Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-07-13T21:05:49Z No. of bitstreams: 1 2018_JoãoMarcosFagundesSilva.pdf: 4954356 bytes, checksum: 88a85bcc1a6bb8a6887d391ccdd77444 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-07-14T19:12:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_JoãoMarcosFagundesSilva.pdf: 4954356 bytes, checksum: 88a85bcc1a6bb8a6887d391ccdd77444 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-14T19:12:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_JoãoMarcosFagundesSilva.pdf: 4954356 bytes, checksum: 88a85bcc1a6bb8a6887d391ccdd77444 (MD5) Previous issue date: 2018-07-13 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). / As tecnologias de sequenciamento em larga escala permitem a caracterização genômica das comunidades virais presentes em tecidos vegetais e animais e em amostras ambientais com alta sensibilidade e acurácia. Devido ao sequenciamento simultâneo de várias sequências genômicas, essa técnica também permite o estudo da alta diversidade genética intra-hospedeiro apresentada pelos vírus de RNA. Nesse trabalho, estudamos e estabelecemos um pipeline para a análise de viroma em planta utilizando o modelo de pepino, reportamos a descoberta de dois novos vírus em videiras, Grapevine enamovirus1 (GEV-1) e Grapevine virga-like virus (GVLV). Após ensaios de amplificação rápida das extremidades do cDNA (rapid amplification of cDNA ends – RACE) da extremidade 5' do genoma do GEV-1, foi descrito a sequência genômica quase completa desse vírus (6227 bp), possibilitando a sua classificação como um membro do gênero Enamovirus (família Luteoviridae) com base na sua organização genômica, estudos filogenéticos e critérios estabelecidos pelo Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus (International Committee on Taxonomy of Viruses – ICTV). Entretanto, o genoma do GVLV permanece parciamente sequenciado em duas partes: um contig de 3348 bp que contém os domínios metiltransferase (Met) e helicase (Hel); e um contig de 1272 bp que corresponde à RNA polimerase dependente de RNA (RdRp) parcial. Com base em estudos filogenéticos não foi possível classificar esse vírus, que mostra baixa identidade com ambas as famílias Virgaviridae e Bromoviridae. Adicionalmente, esse trabalho apresenta um estudo da diversidade genética intra-hospedeiro dos vírus associados ao enrolamento da folha da videira (Grapevine leafroll-associated virus – GLRaV), com foco na poliproteína dos GLRaV-2 e -3 (gêneros Closterovirus e Ampelovirus, respectivamente), assim como a detecção in silico de uma molécula defectiva de RNA do GLRaV-4 (Ampelovirus), a partir de dados gerados por HTS. As populações intra-hospedeiro encontradas em dois isolados de GLRaV-2 mostraram apenas 11 polimorfismos de único nucleotídeo (single nucleotide polymorphisms – SNPs) em comum (~14% dos SNPs em cada isolado). A diversidade intra-hospedeiro encontrada em dois isolados de GLRaV-3 foi baixa se comparada com os isolados de GLRaV-2. / High-throughput sequencing technologies allow for the genomic characterization of viral communities present in plant and animal tissues and environmental samples with high accuracy and sensibility. The simultaneous sequencing of various genomic sequences by this technique also makes it useful for the study of the high intrahost genetic diversity presented by RNA viruses. In this work, we studied and established the conditions of analysis of plant virome using the cucumber model, the discovery of two novel grapevine viruses, Grapevine enamovirus-1 (GEV-1) and Grapevine virga-like virus (GVLV). After rapid amplification of cDNA ends (RACE) assays of the 5' end of GEV-1 genome, we obtained the near full genomic sequence of this virus (6227 bp), enabling its classification as a member of the genus Enamovirus (family Luteoviridae) based on its genomic properties, phylogenetic studies and criteria stablished by the International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV). However, the genome of GVLV remains only partially sequenced, separated in two parts: a 3348 bp contig containing the methyltranferase (Met) and helicase (Hel) domains; and a 1272 bp contig which corresponds to the partial RNA dependent RNA polimerase (RdRp). Based on phylogenetic studies, were not able to classify this novel virus, which shows low identity with viruses in the families Virgaviridae and Bromoviridae. Additionally, this works presents a study on the intrahost genetic diversity of Grapevine leafroll-associated viruses (GLRaVs), focusing on the polyprotein of GLRaV-2 and -3 (genera Closterovirus and Ampelovirus, respectively), as well as an in silico detection of a defective RNA molecule of GLRaV-4 (Ampelovirus). The intrahost population of two isolates of GLRaV-2 showed only 11 single nucleotide polymorphisms (SNPs) in common (~14 of the SNPs found on each isolate). The intrahost genetic diversity found on two isolates of GLRaV3 was low compared to GLRaV-2.