Os eventos celulares e extracelulares que ocorrem durante o processo de osseointegração do titânio (Ti) são influenciados pelas propriedades físicas e químicas de sua superfície. Modificações bioquímicas de topografias complexas de Ti permitem o desenvolvimento de novas superfícies de implantes funcionalizadas com moléculas bioativas, visando a promover a osteogênese de contato e a osseointegração. O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos, sobre a osteogênese in vitro, da funcionalização de microtopografia de Ti com concentrações distintas de peptídeo sintético análogo a uma seqüência de amino-ácidos do colágeno tipo I, relacionada a adesão e diferenciação celulares. Células osteogênicas primárias derivadas de calvárias de ratos foram plaqueadas sobre superfícies de Ti: 1) usinada e lixada (Usinado); 2) com microtopografia (Plus); 3) Plus com recobrimento de hidroxiapatita (Plus+HA); 4) Plus+HA, com baixa concentração de P-15 (P-15 low); 5) Plus+HA, com alta concentração de P-15 (P-15 high). Por períodos de até 21 dias, foram avaliados: morfologia celular e estágios de adesão e espraiamento celulares; viabilidade celular, proporção de células no ciclo celular e número total de células; imunolocalização de proteínas da matriz extracelular não-colágena; expressão de marcadores do fenótipo osteoblástico por reação em cadeia da polimerase em tempo real (Real-time PCR); atividade de fosfatase alcalina (ALP); proporção de células em apoptose e formação de matriz mineralizada. Avaliaram-se, também, os aspectos topográficos das superfícies, por microscopia eletrônica de varredura (MEV) de alta resolução, e o molhamento de superfície, pelo método da gota séssil. As superfícies Plus modificadas apresentavam camada superficial constituída por agregados de material acicular, os quais eram menos evidentes em P-15 high. Todas as superfícies eram hidrofóbicas, sendo que a funcionalização com P-15 proporcionava tendência à hidrofilicidade em equilíbrio. Após 4 h, observou-se que as superfícies com microtopografia apresentavam menor proporção de células nos estágios 3 e 4 de espraiamento quando comparadas com o Usinado (p<0,05). A viabilidade celular por MTT demonstrou valores maiores para as superfícies Plus modificadas aos 3 dias (p<0,05). Em 1 dia, acúmulos extracelulares de osteopontina (OPN) foram evidentes apenas sobre Plus+HA, P-15 low e P-15 high, com maior extensão em 3 dias. Em 7 dias, áreas imunomarcadas para sialoproteína óssea (BSP) eram menos extensas sobre Plus e Plus+HA. Para os grupos com microtopografia, foram observados valores de RNAm: menores para RUNX2 em 7 dias em comparação ao Usinado; para fosfatase alcalina (ALP), maiores em 10 se comparados a 7 dias; menores para BSP e maiores para OPN em 7 e 10 dias, quando comparados ao Usinado. Em 10 dias, observou-se redução significante (p<0,05) na atividade de ALP nas superfícies com microtopografia em comparação ao Usinado. Aos 14 dias, formações nodulares típicas de matriz mineralizada, marcadas para BSP em sua periferia, foram observadas apenas nos grupos Usinado e Plus. No entanto, a quantificação do vermelho de Alizarina (ARS) revelou valores maiores para as culturas sobre superfícies Plus modificadas em 14 e 21 dias (p<0,05). Concluiu-se que a microtopografia de Ti Plus, nanoestruturada com HA para funcionalização de P-15, altera o processo de aquisição do fenótipo osteogênico in vitro, resultando no aumento da formação de matriz calcificada, em padrão predominantemente diferente ao de típicas formações nodulares observadas sobre superfícies planas na microescala. / Surface functionalization of metallic surfaces with bioactive molecules has been developed aiming to promote specific cellular response at biomaterial-tissue interface. The present study evaluated the effects of surface functionalization of a microstructured titanium (Ti) surface with a synthetic peptide (P-15) analogue of the cell-binding domain of collagen I on key parameters of the progression of the osteogenic phenotype in vitro. Calvaria-derived osteogenic cells were plated on Ti disks: i) Machined; ii) with microtopography (Plus); iii) Plus with hydroxyapatite coating (Plus+HA); iv) Plus+HA with a low concentration of P-15 (P-15 low); v) Plus+HA with a high concentration of P-15 (P-15 high). High resolution SEM analysis showed that Plus exhibited a complex microtopography. In addition, a superficial layer of nano-sized needle-shaped HA was noticed for all modified Plus surfaces, although less apparent for P-15 high. Whereas all surfaces were hydrophobic at time zero, biofunctionalization showed a tendency to hydrophilicity at equilibrium. At 4 hours, Plus and modified Plus surfaces exhibited a lower proportion of spread osteogenic cells. At day 3, cells were less spread on the microtopographies, showing long cytoplasmic extensions. Epifluorescence revealed a large extracellular OPN accumulation for modified Plus surfaces. Although at day 3 cell viability was higher for modified Plus surfaces, at day 7 no major differences were detected among groups. Real time PCR showed for Plus and modified Plus surfaces: i) lower levels for RUNX2 at day 7 and for BSP at days 7 and 10, and higher OPN levels at days 7 and 10 compared with Machined; ii) higher ALP levels at day 10 compared with day 7. At day 10, Plus and modified Plus surfaces showed lower ALP activity compared with Machined. At days 14 and 21, higher proportions of Alizarin red stained areas were detected for cultures grown on modified Plus surfaces. The modification of Ti Plus surface by means of HA coating and functionalization with peptide P-15 alters the osteogenic potential of osteoblastic cell cultures, leading to an enhancement in mineralized matrix formation.

