Dentre as espécies do gênero Yersinia, Yersinia enterocolitica é a espécie mais prevalente como causa de doença em humanos e animais. Y. enterocolitica é dividida em seis biotipos. Os biotipos 1B, 2, 3, 4 e 5 compreendem linhagens associadas à doença em humanos e animais, enquanto o biotipo 1A consiste de linhagens consideradas não patogênicas. Apesar de Y. enterocolitica biotipo 2 ser de importância clínica, há uma escassez de estudos no país, o que dificulta avaliar o envolvimento dessa bactéria como causa de doença em humanos e em animais, bem como, determinar o impacto de sua presença no meio-ambiente. O objetivo deste trabalho foi investigar o potencial patogênico, determinar o perfil de suscetibilidade a antimicrobianos e verificar a diversidade genotípica de linhagens de Y. enterocolitica biotipo 2 isoladas no Brasil. Foram estudadas 40 linhagens de Y. enterocolitica biotipo 2, isoladas de humanos (5), ambiente (34) e animal (1), entre os anos de 1979 e 1998. Ademais, nas análises filogenéticas, foram acrescidas 26 linhagens de Y. enterocolitica pertencentes aos outros biotipos, com o intuito de comparar as linhagens de Y. enterocolitica biotipo 2 aos biotipos 1A, 1B, 3, 4 e 5. As linhagens de humanos e animal foram sensíveis a todos os 14 antimicrobianos testados. Dentre as 34 linhagens de ambiente, sete (20,6%) foram resistentes a um ou dois antimicrobianos, sendo esses, amicacina, cefoxitina, gentamicina, e sulfametoxazol - trimetoprima. Todas as linhagens apresentaram os genes inv, ail, ystA, hreP, tccC e myfA. Os genes fepD e fes foram detectados em 39 (97,5%) linhagens, o gene virF foi encontrado em três (7,5%) linhagens, os genes ystB e fepA não foram detectados em nenhuma linhagem. Todas as linhagens apresentaram comportamento relacionado à virulência frente aos testes fenotípicos de atividade da pirazinamidase, hidrólise da esculina e fermentação da salicina. O dendrograma de similaridade genética de Enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR (ERIC-PCR) agrupou as linhagens de Y. enterocolitica biotipo 2 em cinco grupos denominados A, B, C, D e E. Todas as linhagens, com exceção de duas, apresentaram similaridade genética superior a 88,3%. O dendrograma de similaridade genética de Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) agrupou as linhagens de Y. enterocolitica biotipo 2 em três grupos denominados I, J e K. A maioria das linhagens (72,5%) apresentou similaridade ii genética superior a 78,3%. O dendrograma de similaridade genética de Multilocus variable number tandem repeat analysis (MLVA) agrupou as linhagens de Y. enterocolitica biotipo 2 em dois grupos denominados O e P com similaridade genética superior a 37,7%. Pode-se concluir que o potencial patogênico das linhagens de Y. enterocolitica biotipo 2 foi evidenciado pela prevalência da maioria dos marcadores de virulência, bem como, pelo comportamento relacionado à virulência frente aos testes fenotípicos pesquisados. Algumas linhagens apresentaram-se resistentes a antimicrobianos de primeira escolha no tratamento de yersiniose, o que pode acarretar em falha terapêutica. Os resultados de ERIC-PCR e PFGE mostraram a alta similaridade entre as linhagens de Y. enterocolitica biotipo 2, sugerindo que as mesmas pouco se diferenciaram ao longo dos 19 anos e que possivelmente o meio ambiente tem sido uma fonte de contaminação para humanos e animais no Brasil. A técnica de MLVA agrupou as linhagens de Y. enterocolitica biotipo 2 quanto à sua origem e a técnica de ERIC-PCR agrupou as linhagens de Y. enterocolitica biotipos 1A, 1B, 2, 3, 4, e 5 quanto às diferentes patogenicidades características de cada biotipo. / Among the species of the genus Yersinia, Yersinia enterocolitica is the most prevalent species that cause illness in humans and animals. Y. enterocolitica is divided into six biotypes. Biotypes 1B, 2, 3, 4 e 5 comprise strains associated to illness in humans and animals, while biotype 1A comprise strains considered nonpathogenic. Despite of the fact that Y. enterocolitica biotype 2 is of clinical importance, there is a paucity of studies in this country, which makes difficult to assess the involvement of this bacteria as a cause of illness in humans and animals, as well as to determine the impact of its presence in the environment. The aim of this work was to investigate the pathogenic potential, to determine the antimicrobial resistance profile and to verify the genetic diversity of Y. enterocolitica biotype 2 strains isolated in Brazil. Forty strains of Y. enterocolitica biotype 2 isolated from humans (5), environment (34) and animal (1), between 1979 and 1998 were studied. Besides, in the phylogenetic analyzes it was added 26 Y. enterocolitica strains belonging to the other biotypes, in order to compare the Y. enterocolitica biotype 2 strains to biotypes 1A, 1B, 3, 4 e 5. Humans and animals strains showed susceptibility to all 14 antibiotics