acase@tulane.edu / Peptides and peptide nucleic acids (PNAs) have long been recognized as promising tools and potential therapeutics. Yet the cell membrane remains a significant barrier to their intracellular targets. Conjugation to cell penetrating peptides like pTat48-60 (tat) and pAntp43-68 (penetratin) facilitates delivery, however delivery efficiencies remain low. Improving the performance of known cell penetrating peptides by rational design is hindered by the lack of explicit design principles. Instead, here we use synthetic molecular evolution to generate and screen a cell penetrating peptide library containing 8,192 tat/penetratin hybrid peptides to identify sequences with improved ability to deliver a splice correcting PNA sequence. The parent sequences poorly deliver PNA to cells; however, at 5M peptide-PNA, the top performing PNA conjugated Delivery Peptide (PDEP) daughter sequence showed an 80-fold increase over PNA only treated cells in properly spliced luciferase mRNA and 33-fold higher standardized luminescence values than the top performing parent sequence penetratin. The PDEPs identified in this study are effective in multiple cell types, and also deliver a peptide cargo to cells. The capabilities of the PDEPs make them a valuable research tool for delivery of membrane impermeable PNA or peptide sequences. This dramatic improvement in performance following a single iteration of synthetic molecular evolution is an indication of the power of this approach to peptide sequence optimization. / 1 / William Berkeley Kauffman

Clomiphene citrate (CC) is the leading treatment for women with anovulatory infertility. The precise mechanism of action of the drug on the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis has yet to be determined. Neurons expressing kisspeptin, neurokinin B (NKB) and dynorphin A (Dyn), collectively called KNDy neurons, in the arcuate nucleus (ARC) of the hypothalamus have been shown to play an integral role in the estradiol (E2) feedback pathways of the reproductive system in mammals. KNDy neurons are found in the ARC and the anteroventral periventricular nucleus (AVPV) in humans but have been predominantly reported to not express NKB and Dyn in rodents. The axons of these neurons project to the medial eminence (ME) in the region where the gonadotropin-releasing hormone (GnRH) terminals and fibres are located. It was hypothesised that CC upregulates the gene expression of kisspeptin and neurokinin B while down-regulating the gene expression of dynorphin A which results in a leutenizing hormone surge and an increase in oestradiol which causes ovulation. This was a randomized experiment which included 18 female Sprague-Dawley rats in which the aim was to analyse the expression of kisspeptin, NKB and Dyn in the ARC and the AVPV as well as blood plasma levels of oestradiol and leutinizing hormone (LH) in female rats after CC administration. Six of the rats constituted the control group that received a vehicle solution. The second group of 6 rats received the intervention in the form of CC and the third group of six rats received CC as well as p234-penetratin, a kisspeptin antagonist (KpA). The mRNA expression of the KNDy genes were analysed using real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) and the plasma levels of E2 and LH were analysed by enzyme-linked immunosorbant assays (ELISA). ELISA results show that the E2 concentration in the group that received CC plus KpA was found to be marginally lower than that of the control group but there was no significant difference between the E2 concentrations of the control group and the group that received only CC. The LH concentration in the group that received CC plus KpA was significantly higher than both other groups but again, there was no significant difference between the LH concentration control group and the group that only received CC. The qPCR showed that in the AVPV, the kisspeptin expression of the CC group and the CC plus KpA groups are marginally higher than that of the control group. Conversely, the Dyn expression of the CC group and the CC plus KpA groups are marginally lower than that of the control group in the AVPV. There were no significant differences in NKB expression