Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-07-13T21:05:49Z No. of bitstreams: 1 2018_JoãoMarcosFagundesSilva.pdf: 4954356 bytes, checksum: 88a85bcc1a6bb8a6887d391ccdd77444 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-07-14T19:12:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_JoãoMarcosFagundesSilva.pdf: 4954356 bytes, checksum: 88a85bcc1a6bb8a6887d391ccdd77444 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-14T19:12:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_JoãoMarcosFagundesSilva.pdf: 4954356 bytes, checksum: 88a85bcc1a6bb8a6887d391ccdd77444 (MD5) Previous issue date: 2018-07-13 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). / As tecnologias de sequenciamento em larga escala permitem a caracterização genômica das comunidades virais presentes em tecidos vegetais e animais e em amostras ambientais com alta sensibilidade e acurácia. Devido ao sequenciamento simultâneo de várias sequências genômicas, essa técnica também permite o estudo da alta diversidade genética intra-hospedeiro apresentada pelos vírus de RNA. Nesse trabalho, estudamos e estabelecemos um pipeline para a análise de viroma em planta utilizando o modelo de pepino, reportamos a descoberta de dois novos vírus em videiras, Grapevine enamovirus1 (GEV-1) e Grapevine virga-like virus (GVLV). Após ensaios de amplificação rápida das extremidades do cDNA (rapid amplification of cDNA ends – RACE) da extremidade 5' do genoma do GEV-1, foi descrito a sequência genômica quase completa desse vírus (6227 bp), possibilitando a sua classificação como um membro do gênero Enamovirus (família Luteoviridae) com base na sua organização genômica, estudos filogenéticos e critérios estabelecidos pelo Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus (International Committee on Taxonomy of Viruses – ICTV). Entretanto, o genoma do GVLV permanece parciamente sequenciado em duas partes: um contig de 3348 bp que contém os domínios metiltransferase (Met) e helicase (Hel); e um contig de 1272 bp que corresponde à RNA polimerase dependente de RNA (RdRp) parcial. Com base em estudos filogenéticos não foi possível classificar esse vírus, que mostra baixa identidade com ambas as famílias Virgaviridae e Bromoviridae. Adicionalmente, esse trabalho apresenta um estudo da diversidade genética intra-hospedeiro dos vírus associados ao enrolamento da folha da videira (Grapevine leafroll-associated virus – GLRaV), com foco na poliproteína dos GLRaV-2 e -3 (gêneros Closterovirus e Ampelovirus, respectivamente), assim como a detecção in silico de uma molécula defectiva de RNA do GLRaV-4 (Ampelovirus), a partir de dados gerados por HTS. As populações intra-hospedeiro encontradas em dois isolados de GLRaV-2 mostraram apenas 11 polimorfismos de único nucleotídeo (single nucleotide polymorphisms – SNPs) em comum (~14% dos SNPs em cada isolado). A diversidade intra-hospedeiro encontrada em dois isolados de GLRaV-3 foi baixa se comparada com os isolados de GLRaV-2. / High-throughput sequencing technologies allow for the genomic characterization of viral communities present in plant and animal tissues and environmental samples with high accuracy and sensibility. The simultaneous sequencing of various genomic sequences by this technique also makes it useful for the study of the high intrahost genetic diversity presented by RNA viruses. In this work, we studied and established the conditions of analysis of plant virome using the cucumber model, the discovery of two novel grapevine viruses, Grapevine enamovirus-1 (GEV-1) and Grapevine virga-like virus (GVLV). After rapid amplification of cDNA ends (RACE) assays of the 5' end of GEV-1 genome, we obtained the near full genomic sequence of this virus (6227 bp), enabling its classification as a member of the genus Enamovirus (family Luteoviridae) based on its genomic properties, phylogenetic studies and criteria stablished by the International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV). However, the genome of GVLV remains only partially sequenced, separated in two parts: a 3348 bp contig containing the methyltranferase (Met) and helicase (Hel) domains; and a 1272 bp contig which corresponds to the partial RNA dependent RNA polimerase (RdRp). Based on phylogenetic studies, were not able to classify this novel virus, which shows low identity with viruses in the families Virgaviridae and Bromoviridae. Additionally, this works presents a study on the intrahost genetic diversity of Grapevine leafroll-associated viruses (GLRaVs), focusing on the polyprotein of GLRaV-2 and -3 (genera Closterovirus and Ampelovirus, respectively), as well as an in silico detection of a defective RNA molecule of GLRaV-4 (Ampelovirus). The intrahost population of two isolates of GLRaV-2 showed only 11 single nucleotide polymorphisms (SNPs) in common (~14 of the SNPs found on each isolate). The intrahost genetic diversity found on two isolates of GLRaV3 was low compared to GLRaV-2.