that search for new binding sites within the molecule for new drugs.

La découverte des anesthésiques représente un progrès majeur de la médecine, rendu possible par l'observation empirique de leurs effets. Des expériences ont révélées les neurorécepteurs comme cibles possibles des anesthésiques, des canaux localisés sur la membrane des cellules cibles aux terminaisons nerveuses. Le récepteur GLIC, un homologue bactérien du récepteur nicotinique humain, a été co-cristallisé en 2011 avec des anesthésiques généraux liés à lui. Dans cette thèse, j'utilise les simulations de dynamique moléculaire pour caractériser les interactions entre des anesthésiques généraux et différentes formes de GLIC. En 2011, le propofol et le desflurane ont été co-cristallisés dans un site de liaison intra-sous-unité localisé dans le domaine transmembranaire de GLIC. En 2013, il a été montré que le bromoforme se lie à ce site ainsi qu'à un site inter-sous-unités. Dans ce travail, je décris des simulations d'une nouvelle structure cristalline montrant un site de liaison situé dans le pore du canal. Des simulations d'innondation de GLIC par le bromoforme ont démontré l'accessibilité spontanée des sites expérimentaux dans un environnement non cristallin. Des calculs d'énergie libre mettent en évidence des différences d'énergie de liaison entre les sites et entre des mutants de GLIC. Un échantillonnage complet des poches de liaison m'a permis de détecter un autre site de liaison inter-sous-unité duquel l'accessibilité est semble modulée par un résidu en particulier. Les données accumulées au cours de ce projet fournissent une image grandissante de l'action des anesthésiques à l'échelle atomique.