PROX1 étant un facteur de susceptibilité au diabète de type 2 (DT2), nousavons réalisé des études génétiques et moléculaires afin de comprendre son rôledans l’étiologie du DT2.Nous avons analysé l’impact de 80 SNPs de PROX1 sur des phénotypescliniques associés au DT2 dans l’étude HELENA (n=1155 adolescents) et montréque trois SNPs (rs340838, rs340837 et rs340836) sont associés à l’insulinémie àjeun. Nous avons évalué la fonctionnalité de 9 SNPs (les 3 SNPs associés et 6 SNPsen déséquilibre de liaison) en utilisant un gène rapporteur Luciférase dans descellules HepG2 et MIN6. Les allèles associés à la diminution de l’insulinémie desSNPs rs340874, rs340873 et rs340835 sont associés à une diminution del’expression du gène rapporteur Luciférase, suggérant que l’expression de PROX1est diminuée chez les individus porteurs des allèles à risque.Nous avons aussi montré que l’inhibition de l’expression de Prox1 par siRNAsdans les cellules INS-1E engendrait une diminution de 1,7 fois de la sécrétiond’insuline en réponse au glucose et qu’une concentration élevée en glucose modulaitpositivement l’expression de la protéine Prox1.Des analyses transcriptomiques réalisées dans les cellules INS-1E ont permisde montrer que certains des gènes cibles de PROX1 dans les cellules bêta sont desgènes impliqués dans des voies de sécrétion d’insuline.Enfin, nous avons également observé que l’agoniste de PPARgamma, latroglitazone, diminuait l’expression de Prox1 dans les cellules INS-1E.Ces résultats suggèrent qu’une altération de l’expression de Prox1 par desvariants cis-régulateurs pourrait conduire à une sécrétion d’insuline en réponse auglucose altérée des cellules bêta, conférant ainsi une susceptibilité au DT2. / As PROX1 is a susceptibility factor for type 2 diabetes (T2D), we conductedgenetic and molecular studies to better understand the role of PROX1 in the etiology of T2D. We assessed the impact of 80 PROX1 SNPs on T2D-related biochemical traits in the HELENA study (n=1155 adolescents) and showed that 3 SNPs (rs340838, rs340837 and rs340836) were significantly associated with fasting plasma insulin levels. We evaluated the functional impact of 9 SNPs (the 3 insulin-associated SNPs plus 6 SNPs in linkage disequilibrium) using a Luciferase reporter gene expression in HepG2 and MIN6 cells. The insulin-lowering alleles of the rs340874, rs340873 and rs340835 SNPs were associated with lower Luciferase gene expression, suggesting that PROX1 expression may be lower in individuals carrying the insulin-lowering alleles. We also showed that the knock-down of Prox1 expression by siRNA in INS-1E cells resulted in a 1.7 fold reduced glucose-stimulated insulin secretion and that high concentrations of glucose positively modulated Prox1 protein expression. Then, microarray analyses performed in INS-1E cells showed that some PROX1 target genes in the _cells are implicated in insulin secretion pathways. Finally, we observed that the PPARgamma agonist, the troglitazone, decreased Prox1 expression in INS-1E cells. Altogether, these results suggest that an altered expression of Prox1 bys cisregulators variants results in an altered -cell glucose-stimulated insulin secretion andthereby confers susceptibility to T2D.

Les affections cardiovasculaires sont des pathologies complexes résultant des interconnexions d'un grand nombre de facteurs de risque. Si l'étiologie génétique de ces affections a largement été étudiée, les variants fonctionnels à l'origine de la large héritabilité génétique des facteurs de risque cardiovasculaire et les mécanismes d'interactions gène-gène-environnement masquant ou modulant l'effet de la génétique restent à élucider.Ce mémoire présente l'étude de la génétique de facteurs de risque des pathologies cardiovasculaires : les lipides, la pression artérielle, l'haptoglobine et le facteur de croissance de l'endothélium vasculaire.Nous avons réalisé des études d'association pangénomique sur 631 enfants non apparentés issus de la cohorte STANISLAS et avons répliqué nos résultats sur près de 9 000 enfants appartenant à quatre cohortes pédiatriques et 13 300 adultes provenant de trois cohortes distinctes.Nous avons ainsi pu démontrer que certaines associations génétiques mises en évidence chez l'adulte avaient un effet observable dès l'enfance et avons discuté des outils bioinformatiques, biostatistiques et méthodologiques manquants encore aujourd'hui à l'approche pangénomique ; notamment l'intérêt des approches transcriptomiques en validation.En conclusion, lors de notre thèse, nous avons eu à la fois une démarche épidémiologique et une démarche de proposition de designs intégrés permettant de mener plus avant les investigations sur l'étiologie génétique des pathologies cardiovasculaires / Complex synergies of multiple risk factors are at the origin of cardiovascular pathologies. Their genetic etiology has been extensively investigated but many questions remain on the identification of functional variants explaining the large genetic heritability of cardiovascular risk factors and gene-gene-environment interactions hiding or modulating genetics underpinning cardiovascular physiopathology.Herein we describe our study of the genetics of cardiovascular risk factors: lipids, blood pressure, haptoglobin and vascular endothelial growth factor.We performed Genome-Wide Scan Association Studies (GWAS) on a subsample of 631 unrelated children selected in the STANISLAS cohort and replicated our results in 9,000 children from four pediatric cohorts and 13,300 adults from three different cohorts.We demonstrated that genetic associations highlighted in adults were observable in childhood and addressed the tools missing in bioinformatics, biostatistics and methodologies used in GWAS approaches, notably concerning trasncriptomic validations.In summary, during our thesis, we followed an epidemiologic approach and proposed integrated designs in order to upgrade the investigations on genetic epidemiology of cardiovascular diseases