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-05-12T16:45:26Z No. of bitstreams: 1 2015_FrederickMendesAguiar.pdf: 1843726 bytes, checksum: 4fb24b86358626af48318bf95c8540c0 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-05-24T21:25:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_FrederickMendesAguiar.pdf: 1843726 bytes, checksum: 4fb24b86358626af48318bf95c8540c0 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-24T21:25:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_FrederickMendesAguiar.pdf: 1843726 bytes, checksum: 4fb24b86358626af48318bf95c8540c0 (MD5) / A macha-alvo, causada pelo fungo Corynespora cassiicola, tornou-se uma das mais importantes doenças da parte aérea do tomateiro e pepineiro em diversas regiões produtoras do Brasil e do mundo nos últimos anos. Além do tomate e pepino, este fungo apresenta uma grande diversidade de hospedeiras sendo relatado em mais de 350 espécies de plantas, distribuídas por mais de 80 países. Os isolados deste fungo também apresentam uma grande diversidade morfológica, principalmente em relação à coloração da colônia, tamanho e formato dos conídios, dificultando ainda mais sua identificação e caracterização. Outra dificuldade relacionada à mancha-alvo é a ausência de cultivares comerciais resistentes e de fungicidas recomendados para o tomate e o pepino no Brasil, sendo um grande desafio para seu controle. Em função dos problemas apresentados, esta tese teve como objetivo investigar a variabilidade genética, morfométrica e patogênica entre isolados de Corynespora de diferentes plantas hospedeiras e regiões geográficas e verificar in vitro a sensibilidade micelial de isolados de Corynespora a diferentes fungicidas. Na caracterização molecular todos os isolados avaliados foram identificados como pertencentes à espécie C. cassiicola. Quanto à distribuição e a resolução intraespecífica dos isolados avaliados, as sequências obtidas das regiões genômicas ITS e fator de elongação 1-α apresentaram limitada resolução intraespecífica dos isolados quanto à hospedeira de origem e região geográfica de coleta nas respectivas árvores filogenéticas. Já a árvore filogenética com as sequências do gene β-tubulina apresentou melhor distribuição dos isolados quanto à hospedeira de origem, com formação de dois clados distintos, cada um representado em sua maioria por isolados provenientes da cultura do tomate e do pepino. Os treze isolados de C. cassiicola utilizados na caracterização morfométrica apresentaram grande variabilidade quanto à cor da colônia, com a ocorrência de seis diferentes cores; quanto à textura micelial, os isolados dividiram em sete com textura fina e seis com textura cotonosa; e quanto ao formato da colônia, com predominância da forma poligonal. A taxa de crescimento micelial foi de 6,05 mm/d. As dimensões dos conídios variaram de 7,39 a 386,05 μm de comprimento, 5,8 a 14,08 μm de largura e 0 a 24 para o número de pseudoseptos. Os três isolados de C. cassiicola avaliados confirmaram patogenicidade às suas hospedeiras de origem. Somente oito espécies de plantas avaliadas não apresentaram suscetibilidade aos isolados. Após caracterização molecular, morfométrica e patogênica dos isolados de C. cassiicola avaliados, concluiu-se que, exceto para a região β-tubulina, nenhuma relação entre a hospedeira de origem e a região geográfica de coleta dos isolados foi estabelecida neste estudo. No teste de sensibilidade a fungicidas, em ensaios preliminares foi obtida a dose efetiva capaz de inibir o crescimento micelial de C. cassiicola em 50% (DE50). Nos resultados, os fungicidas clorotalonil e carbendazim apresentaram altos valores da DE50 para a maioria dos isolados avaliados, com média superior a 50 mg.L-1. Para o fungicida tebuconazole, os valores da DE50 variaram de 0,50 a 18,79 mg.L-1. Já para os fungicidas pyrimethanil, fludioxonil e cyprodinil, verificou-se menores valores da DE50 quando comparados aos fungicidas anteriores. Após estes ensaios, as concentrações obtidas foram de 1 mg.L-1 para o fungicida fludioxonil, 3 mg.L-1 para cyprodinil, 5 mg.L-1 para boscalid e fluopyram, 10 mg.L-1 para tebuconazole, azoxystrobin e pyrimethanil e 50 mg.L-1 para clorotalonil e carbendazim. Os resultados obtidos no teste de inibição do crescimento micelial (ICM) de 55 isolados de C. cassiicola, mostraram uma variação entre os fungicidas e os isolados avaliados. O fungicida fludioxonil na concentração de 1 mg.L-1 apresentou maior valor de ICM quando comparado