Os eventos celulares e extracelulares que ocorrem durante o processo de osseointegração do titânio (Ti) são influenciados pelas propriedades físicas e químicas de sua superfície. Modificações bioquímicas de topografias complexas de Ti permitem o desenvolvimento de novas superfícies de implantes funcionalizadas com moléculas bioativas, visando a promover a osteogênese de contato e a osseointegração. O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos, sobre a osteogênese in vitro, da funcionalização de microtopografia de Ti com concentrações distintas de peptídeo sintético análogo a uma seqüência de amino-ácidos do colágeno tipo I, relacionada a adesão e diferenciação celulares. Células osteogênicas primárias derivadas de calvárias de ratos foram plaqueadas sobre superfícies de Ti: 1) usinada e lixada (Usinado); 2) com microtopografia (Plus); 3) Plus com recobrimento de hidroxiapatita (Plus+HA); 4) Plus+HA, com baixa concentração de P-15 (P-15 low); 5) Plus+HA, com alta concentração de P-15 (P-15 high). Por períodos de até 21 dias, foram avaliados: morfologia celular e estágios de adesão e espraiamento celulares; viabilidade celular, proporção de células no ciclo celular e número total de células; imunolocalização de proteínas da matriz extracelular não-colágena; expressão de marcadores do fenótipo osteoblástico por reação em cadeia da polimerase em tempo real (Real-time PCR); atividade de fosfatase alcalina (ALP); proporção de células em apoptose e formação de matriz mineralizada. Avaliaram-se, também, os aspectos topográficos das superfícies, por microscopia eletrônica de varredura (MEV) de alta resolução, e o molhamento de superfície, pelo método da gota séssil. As superfícies Plus modificadas apresentavam camada superficial constituída por agregados de material acicular, os quais eram menos evidentes em P-15 high. Todas as superfícies eram hidrofóbicas, sendo que a funcionalização com P-15 proporcionava tendência à hidrofilicidade em equilíbrio. Após 4 h, observou-se que as superfícies com microtopografia apresentavam menor proporção de células nos estágios 3 e 4 de espraiamento quando comparadas com o Usinado (p<0,05). A viabilidade celular por MTT demonstrou valores maiores para as superfícies Plus modificadas aos 3 dias (p<0,05). Em 1 dia, acúmulos extracelulares de osteopontina (OPN) foram evidentes apenas sobre Plus+HA, P-15 low e P-15 high, com maior extensão em 3 dias. Em 7 dias, áreas imunomarcadas para sialoproteína óssea (BSP) eram menos extensas sobre Plus e Plus+HA. Para os grupos com microtopografia, foram observados valores de RNAm: menores para RUNX2 em 7 dias em comparação ao Usinado; para fosfatase alcalina (ALP), maiores em 10 se comparados a 7 dias; menores para BSP e maiores para OPN em 7 e 10 dias, quando comparados ao Usinado. Em 10 dias, observou-se redução significante (p<0,05) na atividade de ALP nas superfícies com microtopografia em comparação ao Usinado. Aos 14 dias, formações nodulares típicas de matriz mineralizada, marcadas para BSP em sua periferia, foram observadas apenas nos grupos Usinado e Plus. No entanto, a quantificação do vermelho de Alizarina (ARS) revelou valores maiores para as culturas sobre superfícies Plus modificadas em 14 e 21 dias (p<0,05). Concluiu-se que a microtopografia de Ti Plus, nanoestruturada com HA para funcionalização de P-15, altera o processo de aquisição do fenótipo osteogênico in vitro, resultando no aumento da formação de matriz calcificada, em padrão predominantemente diferente ao de típicas formações nodulares observadas sobre superfícies planas na microescala. / Surface functionalization of metallic surfaces with bioactive molecules has been developed aiming to promote specific cellular response at biomaterial-tissue interface. The present study evaluated the effects of surface functionalization of a microstructured titanium (Ti) surface with a synthetic peptide (P-15) analogue of the cell-binding domain of collagen I on key parameters of the progression of the osteogenic phenotype in vitro. Calvaria-derived osteogenic cells were plated on Ti disks: i) Machined; ii) with microtopography (Plus); iii) Plus with hydroxyapatite coating (Plus+HA); iv) Plus+HA with a low concentration of P-15 (P-15 low); v) Plus+HA with a high concentration of P-15 (P-15 high). High resolution SEM analysis showed that Plus exhibited a complex microtopography. In addition, a superficial layer of nano-sized needle-shaped HA was noticed for all modified Plus surfaces, although less apparent for P-15 high. Whereas all surfaces were hydrophobic at time zero, biofunctionalization showed a tendency to hydrophilicity at equilibrium. At 4 hours, Plus and modified Plus surfaces exhibited a lower proportion of spread osteogenic cells. At day 3, cells were less spread on the microtopographies, showing long cytoplasmic extensions. Epifluorescence revealed a large extracellular OPN accumulation for modified Plus surfaces. Although at day 3 cell viability was higher for modified Plus surfaces, at day 7 no major differences were detected among groups. Real time PCR showed for Plus and modified Plus surfaces: i) lower levels for RUNX2 at day 7 and for BSP at days 7 and 10, and higher OPN levels at days 7 and 10 compared with Machined; ii) higher ALP levels at day 10 compared with day 7. At day 10, Plus and modified Plus surfaces showed lower ALP activity compared with Machined. At days 14 and 21, higher proportions of Alizarin red stained areas were detected for cultures grown on modified Plus surfaces. The modification of Ti Plus surface by means of HA coating and functionalization with peptide P-15 alters the osteogenic potential of osteoblastic cell cultures, leading to an enhancement in mineralized matrix formation.