L'asthme est un trait complexe dont le phénotype est régulé par l'interaction de nombreux gènes et de l'environnement. Étant donné sa variabilité phénotypique, plusieurs individus asthmatiques ne répondent pas à la médication disponible. La recherche de nouvelles voies biologiques impliquées dans l'asthme est donc nécessaire. Les études d'expression génomique et les études d'association génomique (GWAS) permettent d'avoir une vue d'ensemble sur les gènes impliqués dans le développement d'un phénotype sans être biaisé par les connaissances actuelles et pourraient permettre la découverte de ces nouvelles voies. Ainsi, dans la première partie de cette thèse, une étude d'expression génomique a été utilisée pour caractériser les macrophages alvéolaires des individus asthmatiques en comparaison aux individus témoins. Cette étude a permis de cibler la famille des heat shock proteins (HSP), et plus particulièrement le gène HSPD1. De plus, la comparaison des données obtenues d'une étude d'expression génomique antérieure avec celles d'une étude récente a permis de démontrer que les études d'expression génomique sont un outil de sélection pertinent pour cibler de nouveaux gènes d'intérêt. La deuxième partie de cette thèse fait suite à la première GWAS effectuée dans l'asthme. Deux études présentées dans cette thèse ont permis de valider l'association des variants de la région 17q21 avec l'asthme dans un échantillon indépendant. Elles ont également permis d'initier la compréhension du mécanisme d'action par lequel ces variants régulent l'expression de certains gènes de cette région. Des études pour définir l'implication de HSPD1 dans les fonctions du macrophage alvéolaire ainsi que pour valider l'implication des gènes GSDMB, ORMDL3 et ZPBP2 dans l'asthme sont nécessaires afin de valider leur intérêt dans la recherche sur cette pathologie. Finalement, les différents éléments présentés dans cette thèse démontrent l'intérêt des techniques génomiques pour cibler de nouvelles voies biologiques liées au développement d'un phénotype en particulier.

Pour ce projet, nous avons développé une plateforme pour l’analyse pangénomique de la méthylation de l’ADN chez le bovin qui est compatible avec des échantillons de petites tailles. Cet outil est utilisé pour étudier les caractéristiques génétiques et épigénétiques (méthylation de l'ADN) des gamètes soumis aux procédures de procréation médicalement assisitée et des embryons précoces. Dans un premier temps, une plateforme d’analyse de biopuces spécifiques pour l’étude de la méthylation de l’ADN chez l’espèce bovine a été développée. Cette plateforme a ensuite été optimisée pour produire des analyses pangénomiques de méthylation de l'ADN fiables et reproductibles à partir d’échantillons de très petites tailles telle que les embryons précoces (≥ 10 ng d'ADN a été utilisé, ce qui correspond à 10 blastocystes en expansion). En outre, cet outil a permis d’évaluer de façon simultanée la méthylation de l’ADN et le transcriptome dans le même échantillon, fournissant ainsi une image complète des profils génétiques et épigénétiques (méthylation de l’ADN). Comme preuve de concept, les profils comparatifs de méthylation de l'ADN spermatique et de blastocystes bovins ont été analysés au niveau de l'ensemble du génome. Dans un deuxième temps, grâce à cette plateforme, les profils globaux de méthylation de l'ADN de taureaux jumeaux monozygotes (MZ) ont été analysés. Malgré qu’ils sont génétiquement identiques, les taureaux jumeaux MZ ont des descendants avec des performances différentes. Par conséquent, l'hypothèse que le profil de méthylation de l'ADN spermatique de taureaux jumeaux MZ est différent a été émise. Dans notre étude, des différences significatives entre les jumeaux MZ au niveau des caractéristiques de la semence ainsi que de la méthylation de l’ADN ont été trouvées, chacune pouvant contribuer à l’obtention de performances divergentes incongrues des filles engendrées par ces jumeaux MZ. Dans la troisième partie de ce projet, la même plateforme a été utilisée pour découvrir les impacts d’une supplémentation à forte concentration en donneur de méthyle universel sur les embryons précoces bovins. La supplémentation avec de grandes quantités d'acide folique (AF) a été largement utilisée et recommandée chez les femmes enceintes pour sa capacité bien établie à prévenir les malformations du tube neural chez les enfants. Cependant, plus récemment, plusieurs études ont rapporté des effets indésirables de l’AF utilisé à des concentrations élevées, non seulement sur le développement de l'embryon, mais aussi chez les adultes. Au niveau cellulaire, l’AF entre dans le métabolisme monocarboné, la seule voie de production de S-adénosyl méthionine (SAM), un donneur universel de groupements méthyles pour une grande variété de biomolécules, y compris l’ADN. Par conséquent, pour résoudre cette controverse, une forte dose de SAM a été utilisée pour traiter des embryons produits in vitro chez le bovin. Ceci a non seulement permis d’influencer le phénotype des embryons précoces, mais aussi d’avoir un impact sur le transcriptome et le méthylome de l’ADN. En somme, le projet en cours a permis le développement d'une plateforme d'analyse de la méthylation de l'ADN à l’échelle du génome entier chez le bovin à coût raisonnable et facile à utiliser qui est compatible avec les embryons précoces. De plus, puisque c’est l'une des premières études de ce genre en biologie de la reproduction bovine, ce projet avait trois objectifs qui a donné plusieurs nouveaux résultats, incluant les profils comparatifs de méthylation de l'ADN