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Étude post-GWAS des gènes de susceptibilité au diabète de type 2 : rôle phare dans la fonction de la cellule β pancréatique / Post-GWAS study of candidate type 2 diabetes susceptibility genes : a key role in pancreatic β-cell function

Ndiaye, Fatou Kiné 18 December 2017 (has links)
Les études d’association pangénomique (GWAS) ont permis la mise en évidence de nouvelles voies putativement importantes dans la physiopathologie du diabète de type 2, par l’identification de variants génétiques fréquents (SNP) de susceptibilité au diabète de type 2, mais souvent avec peu ou pas d'informations sur le mécanisme sous-jacent expliquant le lien entre ces variants génétiques et le phénotype diabétique. En effet ces SNP sont souvent non codants et ont un effet modeste sur le risque de diabète de type 2, ce qui rend difficile leur étude d’un point de vue fonctionnel. Dès le début des GWAS, il a été suggéré que ces gènes associés au diabète de type 2, étaient des « gènes de la cellule β pancréatique » sans que des études fonctionnelles n’aient été faites de manière systématique. Dans ce contexte, nous avons mené une étude de fishing pour déblayer cette quantité importante de données provenant des GWAS et d’identifier des gènes potentiellement importants, pouvant être de nouvelles cibles thérapeutiques. Le premier objectif de ma thèse a été l’étude de l’expression des gènes de susceptibilité au diabète de type 2 dans un panel de tissus humains comprenant des tissus pancréatiques et des tissus sensibles à l’insuline. Pour cela nous avons utilisé une technique de quantification non biaisée de l’expression génique dans le but de montrer si ces gènes associés au diabète de type 2 avaient une expression enrichie (proportion de gènes de susceptibilité au diabète de type 2 surexprimés dans les cellules β versus les autres tissus) dans les cellules β pancréatiques. Nous avons ensuite réalisé des études fonctionnelles sur la trentaine de gènes de susceptibilité au diabète de type 2 les plus exprimés dans notre modèle cellulaire par des tests de sécrétion d’insuline, des études de la viabilité cellulaire, du séquençage d’ARN (RNA-seq) et du western blotting dans la lignée de cellules β pancréatiques humaines EndoC-βH1. Les EndoC-βH1 sont des cellules en mesure de sécréter de l’insuline en réponse au glucose et à d’autres sécrétagogues. Nous les avons utilisé afin d’étudier le rôle de ces gènes de susceptibilité au diabète de type 2 dans la fonction de la cellule β pancréatique, en particulier dans la sécrétion insulinique. Notre étude d’expression a montré que l’expression des gènes de susceptibilité au diabète de type 2 est enrichie de manière significative dans les cellules β pancréatiques et la lignée EndoC-βH1. Pour cinq gènes du diabète de type 2 (TBC1D4, TCF19, KCNK16, CDKN2A et SLC30A8) ayant une présence et un effet déjà connus dans la fonction des cellules β, nous avons démontré une variation significative de la sécrétion d’insuline après extinction génique, en concordance avec la littérature. Par ailleurs, nous avons pu mettre en évidence quatre gènes de susceptibilité au diabète de type 2 (PRC1, SRR, ZFAND3 et ZFAND6) montrant une baisse significative de la sécrétion d’insuline après extinction génique et dont la présence ou la fonction dans la cellule β était pour l’heure inconnue. Les analyses RNA-seq ont montré une association significative de l’extinction de ces gènes avec des réseaux moléculaires liés à la physiopathologie du diabète de type 2 (par exemple : l’apoptose des cellules pancréatiques, l’insulinémie, la glycolyse, le stress du réticulum endoplasmique…). Et l’évaluation de l’expression de nos quatre gènes dans des îlots de souris obèses (ob/ob) ou traitées à la streptozotocine a montré une corrélation positive de leur expression avec celle de l’insuline. Notre étude a démontré que les études fonctionnelles post-GWAS sont importantes et permettent de définir le lien de causalité des gènes de susceptibilité avec la maladie, et ainsi de mener à des progrès sur la compréhension de la physiopathologie de la maladie [...] / Genome-wide association studies (GWAS) have identified a plethora of single nucleotide polymorphisms (SNPs) associated with the risk of type 2 diabetes, but most often with little information about the mechanism underlying the relationship between these genetic variants associated with type 2 diabetes and the diabetic phenotype. Indeed, these SNPs are often noncoding and have a modest effect on the risk of type 2 diabetes, making difficult their functional study. At the beginning of the GWAS era, it has been suggested that susceptibility genes for type 2 diabetes are strongly involved in pancreatic β cell gene function, while no functional studies had been systematically performed. In this context, we conducted a “fishing” study to decipher this large amount of data generated by GWAS and to pinpoint potentially important genes that may be new therapeutic targets. The first objective of my thesis was to study the expression of type 2 diabetes susceptibility genes in a panel of human tissues comprising pancreatic and insulin-sensitive tissues using an unbiased technique of quantification of genes expression in order to show that these genes associated with type 2 diabetes were enriched in pancreatic β-cells. We then performed functional studies on the thirty mostly expressed genes in our cell model by insulin secretion tests, cell viability test, RNA sequencing (RNA-seq) and Western blotting in the human pancreatic β cell line (EndoC-βH1). These cells are able to secrete insulin in response to glucose and other secretagogues. Our goal was to study the role of these type 2 diabetes susceptibility genes in pancreatic β cell function, particularly in insulin secretion. Our expression study of type 2 diabetes susceptibility genes showed that their expression is significantly enriched in pancreatic β cells and the EndoC-βH1 cell line. For five genes associated with type 2 diabetes (TBC1D4, TCF19, KCNK16, CDKN2A and SLC30A8) with an already known presence and function in pancreatic β cell, we showed a significant variation in glucose-stimulated insulin secretion after gene silencing, in agreement with the literature. In addition, we identified four type 2 diabetes associated genes (PRC1, SRR, ZFAND3 and ZFAND6), with a significant decrease in insulin secretion after gene silencing without already know function in pancreatic β cell. RNA-seq has shown a significant association between the extinction of these genes and molecular networks related to the pathophysiology of type 2 diabetes (e.g. apoptosis of pancreatic cells, insulinemia, glycolysis, endoplasmic reticulum stress response...). The assessment of the expression of our four genes in the islets of obese mice (ob/ob) or treated with streptozotocin shows a positive correlation between their expression and the expression of insulin. Our study has shown that post-GWAS functional studies are important and can help to define the causal link between these genes and the disease, and therefore to make progress in the understanding of the pathophysiology of type 2 diabetes. This study allowed us to identify genes whose function in β cell was not anterior known and which are involved in pancreatic β cell function and the pathophysiology of type 2 diabetes.
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Étude génétique de la voie sérotonine-N-acétylsérotonine-mélatonine et de ses anomalies dans la vulnérabilité aux Troubles du Spectre Autistique (TSA) et dans la prématurité / Genetic analysis of the serotonin-N-acetylserotonin-melatonin pathway and its abnormalities in Autism Spectrum Disorders (ASD) susceptibility and in preterm birth