tested. Among the 34 environment strains, seven (20.6%) were resistant to one or two antibiotics used such as amikacin, cefoxitin, gentamicin and sulfamethoxazole-trimethoprim. All the strains presented the genes inv, ail, ystA, hreP, tccC and myfA. Genes fepD and fes were detected in 39 (97.5%) strains, virF was found in three (7.5%) strains, and ystB and fepA were not detected in any strains. All the strains exhibited behavior related to virulence against the phenotypic tests of pyrazinamidase activity, esculin hydrolysis and salicin fermentation. The dendrogram of genetic similarity of Enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR (ERIC-PCR) grouped the Y. enterocolitica biotype 2 strains in five groups, designated A, B, C, D and E. All the strains, except two, showed a genetic similarity of more than 88.3%. The dendrogram of genetic similarity of Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) grouped the Y. enterocolitica biotype 2 strains in three groups, designated I, J and K. The majority of the strains (72.5%) showed a genetic similarity of more than 78.3%. The dendrogram of genetic similarity of Multilocus variable number tandem repeat analysis (MLVA) grouped the Y. enterocolitica iv biotype 2 strains in two groups, designated O and P with a genetic similarity of more than 37.7%. It is possible to conclude that the pathogenic potential of the Y. enterocolitica biotype 2 strains was highlighted by the prevalence of the majority of the virulence markers searched, as well as by the behavior related to virulence against the phenotypic tests. Some strains were resistant to antimicrobials that are the first choice for yersiniosis treatment, which can result in therapeutic failure. The results of ERIC-PCR and PFGE showed a high genetic similarity between the Y. enterocolitica biotype 2 strains, suggesting that the strains differed little over 19 years, and that the environment has been possibly a source of humans and animals infections in Brazil. The MLVA technique grouped the Y. enterocolitica biotype 2 strains according their origins, and the ERIC-PCR technique grouped the Y. enterocolitica biotypes 1A, 1B, 2, 3, 4 and 5 strains according to the different pathogenicity characteristics of each biotype.

Dentre as 18 espécies do gênero Yersinia, as espécies Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis e Y. pestis foram extensivamente caracterizadas em diversos aspectos como ecologia, epidemiologia e mecanismos de patogenicidade. Sete das 15 espécies restantes (Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. mollaretii e Y. rohdei), usualmente conhecidas como Y. enterocolitica-like, até o momento, não tiveram seu potencial patogênico caracterizado e são, geralmente, consideradas não-patogênicas. Entretanto, dados da literatura sugerem que algumas dessas espécies possam causar doença. Esses dados estimularam o surgimento de questões sobre os mecanismos pelos quais as espécies de Y. enterocolitica-like possam interagir com as células do hospedeiros e causar doenças. Esse projeto teve como principal objetivo caracterizar o potencial patogênico de linhagens de Y. enterocolitica-like, especificamente das espécies Y. frederiksenii, Y. kristensenii e Y. intermedia. No presente trabalho, o potencial patogênico de 118 linhagens de Y. enterocolitica-like (50 Y. frederiksenii, 55 Y. intermedia e 13 Y. kristensenii) foi avaliado pela pesquisa da presença dos genes relacionados à virulência ail, fepA, fepD, fes, hreP, myfA, tccC, ystA, ystB e virF por PCR. Além disso, a habilidade de algumas linhagens de Yersinia de aderir e invadir células Caco-2 e HEp-2 após diferentes períodos de incubação, bem como, de sobreviver no interior de macrófagos humanos U937 foi testada. Aspectos morfológicos da adesão bacteriana foram visualizados por microscopia eletrônica. Finalmente, a presença de possíveis novos mecanismos de virulência foi avaliada a partir do sequenciamento de RNA de uma linhagem de Y. enterocolitica-like. As linhagens estudadas apresentaram os seguintes genes: Y. frederiksenii, fepA (44%), fes (44%) e ystB (18%); Y. intermedia, ail (53%), fepA (35%), fepD (2%), fes (97%), hreP (2%), ystB (2%) e tccC (35%); e Y. kristensenii, ail (62%), ystB (23%), fepA (77%), fepD (54%), fes (54%) e hreP (54%). De modo geral, as linhagens de Y. enterocolitica-like tiveram a habilidade de aderir e invadir células Caco-2 e HEp-2 inferior à da linhagem altamente patogênica Y. enterocolitica 8081. Contudo, Y. kristensenii FCF 410 e Y. frederiksenii FCF 461 apresentaram elevado potencial de invasão a células Caco-2 após cinco dias de pré-incubação, os quais foram 45 e 7,2 vezes maiores do que o controle Y. enterocolitica 8081, respectivamente, porém, o gene ail não foi detectado nessas linhagens. O ensaio de sobrevivência em macrófagos humanos U937 ii mostrou que as linhagens de Y. frederiksenii FCF 461 (40,0%) e Y. frederiksenii FCF 379 (24,6%) tiveram porcentagens de sobrevivência superior à de Y. enterocolitica 8081 (13,4%). Todavia, linhagens de Y. intermedia e Y. kristensenii apresentaram uma capacidade reduzida de sobreviver em macrófagos. A microscopia eletrônica de varredura mostrou as bactérias em contato com a filipódia celular. As bactérias foram distribuídas tanto individualmente quanto em pequenos aglomerados. Portanto, podemos concluir que a presença dos genes relacionados à virulência encontrados nas Y. enterocolitica-like estudadas indicou o possível potencial patogênico de algumas dessas linhagens. Os ensaios de adesão e invasão a células de mamíferos sugerem que a patogenicidade de Y. kristensenii e Y. frederiksenii possa ser linhagem-dependente. O ensaio de sobrevivência em macrófagos humanos U937 evidenciou o potencial patogênico de algumas linhagens de Y. frederiksenii. Em conjunto, os resultados obtidos sugerem a existência de mecanismos de virulência alternativos aos mecanismos clássicos descritos para Y. enterocolitica patogênica. Contudo, a presença de possíveis novos mecanismos de virulência não pode ser verificada, uma vez que a plataforma 454 GS Junior (Roche) não se mostrou adequada para a realização de sequenciamento de RNA de amostras provenientes de interações com células devido à baixa cobertura obtida. / Among the 18 species of the Yersinia genus, Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis and Y. pestis were extensively characterized in different subjects as ecology, epidemiology and pathogenicity mechanisms. Seven among the remaining 15 species (Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. mollaretii and Y. rohdei), often called Y. enterocolitica-like have not their pathogenic potential characterized and are usually considered to be nonpathogenic. However, literature data suggest that some of these species can cause diseases. These data stimulate the upsurge of questions about the mechanisms of which Y. enterocolitica-like species may interact with host cells and cause diseases. The main objective of this preject was to characterize the pathogenic potential of Y. enterocolitica-like strains, specifically of the species Y. frederiksenii, Y. kristensenii and Y. intermedia. This work evaluated the pathogenic potential of 118 Y. enterocolitica-like strains (50 Y. frederiksenii, 55 Y. intermedia and 13 Y. kristensenii) searching for the presence of the virulence-related genes ail, fepA, fepD, fes, hreP, myfA, tccC, ystA, ystB and virF by PCR. Besides, Yersinia strains ability of adhesion and invasion to Caco-2 and HEp-2 cells after different pre-incubation periods, and its survival within human macrophages U937 were tested. Morphologic aspects of bacterial adhesion were observed by scanning electronic microscopy. Finally, the presence of new possible virulence mechanisms was evaluated through RNA sequencing of one Y. enterocolitica-like strain. The studied strains showed the following genes: Y. frederiksenii, fepA (44%), fes (44%) and ystB (18%); Y. intermedia, ail (53%), fepA (35%), fepD (2%), fes (97%), hreP (2%), ystB (2%) and tccC (35%); and Y. kristensenii, ail (62%), ystB (23%), fepA (77%), fepD (54%), fes (54%) and hreP (54%). Usually Y. enterocolitica-like strains presented less ability of adhere and invade Caco-2 and HEp-2 cells than the highly pathogenic strain Y. enterocolitica 8081. On the other hand, Y. kristensenii FCF 410 and Y. frederiksenii FCF 461 showed high potential of invasion in Caco-2 cells after 5 days of pre-incubation, which were 45 and 7.2 times higher than the control Y. enterocolitica 8081 respectively, but ail gene was not found in these strains. Survival assay in human macrophages U937 showed that Y. frederiksenii FCF 461 (40.0%) and Y. frederiksenii FCF 379 (24.6%) strains presented survival percentages higher than Y. enterocolitica 8081 (13.4%). However, Y. intermedia and Y. iv kristensenii strains showed a reduced capability of surviving in macrophages. Scanning electron microscopy showed bacteria at the surface in contact with the cellular filopodia. The bacteria were distributed either individually or in small clumps. Therefore, it may be concluded that the presence of virulence-related genes in some of the Y. enterocolitica-like strains indicated their possible pathogenic potential. Mammal cells adhesion and invasion assays suggest that the pathogenicity of Y. kristensenii and Y. frederiksenii may be strain-dependent. Human macrophages U937 surviving assay highlighted the pathogenic potential of some Y. frederiksenii strains. Together, the results suggest the existence of alternative virulence mechanisms other than the classical mechanisms described for pathogenic Y. enterocolitica. However, we could not verify the presence of possible new virulence mechanisms because 454 GS Junior (Roche) platform was not suitable for RNA sequencing of strains from cells interaction due its low coverage obtained.