across the three groups. In the ARC, there were no significant differences in kisspeptin or Dyn expression across the groups. The NKB expression of the CC group was marginally lower than that of the control and there was no significant difference between the CC plus KpA group and the control group. In summary, CC appears to have a marginal effect on the kisspeptin and Dyn mRNA via the positive feedback systems in the rat AVPV as well as a significant decrease of NKB mRNA via the negative feedback systems in the ARC. To increase the validity of similar future studies, higher sample sizes, different drug administration doses, possibly more precise surgical techniques and more accurate age determination methods or ovariectomised rats could be used. / Dissertation (MSc)--University of Pretoria, 2016. / Physiology / MSc / Unrestricted

Die Rasterionenleitfähigkeitsmikroskopie (scanning ion conductance microscopy, SICM) stellt eine kontaktfreie Methode zur Ermittlung sowohl der Topographie als auch lokalen Ionenleitfähigkeit einer Oberfläche dar. Besonders vorteilhaft ist die Vermeidung mechanischer Beeinflussung bei der Untersuchung flexibler Strukturen, z.B. Lipiddoppelschichten wie Zellen oder künstlich erzeugter Lipidmembranen. Porenüberspannende Membranen (pore-suspending membranes, PSMs) verbinden als ein Beispiel für Modellsysteme eine hohe Stabilität mit lateraler Mobilität und dem Vorhandensein wässriger Kompartimente ober- und unterhalb der Doppelschicht, wie sie auch in der Natur gefunden werden. Ein wichtiges Forschungsgebiet stellt die Untersuchung der Wechselwirkung von Peptiden, besonders zellpenetrierenden Peptiden (cell penetrating peptides, CPPs), mit Lipiden und anderen Membranbestandteilen dar. Häufig untersuchte Beispiele sind Melittin, Hauptbestandteil des Giftes der Honigbiene Apis mellifera, sowie Penetratin, dritte Helix der Antennapedia Homöodomäne von Drosophila melanogaster. Generalisierte Protokolle zur Herstellung lösungsmittelfreier PSMs werden vorgestellt. Riesige unilamellare Vesikel (giant unilamellar vesicles, GUVs) unterschiedlicher Lipidzusammensetzung wurden hierzu auf porösem Siliziumnitrid (Si3N4), welches mit Cholesterylpolyethylenoxythiol (CPEO3, hydrophob) bzw. Mercaptoethanol (ME, hydrophil) funktionalisiert worden war, gespreitet. Verwendet wurden GUVs aus reinen Phosphatidylcholin (PC)-Lipiden sowie aus Mischungen von PC-Lipiden mit Cholesterol und PC-Lipiden mit Phosphatidylserin (PS)-Lipiden. Der Erfolg des Spreitvorgangs wurde durch Abbilden mittels konfokaler Rasterlasermikroskopie (confocal laser scanning microscopy, CLSM) und SICM verifiziert. Der Hauptteil dieser Arbeit behandelte die Entwicklung und Anwendung CLSM- und SICM-basierter CPP-Titrationsassays zur Aufklärung des Einflusses der Substratfunktionalisierung und der Lipidzusammensetzung der Membranen auf die Wechselwirkung zwischen Melittin bzw. Penetratin und den Lipiddoppelschichten. CLSM-Experimente wurden mit Melittin auf allen zur Verfügung stehenden PSMs sowohl auf hydrophob als auch hydrophil funktiona-lisierten Substraten durchgeführt, während Penetratin auf den drei unterschiedlichen PSMs auf hydrophil funktionalisierten Substraten verwendet wurde. Ein Reißen der Membranen wurde im Fall hydrophil funktionalisierter Substrate für beide Peptide im Bereich von 1–3 µM beobachtet. Bei hydrophob funktionalisierten Substraten induzierte eine dreifach geringere Melittinkonzentration die Zerstörung der Membranen. Sowohl auf hydrophob als auch auf hydrophil funktionalisierten Substraten wurde bei einem Cholesterolanteil von 10% eine Erhöhung der zum Reißen notwendigen Melittinkonzentratin erhalten, während bei 20% PS-Anteil eine Verschiebung zu geringeren Konzentrationen evident wurde. SICM-Experimente wurden mit Melittin auf PC/Cholesterol-PSMs auf hydrophob und hydrophil funktionalisierten Substraten und mit reinen PC-PSMs auf hydrophil funktionalisierten Membranen durchgeführt. Es wurden keine signifikanten Konzentrationsunterschiede beobachtet; die gefundenen Konzentrationsbereiche jedoch stimmten mit denen der CLSM-Experimente überein. Darüberhinaus wurde vor dem Reißen der Membranen ein Ansteigen der Porentiefe gefunden, das mit einer erhöhten Membranpermeabilität korrespondiert.