aos demais fungicidas avaliados, com valor médio de 85,69%. Já o fungicida clorotalonil apresentou menor valor de ICM, com média de 31,56%. O isolado EH-1710 apresentou maior valor de ICM de 74,14%, já o isolado EH-2125 apresentou o menor valor entre os isolados avaliados, com média de 34,57%. Os resultados obtidos evidenciam uma grande expectativa de efeitos satisfatórios do fungicida fludioxonil no controle da mancha-alvo. Já os fungicidas carbendazim, pyrimethanil, azoxystrobin e, principalmente, clorotalonil apresentam grande possibilidade de desenvolvimento de resistência dos isolados de C. cassiicola. / Target spot, caused by the fungus Corynespora cassiicola, has been one of the most important disease of the aerial parts of the tomato and cucumber plants in different regions of Brazil and world in the last years. Besides the tomato and cucumber, this fungus has a big host diversity, detected in more than 350 plants, distributed by more than 80 countries. The isolates of this fungus also have a big morfological diversity, mainly in relation to colony colour, conidia size and shape. These characters difficult its identification and characterization to species level. Another difficult concerning to target spot is the absence of resistant cultivars and fungicides recommended for tomato and cucumber in Brazil, representing a big challenge for its control. In function on the presented problems, this thesis aimed to investigate the genetic variability, morphometric and pathogenic among Corynespora isolates from different geographic regions and test the in vitro mycelial sensitivity of Corynespora isolates to different fungicides. In the molecular characterization all isolates were identified as C. cassiicola. As to distribution and intraspecific resolution of isolates, the sequences obtained from genomic regions ITS and elongation factor 1-α showed limited intraspecific resolution of the isolates as to host of origin and geographical region of collection in its phylogenetic trees. The phylogenetic tree with the sequences of β-tubulin gene showed better distribution of isolates as to its host of origin. In this tree it was formed two distinct clades, each one represented mostly by isolates from tomato and cucumber crop. Thirteen isolates of C. cassiicola used in morphometric characterization showed big variability as to color, with occurrence of six different colors; as to texture, with isolates divided into seven presenting fine texture and six with cottony texture; and as to colony shape, with predominance of polygonal shape. The mycelial growth rate was 6.05 mm/d. The dimensions of the conidia ranged from 7.39 to 386.05 mm in length, 5.8 to 14.08 mm in width and 0 to 24 for the number of pseudosepts. The three isolates of C. cassiicola tested confirmed pathogenicity to its host of origin. Only eight species of plants tested didn't show susceptibility to isolates. After molecular, morphometric and pathogenic characterization of isolates of C. cassiicola tested, was concluded that, except for β-tubulin region, no relationship between host of origin and geographical region of isolates was established in this study. In the fungicidal sensitivity test was performed in preliminary tests to determine the actual dose able of inhibiting the mycelial growth of C. cassiicola by 50% (ED50). In the results, the fungicide chlorothalonil and carbendazim showed great ED50 values to majority of isolates, with average higher to 50 mg.L-1. For the tebuconazole fungicide the values of ED50 varied from 0.50 to 18.79 mg L-1. The pyrimethanil, cyprodinil and fludioxonil fungicides presented lower values of DE50 when compared to the former fungicides. After these tests, the ED50 concentrations found were 1 mg.L-1 to fludioxonil, 3 mg.L-1 to cyprodinil, 5 mg l-1 to boscalid and Fluopyram, 10 mg.L-1 to tebuconazole, azoxystrobin and pyrimethanil and 50 mg L-1 to chlorothalonil and carbendazim. The results obtained in the inhibition test of mycelial growth (ICM) of 55 isolates of C. cassiicola, showed a variation among fungicides and isolates tested. The fludioxonil fungicide at a concentration of 1 mg L-1 showed higher ICM when compared to fungicides tested, with average of 85.69%. Already chlorothalonil fungicide showed the lowest ICM values with average of 31.56%. EH-1710 showed higher ICM of 74.14% and the isolate EH-2125 showed the lowest value of ICM among the isolates tested, with average of 34.57%. The results show a great expectation of good effects of fludioxonil fungicide on target spot control. Already carbendazim fungicides, pyrimethanil, azoxystrobin and chlorothalonil showed great possibility of development of resistance of isolates of C. cassiicola.