Dentre as 18 espécies do gênero Yersinia, as espécies Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis e Y. pestis foram extensivamente caracterizadas em diversos aspectos como ecologia, epidemiologia e mecanismos de patogenicidade. Sete das 15 espécies restantes (Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. mollaretii e Y. rohdei), usualmente conhecidas como Y. enterocolitica-like, até o momento, não tiveram seu potencial patogênico caracterizado e são, geralmente, consideradas não-patogênicas. Entretanto, dados da literatura sugerem que algumas dessas espécies possam causar doença. Esses dados estimularam o surgimento de questões sobre os mecanismos pelos quais as espécies de Y. enterocolitica-like possam interagir com as células do hospedeiros e causar doenças. Esse projeto teve como principal objetivo caracterizar o potencial patogênico de linhagens de Y. enterocolitica-like, especificamente das espécies Y. frederiksenii, Y. kristensenii e Y. intermedia. No presente trabalho, o potencial patogênico de 118 linhagens de Y. enterocolitica-like (50 Y. frederiksenii, 55 Y. intermedia e 13 Y. kristensenii) foi avaliado pela pesquisa da presença dos genes relacionados à virulência ail, fepA, fepD, fes, hreP, myfA, tccC, ystA, ystB e virF por PCR. Além disso, a habilidade de algumas linhagens de Yersinia de aderir e invadir células Caco-2 e HEp-2 após diferentes períodos de incubação, bem como, de sobreviver no interior de macrófagos humanos U937 foi testada. Aspectos morfológicos da adesão bacteriana foram visualizados por microscopia eletrônica. Finalmente, a presença de possíveis novos mecanismos de virulência foi avaliada a partir do sequenciamento de RNA de uma linhagem de Y. enterocolitica-like. As linhagens estudadas apresentaram os seguintes genes: Y. frederiksenii, fepA (44%), fes (44%) e ystB (18%); Y. intermedia, ail (53%), fepA (35%), fepD (2%), fes (97%), hreP (2%), ystB (2%) e tccC (35%); e Y. kristensenii, ail (62%), ystB (23%), fepA (77%), fepD (54%), fes (54%) e hreP (54%). De modo geral, as linhagens de Y. enterocolitica-like tiveram a habilidade de aderir e invadir células Caco-2 e HEp-2 inferior à da linhagem altamente patogênica Y. enterocolitica 8081. Contudo, Y. kristensenii FCF 410 e Y. frederiksenii FCF 461 apresentaram elevado potencial de invasão a células Caco-2 após cinco dias de pré-incubação, os quais foram 45 e 7,2 vezes maiores do que o controle Y. enterocolitica 8081, respectivamente, porém, o gene ail não foi detectado nessas linhagens. O ensaio de sobrevivência em macrófagos humanos U937 ii mostrou que as linhagens de Y. frederiksenii FCF 461 (40,0%) e Y. frederiksenii FCF 379 (24,6%) tiveram porcentagens de sobrevivência superior à de Y. enterocolitica 8081 (13,4%). Todavia, linhagens de Y. intermedia e Y. kristensenii apresentaram uma capacidade reduzida de sobreviver em macrófagos. A microscopia eletrônica de varredura mostrou as bactérias em contato com a filipódia celular. As bactérias foram distribuídas tanto individualmente quanto em pequenos aglomerados. Portanto, podemos concluir que a presença dos genes relacionados à virulência encontrados nas Y. enterocolitica-like estudadas indicou o possível potencial patogênico de algumas dessas linhagens. Os ensaios de adesão e invasão a células de mamíferos sugerem que a patogenicidade de Y. kristensenii e Y. frederiksenii possa ser linhagem-dependente. O ensaio de sobrevivência em macrófagos humanos U937 evidenciou o potencial patogênico de algumas linhagens de Y. frederiksenii. Em conjunto, os resultados obtidos sugerem a existência de mecanismos de virulência alternativos aos mecanismos clássicos descritos para Y. enterocolitica patogênica. Contudo, a presença de possíveis novos mecanismos de virulência não pode ser verificada, uma vez