au niveau : i) blastocystes versus spermatozoïdes ; ii) semence de taureaux jumeaux MZ et iii) embryons précoces traités à de fortes doses de SAM versus des embryons précoces non traités. / In this project, we developed a bovine genome-wide DNA methylation platform compatible with small sample size to study genetic and epigenetic (DNA methylation) makeup of ART-treated bovine gametes and early embryos. Initially, a bovine-specific array-based DNA methylation analysis platform was developed. This platform was subsequently optimized to produce reliable and reproducible genome-wide DNA methylation analysis from very small sample sizes, e.g. bovine early embryos (≥ 10 ng gDNA input, corresponding to 10 expanded blastocysts). In addition, this platform permitted concurrent assessment of both DNA methylation and transcription in the same sample, thereby providing a very complete picture of genetic and epigenetic (DNA methylation) profiles. As proof of concept, for the first time, comparative DNA methylation profiles of bovine sperm and blastocysts were analysed at a genome-wide level. Using this platform, global DNA methylation profiles of monozygotic (MZ) twin bulls were analysed. Despite being geneticially identical, MZ twin bulls consistently have different progeny performance. Therefore, it was hypothesised that the DNA methylation profile of sperm from MZ twin bulls is different. In our study, there were significant differences between MZ twin for semen end points, as well as for the sperm epigenome (DNA methylation), all of which would be expected to contribute to incongruous divergent performances of daughters sired by MZ twins.In the next part of this project, using the developed platform, impacts of supplementation of a high-concentration global methyl donor on bovine early embryos was investigated. Supplementation with large amounts of folic acid (FA) has been extensively used and recommended in pregnant women for its well-established ability to prevent neural tube defects in children. However, more recently, several studies reported adverse effects of high FA concentrations, not only on embryo development, but also in adults. At the cellular level, FA enters one-carbon metabolism, the only pathway to produce S-adenosyl methionine (SAM) as the global methyl donor for a wide variety of biomolecules, including DNA. Therefore, to address this controversy, a high dose of SAM was used to treat in vitro -produced bovine embryos. This not only affected early embryo phenotypes, but also the transcritome and genome-wide DNA methylome. Overall, the current project resulted in development of a user-friendly and cost-effective bovine genome-wide DNA methylation analysis platform, which is compatible with small cell number such as early embryos. In addition, as one of the first studies of its kind in bovine reproductive biology, this project had three objectives which yielded several novel results, including comparative genome-wide DNA methylation profiles of: i) bovine blastocysts versus sperm; ii) sperm from monozygotic twin bulls and iii) high dose SAM-treated versus non-treated bovine early embryos.

Le soya est une source importante de protéines, d'huile, de glucides, ainsi que d'autres nutriments bénéfiques, tels que des éléments minéraux. Une fonction majeure des protéines dans la nutrition est de fournir des quantités adéquates d'acides aminés. Bien qu’ils soient essentiels pour la santé humaine et la nutrition animale, les acides aminés soufrés que sont la cystéine (Cys) et la méthionine (Met) sont souvent en concentration limitée et le déterminisme génétique de leur teneur dans la graine de soya est mal caractérisé. Un autre facteur non moins important pour la qualité nutritionnelle du soya est sa teneur en éléments minéraux, laquelle affecte les caractéristiques d'utilisation finale des fractions d'huile et de protéines ainsi que la qualité des semences (germination, vigueur des jeunes plantules). Malheureusement, très peu d’attention a été portée sur les variétés canadiennes de soya en ce qui a trait à leur teneur en acides aminés soufrés ainsi qu’en éléments minéraux. L’amélioration génétique est l’une des voies les plus efficientes et économiques pour contribuer à une alimentation saine et nutritive, laquelle apporte au consommateur la quantité de nutriments nécessaires à une bonne santé. Pour que puisse se pratiquer une sélection en faveur d’une qualité nutritionnelle accrue, il faut idéalement identifier les déterminants génétiques de la teneur en divers nutriments et développer des marqueurs facilitant cette sélection. Présentement, les analyses d’association pangénomique (GWAS en anglais) constituent l’approche la plus puissante pour déterminer l’assise génétique d’un caractère. Dans les cas les plus favorables, non seulement ces analyses permettent-elles d’identifier des régions génomiques qui contrôlent en tout ou en partie les caractères étudiés, mais elles peuvent même permettre d’identifier des gènes candidats qui jouent un rôle direct dans ce déterminisme. Dans le cadre de cette thèse, nous avons souhaité déterminer l’assise génétique de composantes clés de la valeur nutritive du soya, soit la teneur en acides aminés soufrés (Cys/Met) et en quatre éléments minéraux majeurs (Ca, K, P et S). Dans les deux cas, des analyses d’association pangénomique ont été réalisées sur une collection de 137 lignées représentatives de la diversité génétique rencontrée au sein du soya canadien à maturité hâtive. Dans le premier volet, les teneurs en Cys et en Met ont été mesurées par spectroscopie proche infrarouge (NIR) sur des graines produites dans cinq environnements au total. Des données génotypiques pour 2,2 M de polymorphismes mononucléotidiques (SNP) ont été exploitées pour réaliser une analyse