O oídio, causado pelo fungo Podosphaera fuliginea, é uma doença de ocorrência universal, considerada uma das mais comuns entre as cucurbitáceas. Todas as espécies são suscetíveis, contudo a severidade está condicionada ao tipo de clima, espécies e cultivares. Na cultura do pepino (Cucumins sativus L.) o oídio provoca danos principalmente em cultivos protegidos, necessitando da utilização de produtos tóxicos no seu controle. É crescente o interesse pelos métodos alternativos de controle, englobando os biológicos, orgânicos ou naturais, por apresentar alternativas de controle eficientes, tendo como características o baixo potencial de contaminação ao ambiente, a saúde do aplicador e do consumidor. Experimentos foram conduzidos em casa de vegetação e repetidos em dois cultivos, com a utilização de extratos de canola e própolis para controle de oídio em pepineiro. No primeiro experimento testou-se o efeito potencial, de extratos de pó de canola (Brassica napus L.) em quatro formas de extração: extrato alcoólico, infusão, maceração e extrato aquoso e cinco concentrações de cada extrato: 0, 3, 6, 9, e 12%. A primeira aplicação foi realizada 24 horas antes de submeter as plantas ao inóculo do patógeno e as demais semanalmente, num período de 5 semanas. Avaliou-se a incidência e severidade da doença e o efeito elicitor dos extratos na indução de resistência por meio da atividade da enzima fenilalanina amônia-liase (FAL), fenóis totais e proteínas totais. No segundo experimento testou-se o efeito de extrato etanólico de própolis aplicado em épocas e concentrações distintas: 24 horas antes da inoculação do patógeno, 24 horas após a inoculação e no aparecimento dos primeiros sintomas da doença com concentrações de 0% (água destilada) 0,5; 1; 2; 4 e 8% do extrato. No primeiro experimento, verificou-se maior atividade da FAL e maior acúmulo de fenóis totais, sendo estes parâmetros relacionados à redução da AACPD para a incidência e severidade do oídio.Destacou-se como melhor controle o extrato maceração na concentração de 12%, com redução de mais de 50% de incidência e mais de 90% de severidade da doença. No segundo experimento verificou-se que o extrato aquoso de própolis aplicado 24 horas antes e 24 horas após a inoculação do patógeno conferiu melhor controle da AACPD da severidade e incidência, quando comparadas a aplicação no aparecimento dos primeiros sintomas da doença. Esse efeito foi mais significativo quando utilizou-se a concentração de 8%. Os resultados obtidos em ambos os experimentos demonstram que o extrato do pó de canola, assim como, o extrato alcoólico de própolis possuem potencial para controle de oídio em pepineiro. / Powdery mildew, caused by the fungus Podosphaera fuliginea, is a disease of universal occurrence, considered one of the most common among cucurbits. All species are susceptible, but the severity depends on the type of climate, species and cultivars. In the culture of cucumber (Cucumis sativus L. Cucumins) powdery mildew causes damage mainly in greenhouses, necessitating the use of toxic products in your control. The interest in alternative methods of control is growing, including the biological, organic or natural alternatives to present efficient control, with features like the low potential for contamination to the environment, the health of the operator and the consumer. Experiments were conducted in a greenhouse and repeated in two crops, using canola and própolis extracts to control powdery mildew in cucumber. In the first experiment was tested the potential effect of powder canola (Brassica napus L.) extracts in four forms of extraction: alcoholic, infusion, maceration and aqueous extract and five concentrations of each extract: 0, 3, 6, 9 and 12%. The first application was made 24 hours before the pathogen inoculation and other weekly for a period of 5 weeks, measuring the incidence and severity of disease and the elicitor effect of extracts in the induction of resistance by the enzyme phenylalanine ammonia lyase (FAL), total phenolics and total proteins. In the second experiment was tested the effect of ethanol propolis extract applied in different times and concentrations: 24 hours before the pathogen inoculation, 24 hours after pathogen inoculation and the appearance of the firsts disease symptoms with 0% (distilled water); 0,5; 1; 2; 4 and 8% of the extract. In the first experiment, there was a higher activity of FAL and greater accumulation of phenolic compounds, which are parameters related to the reduction of AUDPC for the incidence and severity of powdery mildew, highlighting how the best to control the maceration extract at a concentration of 12%, with reduced more than 50% incidence and more than 90% disease severity. In the second experiment it was found that a própolis aqueous extract applied 24 hours before and 24 hours after the inoculation of the pathogen gave better control of AUDPC the incidence and severity when compared to aplication in the first disease symptoms. This effect was more significant when it was used at a concentration of 8%. The results in both experiments showed that the powder canola extract, as well as the alcoholic própolis extract, have potential for control of powdery mildew on cucumber.