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:52:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5024_1.pdf: 448901 bytes, checksum: 4d971b7e87c950e13777aa7be6ce24c9 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2003 / Vários relatos da literatura revelam ser a prevalência de Entamoeba dispar maior do que Entamoeba histolytica nos indivíduos que vivem no Nordeste brasileiro, a partir de estudos utilizando Enzyme Linked Immnosorbent Assay (ELISA), imunodifusão em gel e zimodemos. Este trabalho consistiu em determinar a prevalência dessas formas de amebas mediante o uso de detecção imunocoprológica de antígeno específico para E. histolytica e Reaction Chain Polimerase (PCR) do DNA genômico extraído de trofozoitos cultivados de amostras de fezes. A presença de amebas tetranucleadas foi investigada em 1437 amostras de fezes de indivíduos vivendo em Macaparana, cidade da zona da mata norte de Pernambuco; em 346 amostras de escolares com idades de 3 a 14 anos morando em uma favela do Recife e em 109 amostras de imunodeprimidos (104 HIV positivos e 05 transplantados) atendidos no Hospital das Clínicas da UFPE (2002 e 2003). Dessas amostras, 59 (4.1%) e 45 (13%) foram positivas para aquelas coletadas das populações de Macaparana e das crianças do Recife, respectivamente, enquanto que nenhuma foi positiva para as obtidas dos imunodeprimidos. Todas as amostras foram negativas para a presença de adesina galactose específica de E. histolytica, inclusive as amostras dos pacientes imunosuprimidos. As amostras com amebas tetranucleadas cultivadas em meio de Robinson foram positivas para trofozoítos em 31 daquelas coletadas das populações de Macaparana e 21 das de Recife. A partir da amplificação por PCR de seqüências espécie-específicas de DNA genômico, extraído desses trofozoítos, foi possível identificar E. dispar em 23 e 19 amostras dos habitantes de Macaparana e das crianças do Recife, respectivamente, enquanto que nenhuma amplificação foi observada para E. histolytica. As demais amostras (08 e 02 paraMacaparana e Recife, respectivamente) foram negativas para ambas as espécies. Estes resultados corroboram aqueles previamente descritos que mostravam a prevalência de E. dispar (ameba não patogênica) nestas populações. Ademais, validam o emprego do kit imunocoprológico como alternativa a PCR na identificação de E. dispar e E. histolytica. Finalmente, o polimorfismo genético das cepas de E. dispar das amostras coletadas da população de Macaparana e de crianças do Recife foi investigado com o uso de marcadores moleculares específicos para E. dispar, Dsp1/Dsp2 e Dsp5/Dsp6. Das 42 amostras analisadas, 39 amplificaram os loci 1-2 e 5-6. O dendrograma resultante desta análise revelou uma alta variabilidade entre os isolados para esta região. Entretanto, uma comparação entre as freqüências dos produtos de amplificação para as duas localidades, através de teste de Qui-quadrado, mostrou que a incidência de uma banda obtida do locus 5-6, foi significativamente diferente entre Recife e Macaparana, evidenciando a potencialidade desta técnica para abordar questões relativas à distribuição geográfica

Mesmo sendo uma das zoonoses mais antigas descritas pelo homem, a raiva ainda é um grande desafio em todo o mundo. O ciclo da enfermidade em espécies silvestres apresenta importância emergente no Brasil e a região Nordeste apresenta uma epidemiologia única em comparação ao restante do país, por ser endêmica para o vírus da raiva em silvestres terrestres. Nesta região, foram identificadas as duas variantes do vírus da raiva responsáveis pelo acometimento da doença em seres humanos, que são mantidas e transmitidas por animais silvestres terrestres. Registros de casos nas espécies descritas como reservatórios, em outras espécies silvestres, domésticas e em humanos ocorrem anualmente. Estas variantes virais foram identificadas primeiramente no Estado do Ceará, uma em saguis do tufo branco (Callithrix jacchus) e a outra em canídeos silvestres, estando restritas à região Nordeste do Brasil até o momento. O objetivo do presente estudo foi identificar geneticamente, utilizando DNA mitocondrial, as espécies de canídeos silvestres de ocorrência no Estado do Ceará, que atuam como reservatório e fonte de infecção do vírus da raiva, e a correlação entre esses reservatórios e o vírus. Para que fosse possível, utilizamos as técnicas de amplificação do gene Citocromo C Oxidase I (COI), bem como a amplificação da nucleoproteína do vírus