d’association. Dans une première phase de découverte, nous avons réussi à identifier un total de dix régions génomiques (QTL) en nous appuyons sur les phénotypes rencontrés dans deux environnements. Afin d’assurer la fiabilité ainsi que la reproductibilité de ces QTL, nous avons validé une forte majorité de ces QTL dans trois environnements additionnels. Ces QTL, dont la plupart sont inédits, nous ont permis d’identifier deux gènes candidats fort prometteurs codant pour des protéines impliquées dans la synthèse de la cystéine. Dans le deuxième volet, les teneurs en éléments minéraux ont été mesurées chez les 137 lignées à l’aide d’un spectromètre de fluorescence à rayons X (XRF) sur des grains récoltés dans cinq environnements. Les analyses d’association ont été réalisées avec le même jeu de données génotypiques (2,2 M de SNP) que dans le volet précédant. Huit QTL significativement associés à la teneur en Ca, K, P et S ont été identifiés de manière robuste à l’aide d’au moins deux modèles statistiques différents (sur les trois employés). La reproductibilité de ces QTL dans trois environnements additionnels a fait l’objet d’une seconde analyse pour des fins de validation. Une forte reproductibilité de l’effet de ces régions génomiques sur ces phénotypes a été observée par la validation de sept QTL sur huit. Trois gènes candidats ont été identifié impliqués soit dans le transport ou l’assimilation de ces éléments minéraux. Par rapport aux études précédentes, la forte densité de marqueurs utilisés dans cette étude a contribué à la détection reproductible de plusieurs nouveaux loci associés à la teneur en acides aminés soufrés ou en éléments minéraux. De plus, cela a rendu possible l’identification de gènes candidats prometteurs. Les marqueurs et les gènes identifiés dans cette étude seront utiles pour l'amélioration génétique du soya à travers la sélection génétique assistée par marqueur. / Soybean is an important source of protein, oil, carbohydrates, and other beneficial nutrients, such as minerals. A major function of protein in nutrition is to provide adequate amounts of amino acids. Although essential for human health and animal nutrition, the sulfur amino acids cysteine (Cys) and methionine (Met) are often limiting and the genetic basis underlying their accumulation in soybeans seeds is poorly characterized. Another factor no less important for the nutritional quality of soybeans is its mineral content, which affects the end-use traits of both the oil and protein fractions as well as the quality of seed (germination rate, vigor of seedlings). Unfortunately, very little attention has been paid to Canadian soybean varieties in terms of their content in sulfur amino acids and important minerals in seeds. The enhancement of seed nutrient content via genetic improvement is considered as the most promising and cost-effective approach to contribute to a healthy and nutritious diet, which provides the consumer with the necessary quantity of nutrients for good health. To facilitate breeding for increased nutritional quality, it is necessary to identify the genetic determinants underlying various nutrients and to develop markers allowing this selection. Currently, genome-wide association analysis (GWAS) is the most powerful approach for determining the genetic basis of a trait. In the most favorable cases, not only do these analyses make it possible to identify genomic regions which control all or part of the trait of interest, but they can even make it possible to identify candidate genes which play a direct role in the trait of interest. The goals of this thesis were to determine the genetic basis of key components of the nutritional value of soybeans, namely the seed content in sulfur amino acids (Cys / Met) and four major mineral elements (Ca, K, P and S). In both cases, a GWAS was performed on a collection of 137 lines representative of the genetic diversity encountered in early-maturing Canadian soybeans. In part 1, Cys and Met content were measured using near infrared spectroscopy (NIR) on seed from five environments in total. Genotypic data for 2.2 M single nucleotide polymorphisms (SNPs) were used to perform an association analysis. In an initial discovery phase based on the data from two environments, we were able to identify a total of ten genomic regions (QTL), most of which were identified for the first time. To ensure the reliability and reproducibility of these QTLs, we validated a large majority of these in three additional environments. These QTLs allowed us to identify two candidate genes, both of which code for proteins involved in cysteine synthesis. In part 2, mineral content was measured in seed of the same 137 lines using an X-ray fluorescence spectrometer (XRF) harvested from five environments in total. The association analyses were carried out with the same genotypic data set (2.2 M SNP) as in part 1. Eight QTLs significantly associated with the Ca, K, P and S content were identified by at least two of the three statistical models used. These QTLs were found to be highly reproducible as they influenced the studied traits in three additional environments. Indeed, seven of the eight QTLs were validated in this fashion. For these QTLs regions, we were able to identify thee candidate gene annotated as being involved in the transport or the assimilation of these mineral elements. Compared to previous studies, the high density of markers used in this study has contributed to the reproducible detection of several new loci associated with the content of sulfur amino acids or mineral elements. In addition, it has made it possible to identify promising candidate genes. The markers and genes identified in this study will be useful for the genetic improvement of soybeans through marker-assisted selection.