Benabou, Marion 08 June 2017 (has links)
Des anomalies biochimiques de la voie sérotonine-N-acétylsérotonine-mélatonine ont été observées dans les Troubles du Spectre Autistique (TSA) et la prématurité. Cependant, les mécanismes moléculaires de régulation de cette voie et les causes des anomalies biochimiques observées dans ces maladies sont encore mal connus. Afin de mieux comprendre les bases génétiques de la voie sérotonine-N-acétylsérotonine-mélatonine, nous avons utilisé une approche de génétique quantitative au travers de deux populations d’étude indépendantes, dans lesquelles des paramètres de cette voie ont été mesurés. Ces deux cohortes, composées d’une part de plus de 250 familles avec autisme et plus de 300 témoins et d’autre part, de 183 nouveau-nés dont 93 nés très prématurés, incluent ainsi des individus présentant deux situations pathologiques différentes associées à des anomalies de cette voie. Une première étude de la voie sérotonine-N-acétylsérotonine-mélatonine dans les familles avec TSA a permis d’obtenir des estimations de l’héritabilité au sens strict, allant de 0,22 pour la mélatonine à 0,72 pour la N-acétylsérotonine (NAS). Des études d’association portant dans un premier temps sur une liste de 812 gènes candidats pour la régulation de la voie sérotonine-NAS-mélatonine et dans un second temps sur tout le génome, n’ont pas permis d’identifier des variants significativement associés aux traits biochimiques. Cependant, des études d’association par gènes ont permis d’identifier trois nouveaux gènes candidats (IL21R, JMJD7 et MAPKBP1) pour la régulation de cette voie dans les familles avec TSA ainsi qu’un nouveau gène (RAET1G) dans la cohorte de nouveau-nés prématurés et témoins. Enfin une étude biochimique des phénol-sulfotransférases (PST) dans les familles avec TSA a mis en évidence une faible activité enzymatique chez 29% des patients en comparaison avec les témoins (5ème percentile). Le séquençage et le génotypage du nombre de copies des gènes de la famille SULT1A1 n’ont pas permis d’identifier des variations génétiques associées aux TSA, à l’activité PST, ou aux taux de sérotonine et de mélatonine. En conclusion, ces résultats confirment la complexité de l’architecture génétique de la voie sérotonine-NAS-mélatonine. D’autre part, ils ont permis de mettre en évidence une héritabilité élevée de cette voie et d’identifier de nouveaux gènes candidats pour comprendre la diversité inter-individuelle de cette voie chez les personnes avec TSA, les enfants prématurés et la population générale. / Biochemical abnormalities of the serotonin-N-acetylserotonin-melatonin pathway have been reported in many clinical conditions such as Autism Spectrum Disorders and preterm birth. However, molecular mechanisms underlying this pathway regulation, as well as the causes of these biochemical abnormalities remain largely unknown. The aim of this study was thus to characterize the genetic basis of the serotonin-N-acetylserotonin-melatonin pathway. To do so, we used a quantitative genetic approach in two independent populations that were previously biochemically explored for this pathway. One cohort consisted of more than 250 families with ASD and more than 300 controls and the other was composed of 183 infants including 93 very preterm newborns. Both cohorts included individuals with clinical conditions associated with disruptions of the serotonin-N-acetylserotonin-melatonin pathway. Narrow sense heritability analysis of this pathway showed relatively high estimates, ranging from 0.22 for melatonin to 0.72 for N-acetyserotonin (NAS). First, candidate-gene association studies including 812 genes related to the serotonin-NAS-melatonin pathway, then genome-wide association studies were conducted. These analyses did not identify any variant associated at the genome-wide significance level. However, a gene-based approach identified three new candidate genes (IL21R, JMJD7 and MAPKBP1) for the regulation of the pathway in families with ASD as well as one gene (RAET1G) in the cohort of preterm and term newborns. Finally, a biochemical exploration of the phenol-sulfotransferases (PST) in families with ASD revealed a decreased enzyme activity in 29% of patients compared with controls (5th percentile). SULT1A1-4 genes were then sequenced and copy number variants (CNV) were genotyped. No genetic variant could be significantly associated with PST activity, melatonin and serotonin levels, or ASD status. In conclusion, these results confirm the complexity of serotonin-NAS-melatonin pathway genetic architecture. Furthermore, this study revealed high heritability of this pathway and identified new candidate genes to understand the inter-individual variability of this pathway in ASD, preterm birth and the general population.

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