da raiva pela Transcriptase Reversa e a Reação em Cadeia da Polimerase (RT - PCR). Todas as amostras que apresentaram banda representativa em gel de agarose, para ambos os casos, foram submetidas ao sequenciamento genético das regiões amplificadas. De um total de 101 amostras recebidas, 89 obtiveram sequências satisfatórias para a identificação da espécie de canídeo silvestre, sugerindo que a principal espécie de canídeo silvestre presente no Estado do Ceará é o Cerdocyon thous e, 50 amostras obtiveram banda representativa para o vírus da raiva. Dessas, 48 apresentaram sequência satisfatória para a caracterização do vírus. Os resultados obtidos indicam alta positividade para o vírus da raiva em canídeos silvestres nessa região do Brasil, e sugerem que C. thous é a principal espécie de canídeo silvestre atuando como reservatório e transmissor do vírus da raiva no Estado do Ceará. Esses dados fornecem informações valiosas sobre as espécies de canídeos envolvidas nos casos de raiva ocorridos no Estado do Ceará, possibilitando a adoção de estratégias efetivas de prevenção e controle da raiva, além de resultados inéditos em relação às espécies de canídeos silvestres de ocorrência no Estado e sua importância na epidemiologia da enfermidade. / Although it is one of the most ancient diseases related in human history, rabies still presents a great challenge throughout the world. Wild animals have emergent importance in Brazil and the Northeast region, an endemic region, presents a unique epidemiology compared to the rest of the country. In this region, two variants of the rabies virus responsible for the disease in humans, were identified which are maintained and transmitted by terrestrial wild animals. These variants were initially identified in the State of Ceara, one maintained by populations of marmosets (Callithrix jacchus) and other by wild canids, both being restricted to time to the Northeast. The aim of this study was to identify genetically, using the mitochondrial DNA, the species of wild canids in Ceara that act as reservoir and transmitters of the rabies virus. We used the Polymerase Chain Reaction by Reverse Transcriptase (RT - PCR) tecnique for amplification of Citocrhome C Oxidase I (COI) gene to species characterization and the viral nucleoprotein to detect the rabies virus. All the samples that presented representative band on agarose gel, in both cases, were submitted to the genetic sequencing. Of a total of 101 samples received, 89 obtained satisfactory sequences to identify the wild canid species, suggesting that the main wild canid species occurring in Ceara state is Cerdocyon thous. Out of 50 samples with representative band to rabies virus, 48 presented satisfactory sequences to the viral characterization. The results indicate high positivity for rabies virus in wild canids in this region of Brazil, and suggest that C. thous is the main terrestrial wild reservoir e transmitter of rabies virus in Ceara State. These data provide valuable information about canids species involved in rabies cases in Ceara state, implying in the adoption of effective strategies for prevention and control of rabies, and also unpublished results regarding the occurrence of species of wild canids in the State and its importance in the disease epidemiology.

O Circovírus suíno tipo 2 (PCV-2) pertence ao gênero Circovirus da família Circoviridae. É considerado “vírus emergente", tendo sido associado, principalmente, à Síndrome de Refugagem Multissistêmica dos suínos (SRM). O genoma circular é composto por: (i) ORF-1 que codifica a proteína replicativa; (ii) ORF-2 que codifica a proteína estrutural formadora do capsídeo, (iii) região não codificadora que intercala as ORF-1 e 2 e contem a origem da replicação, denominada IGS-1 e (iv) região que intercala as ORF-1 e 2, denominada IGS-2. Oito amostras, denominadas amostras completas, tiveram mais de 1705 nucleotídeos seqüenciados (945 da ORF-1, 699 da ORF-2, 20 da IGS-1 e 39 da IGS-2); duas amostras tiveram em média 1692 nucleotídeos seqüenciados (945 da ORF-1 e 699 da ORF-2, os restantes correspondem às regiões IGS-1 e 2); uma amostra teve 1392 nucleotídeos seqüenciados (945 da ORF-1, 414 da ORF-2, 9 da IGS-1 e 24 da IGS-2) e nove amostras tiveram em média 970 nucleotídeos seqüenciados (196 da ORF-1 e 699 da ORF-2, os restantes correspondem às regiões IGS-1 e 2). Portanto, a partir dessas 20 amostras em estudo, foram obtidas: (i) oito amostras completas; (ii) 11 seqüências completas de ORF-1 e (iii) 19 seqüências completas de ORF-2, as quais foram analisadas. A identidade de nucleotídeo variou de: (i) 99,7% a 100% entre as oito amostras completas; (ii) 99,3% a 100% entre as 11 seqüências completas de ORF-1 