Les récentes technologies génomiques à haut-débit ont ouvert la voie aux études d'association visant la caractérisation systématique à l'échelle du génome des facteurs génétiques impliqués dans l'apparition des maladies génétiques complexes, telles que l'asthme et le diabète. Dans ces études, le déséquilibre de liaison (linkage disequilibrium, LD) reflète l'existence de dépendances complexes au sein des données génétiques et joue un rôle central, puisqu'il permet une localisation précise des facteurs génétiques. Néanmoins, la haute complexité du LD, ainsi que la dimension élevée des données génétiques, constituent autant de difficultés à prendre en compte. Les travaux de recherche réalisés au cours de cette thèse se sont placés dans cette perspective. La contribution des travaux de recherche présentés est double, puisqu'elle est à la fois théorique et appliquée. Sur le plan théorique, nous avons proposé une nouvelle approche de modélisation du LD. Elle est basée sur le développement d'un modèle issu du domaine de l'intelligence artificielle et de l'apprentissage automatique, la forêt de modèles hiérarchiques à classes latentes (FMHCL). Les nouveautés les plus significatives introduites sont la possibilité de prendre en compte la nature floue du LD et de hiérarchiser les différents degrés de LD. Un nouvel algorithme d'apprentissage supportant le passage à l'échelle, nommé CFHLC, a été développé et décliné en deux versions: la première nécessitant le découpage du génome en fenêtres contiguës pour résoudre le problème de passage à l'échelle, et la seconde (CFHLC+), plus récente et évoluée, résolvant le problème au moyen d'une fenêtre glissante sur le chromosome. A l'aide d'un jeu de données réelles, la comparaison de la méthode CFHLC avec des méthodes concurrentes a montré qu'elle offre une modélisation plus fine du LD. En outre, l'apprentissage sur des données présentant des patrons de LD variés a démontré la capacité de la FMHCL a reproduire fidèlement la structure du LD. Enfin, l'analyse empirique de la complexité de l'apprentissage a montré la linéarité en temps lorsque le nombre de variables à traiter augmente. Sur le plan appliqué, nous avons exploré deux pistes de recherche: la recherche de causalités et la visualisation synthétique et intuitive du LD. D'une part, une étude systématique de la capacité des FMHCL à la recherche de causalités est illustrée dans le contexte de la génétique d'association. Ce travail a établi les bases du développement de nouvelles méthodes de recherche dédiées à la découverte de facteurs génétiques causaux pour les études d'association à l'échelle du génome. D'autre part, une méthode a été développée pour la visualisation synthétique et intuitive du LD adaptée aux trois principales situations que peut rencontrer le généticien: la visualisation du LD de courte distance, de longue distance et dans un contexte pangénomique. Cette nouvelle méthode apporte des atouts majeurs qui sont les suivants: (i) le LD par paires (deux variables) et le LD multilocus (deux variables ou plus) sont simultanément visualisés, (ii) le LD de courte distance et le LD de longue distance sont facilement distingués, et (iii) l'information est synthétisée de manière hiérarchique.

Les démences regroupent un ensemble de pathologies cérébrales affectant progressivement les fonctions cognitives et survenant plus fréquemment chez les personnes âgées. L’augmentation du nombre de cas liée au vieillissement de la population et la lourdeur de la prise en charge font des démences un problème de santé publique important.La maladie d’Alzheimer (MA) est la plus fréquente des démences. Elle apparaît généralement après 65 ans et possède une forte composante génétique. En dehors de certaines formes familiales précoces liées à des mutations dans les gènes du précurseur de la protéineamyloïde, et des présénilines 1 et 2, la grande majorité des cas résulte de l’interaction de facteurs environnementaux avec divers gènes de susceptibilité.L’approche gène candidat a permis l’identification de nombreux gènes associés au risquede MA. Cependant, en raison de problèmes techniques et méthodologiques, seul le gène de l’apoprotéine E (APOE) a pu être identifié de manière robuste par cette approche. Les études d’association pangénomiques permettent d’identifier sans a priori des variations génétiques fréquentes associées à une maladie sur l’ensemble du génome. À partir de 2009, plusieurs consortia ayant pour objectif de réaliser ce type d’étude dans le champs de la MA ont identifiéquatre nouveaux gènes d’intérêt pour la MA, CLU, PICALM, CR1 et BIN1. Cependant,ces gènes n’expliquent qu’une petite partie de la variabilité génétique de la maladie et denombreux autres variants restent à découvrir.Durant cette thèse, nous avons d’abord chercher à répliquer les résultats des principauxgènes identifiés par approche gène candidat en utilisant les données du consortium EuropeanAlzheimer’s Disease Initiative (EADI). Nous avons pu montrer qu’une grande partie deces gènes présentait un faible niveau d’association avec la MA. En utilisant l’approche pangénomique,nous avons ensuite pu identifier 19 gènes associés au risque de MA en dehorsd’APOE, dont 11 n’ayant pas été identifiés par les précédentes études, via la mise en placed’une collaboration informelle entre consortia puis au sein du International Genomics ofAlzheimer’s Disease Project (IGAP).Nous nous sommes également interessés à plusieurs phénotypes intermédiaires associésà la MA, et en particulier aux taux plasmatiques des peptides amyloïde b (Ab), en partantde l’hypothèse qu’ils