que a plataforma 454 GS Junior (Roche) não se mostrou adequada para a realização de sequenciamento de RNA de amostras provenientes de interações com células devido à baixa cobertura obtida. / Among the 18 species of the Yersinia genus, Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis and Y. pestis were extensively characterized in different subjects as ecology, epidemiology and pathogenicity mechanisms. Seven among the remaining 15 species (Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. mollaretii and Y. rohdei), often called Y. enterocolitica-like have not their pathogenic potential characterized and are usually considered to be nonpathogenic. However, literature data suggest that some of these species can cause diseases. These data stimulate the upsurge of questions about the mechanisms of which Y. enterocolitica-like species may interact with host cells and cause diseases. The main objective of this preject was to characterize the pathogenic potential of Y. enterocolitica-like strains, specifically of the species Y. frederiksenii, Y. kristensenii and Y. intermedia. This work evaluated the pathogenic potential of 118 Y. enterocolitica-like strains (50 Y. frederiksenii, 55 Y. intermedia and 13 Y. kristensenii) searching for the presence of the virulence-related genes ail, fepA, fepD, fes, hreP, myfA, tccC, ystA, ystB and virF by PCR. Besides, Yersinia strains ability of adhesion and invasion to Caco-2 and HEp-2 cells after different pre-incubation periods, and its survival within human macrophages U937 were tested. Morphologic aspects of bacterial adhesion were observed by scanning electronic microscopy. Finally, the presence of new possible virulence mechanisms was evaluated through RNA sequencing of one Y. enterocolitica-like strain. The studied strains showed the following genes: Y. frederiksenii, fepA (44%), fes (44%) and ystB (18%); Y. intermedia, ail (53%), fepA (35%), fepD (2%), fes (97%), hreP (2%), ystB (2%) and tccC (35%); and Y. kristensenii, ail (62%), ystB (23%), fepA (77%), fepD (54%), fes (54%) and hreP (54%). Usually Y. enterocolitica-like strains presented less ability of adhere and invade Caco-2 and HEp-2 cells than the highly pathogenic strain Y. enterocolitica 8081. On the other hand, Y. kristensenii FCF 410 and Y. frederiksenii FCF 461 showed high potential of invasion in Caco-2 cells after 5 days of pre-incubation, which were 45 and 7.2 times higher than the control Y. enterocolitica 8081 respectively, but ail gene was not found in these strains. Survival assay in human macrophages U937 showed that Y. frederiksenii FCF 461 (40.0%) and Y. frederiksenii FCF 379 (24.6%) strains presented survival percentages higher than Y. enterocolitica 8081 (13.4%). However, Y. intermedia and Y. iv kristensenii strains showed a reduced capability of surviving in macrophages. Scanning electron microscopy showed bacteria at the surface in contact with the cellular filopodia. The bacteria were distributed either individually or in small clumps. Therefore, it may be concluded that the presence of virulence-related genes in some of the Y. enterocolitica-like strains indicated their possible pathogenic potential. Mammal cells adhesion and invasion assays suggest that the pathogenicity of Y. kristensenii and Y. frederiksenii may be strain-dependent. Human macrophages U937 surviving assay highlighted the pathogenic potential of some Y. frederiksenii strains. Together, the results suggest the existence of alternative virulence mechanisms other than the classical mechanisms described for pathogenic Y. enterocolitica. However, we could not verify the presence of possible new virulence mechanisms because 454 GS Junior (Roche) platform was not suitable for RNA sequencing of strains from cells interaction due its low coverage obtained.