O oídio, causado pelo fungo Podosphaera fuliginea, é uma doença de ocorrência universal, considerada uma das mais comuns entre as cucurbitáceas. Todas as espécies são suscetíveis, contudo a severidade está condicionada ao tipo de clima, espécies e cultivares. Na cultura do pepino (Cucumins sativus L.) o oídio provoca danos principalmente em cultivos protegidos, necessitando da utilização de produtos tóxicos no seu controle. É crescente o interesse pelos métodos alternativos de controle, englobando os biológicos, orgânicos ou naturais, por apresentar alternativas de controle eficientes, tendo como características o baixo potencial de contaminação ao ambiente, a saúde do aplicador e do consumidor. Experimentos foram conduzidos em casa de vegetação e repetidos em dois cultivos, com a utilização de extratos de canola e própolis para controle de oídio em pepineiro. No primeiro experimento testou-se o efeito potencial, de extratos de pó de canola (Brassica napus L.) em quatro formas de extração: extrato alcoólico, infusão, maceração e extrato aquoso e cinco concentrações de cada extrato: 0, 3, 6, 9, e 12%. A primeira aplicação foi realizada 24 horas antes de submeter as plantas ao inóculo do patógeno e as demais semanalmente, num período de 5 semanas. Avaliou-se a incidência e severidade da doença e o efeito elicitor dos extratos na indução de resistência por meio da atividade da enzima fenilalanina amônia-liase (FAL), fenóis totais e proteínas totais. No segundo experimento testou-se o efeito de extrato etanólico de própolis aplicado em épocas e concentrações distintas: 24 horas antes da inoculação do patógeno, 24 horas após a inoculação e no aparecimento dos primeiros sintomas da doença com concentrações de 0% (água destilada) 0,5; 1; 2; 4 e 8% do extrato. No primeiro experimento, verificou-se maior atividade da FAL e maior acúmulo de fenóis totais, sendo estes parâmetros relacionados à redução da AACPD para a incidência e severidade do oídio.Destacou-se como melhor controle o extrato maceração na concentração de 12%, com redução de mais de 50% de incidência e mais de 90% de severidade da doença. No segundo experimento verificou-se que o extrato aquoso de própolis aplicado 24 horas antes e 24 horas após a inoculação do patógeno conferiu melhor controle da AACPD da severidade e incidência, quando comparadas a aplicação no aparecimento dos primeiros sintomas da doença. Esse efeito foi mais significativo quando utilizou-se a concentração de 8%. Os resultados obtidos em ambos os experimentos demonstram que o extrato do pó de canola, assim como, o extrato alcoólico de própolis possuem potencial para controle de oídio em pepineiro. / Powdery mildew, caused by the fungus Podosphaera fuliginea, is a disease of universal occurrence, considered one of the most common among cucurbits. All species are susceptible, but the severity depends on the type of climate, species and cultivars. In the culture of cucumber (Cucumis sativus L. Cucumins) powdery mildew causes damage mainly in greenhouses, necessitating the use of toxic products in your control. The interest in alternative methods of control is growing, including the biological, organic or natural alternatives to present efficient control, with features like the low potential for contamination to the environment, the health of the operator and the consumer. Experiments were conducted in a greenhouse and repeated in two crops, using canola and própolis extracts to control powdery mildew in cucumber. In the first experiment was tested the potential effect of powder canola (Brassica napus L.) extracts in four forms of extraction: alcoholic, infusion, maceration and aqueous extract and five concentrations of each extract: 0, 3, 6, 9 and 12%. The first application was made 24 hours before the pathogen inoculation and other weekly for a period of 5 weeks, measuring the incidence and severity of disease and the elicitor effect of extracts in the induction of resistance by the enzyme phenylalanine ammonia lyase (FAL), total phenolics and total proteins. In the second experiment was tested the effect of ethanol propolis extract applied in different times and concentrations: 24 hours before the pathogen inoculation, 24 hours after pathogen inoculation and the appearance of the firsts disease symptoms with 0% (distilled water); 0,5; 1; 2; 4 and 8% of the extract. In the first experiment, there was a higher activity of FAL and greater accumulation of phenolic compounds, which are parameters related to the reduction of AUDPC for the incidence and severity of powdery mildew, highlighting how the best to control the maceration extract at a concentration of 12%, with reduced more than 50% incidence and more than 90% disease severity. In the second experiment it was found that a própolis aqueous extract applied 24 hours before and 24 hours after the inoculation of the pathogen gave better control of AUDPC the incidence and severity when compared to aplication in the first disease symptoms. This effect was more significant when it was used at a concentration of 8%. The results in both experiments showed that the powder canola extract, as well as the alcoholic própolis extract, have potential for control of powdery mildew on cucumber.