pourraient permettre la recherche de variants impliqués dans des mécanismesphysiopathologiques pré-symptomatiques. Ce travail a permis l’identification d’uneassociation potentielle entre le gène CTXN3 et les taux plasmatiques d’Ab1−42.En conclusion, l’utilisation des études d’association pangénomiques a permis d’identifierde nombreux nouveaux gènes associés au risque de MA. Ces gènes ouvrent des voies derecherche intéressantes pour mieux comprendre la physiopathologie de la MA et permettrele développement de traitements efficaces qui font actuellement défaut. / Dementia is a syndrom caused by several brain diseases progressively deteriorating cognitivefunctions and occurs more frequently in the elderly. The increased number of patients withdementia due to the ageing of the general population and the high cost of care add up tomake dementia a concerning public health issue.Alzheimer’s disease (AD) is the most common form of dementia. It is often diagnosedafter 65 years old and has a strong genetic component. Familial forms exist and are mainlycaused by mutations in the amyloid-b protein precursor, presenilin 1 and presenilin 2 genes.However, the vast majority of cases result from the complex interaction of environmental factors with susceptibility genes.Using a candidate gene approach, numerous genes associated with AD risk were identified,but due to technical and methodological problems, only the apoliprotein E (APOE) genewas replicated. Genome-wide association studies (GWAS) aim to identify frequent geneticvariants associated with disease risk in a hypothesis-free manner. Starting 2009, severalconsortia aiming to perform this type of analyses in the field of AD robustly identified fournew genes associated with AD risk, CLU, PICALM, CR1 and BIN1. However, these genes puttogether only explain a small proportion of the total genetic variance of AD and the searchfor new susceptibility genes remains an important goal for AD research.In this work, we first tried to replicate the results of the top genes reported using thecandidate gene approach, using GWAS data from the European Alzheimer’s Disease Initiative(EADI). Most of these genes showed weak levels of association. Using GWAS, we were ableto identify 19 new genes associated with AD risk besides APOE, including 11 that had notbeen reported by previous studies, first through an informal collaboration between consortia,then under the name of International Genomics of Alzheimer’s Disease Project (IGAP).Assuming that use of endophenotypes related to AD would be relevant for the discoveryof genetic variants involved in the early pathophysiology of AD, we then performed aGWAS of plasma amyloid-b (Ab) concentrations. This study showed suggestive asssociationsbetween the CTXN3 gene on chromosome 5 and Ab1−42 plasma levels.To sum up, using GWAS enabled us to identify new genes associated with AD risk. Thesegenes point to interesting new research hypotheses and hopefully, to a better understandingof AD pathophysiology and development of effective drugs.

Chaque année en Europe, quelques 70.000 nouveaux patients requièrent un traitement permanent dans le cadre d'une insuffisance rénale terminale. Dans le même temps, on réalise environ 20.000 greffes, laissant quantité de patients en dialyse. Le taux de survie en dialyse est médiocre (2/3 à 3/4 moindre que chez les sujets non dialysés des mêmes âges) ce qui rend le problème de la disponibilité des greffons parfaitement criant. La pénurie de greffons est directement liée à leur survie limitée: 10 ans en valeur médiane et en l'absence de censure pour la mort des patients, ou bien 15 ans si l'on se limite à regarder les pertes de greffes liées à des causes intrinsèques. Plus de 60% des greffons sont perdus des suites de lésions de rejet chronique. Dans ce contexte, nous avons choisi de nous intéresser à de très rares patients, découverts fortuitement, qui en dépit de l'arrêt de leurs immunosuppresseurs pour diverses raisons, maintiennent pendant une durée prolongée d'au moins 1 an, une bonne fonction de leur greffon. Ces patients, tout en étant bien portants, semblent être devenus sélectivement incapables de monter une réaction inflammatoire, à tout le moins destructrice, à l'encontre de leur greffon. On dit qu'ils sont "opérationnellement tolérants". En pratique, ils disposent d'un rein allogénique qu'ils ne rejettent pas mais sans avoir à subir les conséquences néfastes et redoutables des immunosuppresseurs (infections, cancers, diabète, hypertension artérielle, ). Comprendre et maîtriser la tolérance opérationnelle ouvrirait la voie à des transplantations plus durables et plus sûres. Plusieurs études transcriptomiques, mécanistiques et épigénétiques laissent penser que la tolérance opérationnelle repose sur l'expansion de populations cellulaires régulatrices au sein des répertoires alloréactifs, aux dépends des cellules effectrices. Ces équilibresfins seraient maintenus grâce à une série de modifications épigénétiques (microARN, méthylations) assurant une stabilité relative au phénotype. Malgré notre meilleure compréhension des mécanismes responsables de l'homéostasie de la tolérance, ses mécanismes causaux restent à ce jour inconnus.Nous avons émis l'hypothèse que la tolérance requerrait une prédisposition génétique pour pouvoir s'installer, concrètement: que les patients tolérants se distinguent du reste de la population par un excès de variants à haute pénétrance localisés dans les exons de gènes jouant un rôle critique dans le développement de la dite tolérance.Pour valider cette thèse, nous avons, dans un premier temps:- contribué à montrer, au travers de la première étude pangénomique d'association ("GWAS") validée sur le rejet aigu d'allogreffe rénale que le génome des receveurs influençait les réponses alloimmunes, hors du système HLA.- réuni la plus grande cohorte de patients tolérants sur le territoire européen à ce jour composée de 22 patients de la biocollection l'université de Nantes et de 18 patients identifiés prospectivement dans le cadre d'une étude dédiée; TOMOGRAM,- montré que la tolérance était associée à une survie prolongée des greffons,- montré qu'il s'agissait d'une découverte rare, identifiée par les cliniciens chez seulement 0.03% de leurs patients greffés et sans condition prédisposante patente.Dans un second temps, nous avons- séquencé les exomes de 40 patients tolérants et les avons comparés à ceux de 209 contrôles in-house,- filtré nos données selon notre hypothèse de travail et circonscrit un ensemble de variants exoniques moyennement à hautement pathogènes (au total 84.643, répartis dans 16.343 gènes),- comparé les distributions de variants (par gène; par variant) chez les cas et chez les contrôles, à l'aide du test aSKAT-O; un test basé sur une analyse de la variance et ajusté pour les petits échantillons.Nos résultats immédiats ont été soumis à 3 contrôles: une correction pour les hypothèses multiples (FDR 0.05); des interventions pour repérer d'éventuelles stratifications (notamment d'après une analyse en composantes principales ou PCA) et enfin; l'examen soigneux des variants retenus dans les fichiers post-alignement (BAM).Au terme de ce processus, nous n'avons pas pu identifier de variant ou de gène ségréguant avec la tolérance. Nous concluons que la prédisposition à la tolérance repose peu vraisemblablement sur une hérédité monogénique simple et homogène ("mendélienne"). D'autres données, en ce compris nos propres travaux sur les déterminants génétiques du rejet aigu de greffe, nous encouragent à rechercher des causes génétiques plus complexes. De nouvelles études d'association tirant parti du séquençage génome-entier et exploitant des cohortes plus larges sont requises. / Doctorat en Sciences médicales (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La Maladie Thrombo-Embolique Veineuse (MTEV) est une maladie dont les facteurs de risque sont à la fois environnementaux et génétiques. Les facteurs de risque génétiques bien établis sont les déficits en anti-thrombine, en protéine S, en protéine C, la mutation du Facteur V de Leiden (FVL), la mutation du Facteur (F) II G20210A, ainsi que le gène ABO dont les allèles A1 et B augmentent le risque de MTEV par rapport aux allèles A2 et O. Alors qu'une part importante de l'héritabilité de la MTEV reste inexpliquée, les études contemporaines se heurtent à un manque de puissance pour découvrir de nouveaux facteurs génétiques dont les effets sont de plus en plus faibles. En vue d'augmenter la puissance de détection de nouveaux gènes de susceptibilité à la MTEV, j'ai recherché les déterminismes génétiques de deux de ses phénotypes intermédiaires : les taux d'activité plasmatique du FVIII et les taux d'antigénémie de sa protéine de transport, le Facteur de von Willebrand (vWF). Dans un premier temps, j'ai réalisé une analyse de liaison des taux de FVIII et de vWF à partir d'un échantillon de cinq grandes familles franco-canadiennes (totalisant 255 personnes) recrutées via un cas de MTEV avec mutation FVL. Quatre régions liées aux taux de FVIII et/ou vWF ont été identifiées. L'une de ces régions correspondait au locus du gène ABO déjà connu pour influencer les taux de FVIII et vWF. La recherche de gènes candidats au sein des autres signaux de liaison s'est effectuée par l'étude in silico d'une analyse d'association pangénomique de la MTEV incluant 419 cas et 1228 témoins. Deux gènes candidats ont été identifiés : STAB2 et BAI3. J'ai ensuite réalisé des études d'associations de cinq polymorphismes de BAI3. L'un d'entre eux était d'une part associé à une élévation des taux de vWF (résultat obtenu dans un échantillon de 108 familles nucléaires en bonne santé et reproduit dans un échantillon de 916 patients non apparentés atteints de MTEV), et d'autre part associé au risque de survenue de MTEV parmi les sujets non porteurs de mutations FVL et FII de deux échantillons cas-témoins (respectivement 916 cas et 801 témoins, et 250 cas et 607 témoins). Quant à STAB2, durant le courant de ma thèse, deux de ces polymorphismes ont été décrits comme associés aux taux de FVIII et vWF au cours d'une vaste étude d'association pangénomique (GWAS) menée par le consortium CHARGE rassemblant 23 600 personnes. Dans un second temps, j'ai réalisé une méta-analyse de trois GWAS des taux de FVIII et vWF. Ces analyses avaient été conduites avec l'échantillon des cinq grandes familles franco-canadiennes et deux échantillons de 972 et 570 patients atteints de MTEV. Elles étaient ajustées sur les polymorphismes du gène ABO permettant de distinguer les allèles A1, A2, B et O, dans l'optique d'augmenter la puissance des analyses en diminuant la variance résiduelle des phénotypes. Aucun polymorphisme n'était associé ni aux taux de vWF ni à ceux de FVIII après prise en compte de la correction de Bonferroni pour tests multiples (p<10-7). Cependant, parmi les onze gènes qui présentaient des polymorphismes associés aux taux de vWF ou de FVIII avec une significativité p<10-5, de manière intéressante se trouvait STAB2. Cette étude a de plus permis de confirmer les associations nouvellement découvertes de polymorphismes situés dans les gènes VWF, STXBP5 et STX2.

La maladie de Crohn (MC) et la colite ulcéreuse (CU) sont des maladies inflammatoires chroniques du tube digestif qu’on regroupe sous le terme maladies inflammatoires de l’intestin (MII). Les mécanismes moléculaires menant au développement des MII ne sont pas entièrement connus, mais des études génétiques et fonctionnelles ont permis de mettre en évidence des interactions entre des prédispositions génétiques et des facteurs environnementaux - notamment la flore intestinale – qui contribuent au développement d’une dérégulation de la réponse immunitaire menant à l’inflammation de la muqueuse intestinale. Des études d’association pangénomiques et ciblées ont permis d’identifier plusieurs gènes de susceptibilité aux MII mais les estimations de la contribution de ces gènes à l’héritabilité suggèrent que plusieurs gènes restent à découvrir. Certains d’entre eux peuvent se trouver dans les régions identifiées par des études de liaison génétique. L’objectif de mon projet de doctorat était d’identifier un ou des facteurs de risque génétique dans la région chromosomale 19p (identifiée comme région de liaison IBD6) et de le/les caractériser au niveau fonctionnel. Nous avons d’abord entrepris une cartographie d’association de la région 19p. À la suite du génotypage successif de deux cohortes indépendantes, nous avons identifié un SNP intronique et quatre SNP codants dont un non-synonyme, rs8108738, tous localisés dans le gène microtubule associated serine threonine kinase gene-3 (MAST3) et associés aux MII. Peu d’information fonctionnelle sur MAST3 était disponible. Par contre MAST2, une protéine encodée par un gène de la même famille, régule l’activité du facteur de transcription inflammatoire NF-kappaB. Nous avons confirmé l’implication de MAST3 dans l’activité de NF-kappaB via un knockdown de MAST3 et des essais gène-rapporteur. Pour poursuivre la caractérisation fonctionnelle de MAST3, nous avons choisi une approche non ciblée pour étudier les effets de la variation des niveaux d’expression de MAST3 sur la cellule. C’est-à-dire que nous avons créé un 1er modèle cellulaire de surexpression du gène MAST3 dans les cellules HEK293 et analysé l’expression pangénomique endogène. La validation de l’expression génique dans un 2e modèle cellulaire de knockdown et de type cellulaire différent (THP1), nous a permis d’identifier et de contrer les effets non-spécifiques dus aux niveaux non-physiologiques. Notre étude d’expression a mené à l’identification d’un groupe de gènes dont l’expression est régulée par MAST3. Ces gènes sont majoritairement impliqués dans des fonctions immunitaires (cytokines pro-inflammatoires, régulateurs de NF-kappaB, migration cellulaire, etc.) et une forte proportion est régulée par NF-kappaB. Nous avons évalué l’importance du groupe de gènes régulés par MAST3 dans la présentation clinique des MII à travers des études d’expression dans des biopsies intestinales de patients atteints de CU. Nous avons constaté que l’expression de ces gènes est significativement supérieure dans les régions enflammées par rapport aux régions saines de la muqueuse intestinale des patients atteints de CU. Globalement, les résultats de nos études suggèrent que le facteur de risque aux MII MAST3 agit via la voie du facteur de transcription NF-kappaB pour influencer l’expression d’un groupe de gènes impliqués dans l’inflammation intestinale typique des MII. Chaque étude génétique sur les MII a le potentiel d’orienter les recherches fonctionnelles vers de nouvelles voies biologiques causales. Le dévoilement des mécanismes moléculaires sous-jacents à ces voies permet d’augmenter les connaissances sur le développement de ces maladies vers une compréhension plus complète de la pathogenèse qui permettra d’optimiser le diagnostic et le traitement de ces maladies. / Inflammatory bowel diseases (IBD) refer to different chronic inflammatory diseases of the digestive tract mainly Crohn’s disease (CD) and ulcerative colitis (UC). Mechanisms leading to the pathogenesis of IBD are not completely understood, but genetic and functional studies have highlighted interactions between genetic predispositions and environmental factors, such as the intestinal microbiota, as contributors to the deregulation of the immune response that leads to inflammation of the intestinal mucosa. Genome-wide and targeted association studies have identified several IBD susceptibility genes. However, estimations of the contribution of these genes to heritability of the disease suggest that more are to be discovered. Some of these genes may be in previously identified IBD linkage regions. The objective of my doctoral project was first, to identify risk factors in the 19p chromosomal region (IBD6), previously identified following a genome-wide linkage study, then to characterise them functionally. We first performed a comprehensive association mapping study of the 19p region. Our two-stage genotyping strategy led to the identification of one intronic SNP and four coding SNP –including one non-synonymous SNP, rs8108738 – all located in the microtubule associated serine threonine kinase gene 3 (MAST3) and associated to IBD. Very limited functional information on MAST3 was available at that time. However MAST2 (a gene in the same family as MAST3), is involved in the regulation of inflammation master switch, transcription factor NF-B. We confirmed the involvement of MAST3 in the modulation of NF-B via a knockdown of MAST3 and gene reporter assays. In order to further characterize the function of MAST3, we chose a non-targeted approach to study the effects of the modulation of MAST3 levels on the cell. More specifically, we created a 1st cell model of MAST3 overexpression in HEK293 cells and analysed the resulting genome-wide endogenous gene expression. Validation in a 2nd cell model consisting of a knockdown of MAST3 in THP1 cells, allowed to identify non-specific gene expression due to non-physiological MAST3 levels. Our expression study led to the identification of a group of genes whose expression is modulated by MAST3. These genes are mainly involved in immune functions (pro-inflammatory cytokines, NF-B regulation, cellular migration, etc) and a majority is regulated by transcription factor NF-B. We evaluated the importance of this MAST3-regulated gene set in the clinical manifestation of IBD through an expression study on biopsies of UC patients. We found that the expression the MAST3-regulated gene set was significantly enriched in inflamed region of the intestinal mucosa of UC patients compared to healthy region. Taken together, the results of our study suggest that IBD risk factor MAST3 acts on the NF-B pathway to influence the expression of a group of genes involved in intestinal inflammation typical of IBD. Every genetic study on IBD has the potential to lead functional research towards new causal biological pathways. The unravelling of the molecular mechanisms underlying these pathways aims to improve the comprehension of the pathogenesis of IBD and hopefully will allow for optimization of diagnostic and treatment of these diseases.