e (iii) 91,9% a 100% entre as 19 seqüências completas de ORF-2. A topologia das árvores genealógicas utilizando as oito seqüências completas e as 11 seqüências completas de ORF-1 foi similar, agrupando todas as amostras em estudo em um só grupo denominado subtipo PCV-2a. Pela análise da genealogia da ORF-1 observou-se que todas as amostras agruparam-se com uma amostra de PCV-2 associada à Síndrome de Dermatite e Nefropatia suína (PDNS), formando um grupo separado das amostras de PCV-2 associadas à Síndrome de Refugagem Multissistêmicas dos suínos (SRM) e abortamento. A genealogia proposta para as 19 amostras que tiveram a ORF-2 seqüenciada, dividiu as amostras em dois grupos, sendo que 14 amostras agruparam-se num grupo denominado subtipo PCV-2a e 5 no subtipo PCV-2b. Os resultados mostraram a circulação de, pelo menos, dois subtipos de PCV-2 no Brasil / Porcine circovirus 2 belongs to Circovirus genus and Circoviridae family. It is considered an “emerging virus" being associated to Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome (PMWS). The circular viral genome is formed by: (i) ORF-1 coding for the replicative associated proteins; (ii) ORF-2 encoding the structural proteins of the viral capsid; (iii) a non-coding intergenic sequence between ORF-1 and ORF-2 containing the replicative origin of the viral genome (IGS-1) and (iv) a second non-coding intergenic sequence between ORF-1 and ORF-2 (IGS-2). Eight samples, named complete sequences, had about 1705 nucleotides determined (945 from ORF-1, 699 from ORF-2, 20 from IGS-1 and 39 from IGS-2); two samples had about 1692 nucleotides sequenced (945 from ORF-1, 699 from ORF-2, and the rest from IGS-1 and 2); one sample had 1392 nucleotides sequenced (945 from ORF-1, 414 from ORF-2, 9 from IGS-1 and 24 from IGS-2) and nine samples had about 970 nucleotides sequenced (196 from ORF-1, 699 from ORF-2, and the rest from IGS-1 and 2). Therefore, from the 20 samples it was obtained: (i) eight complete sequences; (ii) 11 complete sequences of ORF-1 and (iii) 19 complete sequences of ORF-2. The identity at nucleotide level was from: (i) 99,7% to 100% among the eight complete sequences; (ii) 99,3% to 100% among the 11 sequences of ORF-1 and (iii) 91,9 to 100% among the 19 sequences of ORF-2. The topology of the tree generated by the ORF-1 analysis revealed a cluster formed by the Brazilian samples of PCV-2 and the samples associated to PDNS and another cluster formed by the PCV-2 associated to other syndromes. The genealogy presented for the 19 samples using the data from ORF-2 revealed the presence of two clusters, one of them formed by 14 samples named subtype PCV-2a and the other formed by 5 samples, named PCV-2b. The results demonstrated that, at least, two subtypes of PCV-2 circulate in Brazil

O isolamento do vírus da raiva (genótipo 1) a partir de morcegos não hematófagos está se tornando cada vez mais freqüente nas grandes cidades do Brasil. Este trabalho foi delineado para investigar a patogenicidade de um isolado do vírus da raiva, do morcego insetívoro Lassiurus ega, procedente do município de Presidente Prudente SP, em comparação ao vírus fixo da raiva, amostra CVS/32 (Challenge Vírus Standard). Os vírus foram reativados por meio de inoculação intracerebral em camundongos e os experimentos de patogenicidade foram realizados em camundongos e hamsters, desafiando-os pelas vias intramuscular (IM), intradérmica (ID), intranasal (IN) e abrasão superficial da pele (AP). A presença do vírus nos cérebros de animais que haviam manifestado sinais compatíveis à raiva, foi confirmada mediante a prova de imunofluorescência direta. Foram considerados para a avaliação da patogenicidade o quadro clínico, proporção de mortos, e a duração dos períodos de incubação (PI) e clínicos (PC) em dias. Em hamsters, o isolado de L. ega exibiu um quadro furioso, com proporção total de mortos de 2.60%; assim discriminada: 2.08% IM (PI: 11 dias; PC: 6 dias) e 8.33% IN (PI:10.66 ± 1.15 e PC: 7.33 ± 1.54). A presença do vírus no SNC foi detectada apenas em animais inoculados por essas vias. Por outro lado, o vírus CVS produziu um quadro paralítico com mortalidade total de 39.84%, com a seguinte distribuição: 62.50% IM (PI 7.50 ± 2.33; PC: 5.13 ± 1.89) 78.12% ID (PI 9.13 ± 2.23; PC 3.88 ± 2.23) 18.75% IN (PI 12.00 ± 2.77; PC 7.14 ± 2.54). Em camundongos, o isolado do L. ega manifestou sinais de agressividade e a raiva foi confirmada em animais inoculados IM e IN. A proporção de mortos observados em camundongos foi de 50.00% (PI 16.80 ± 2.20; PC 1.4 ± 0.54) e 30% (PI 14 ± 4.35; PC: 2.66 ± 0.57) respectivamente e o vírus CVS produziu mortalidade de 45.00% (PI: 6.30 ± 0.67; PC: 1.5 ± 0.70), 70% (PI: 7.14 ± 1.34; PC 2.28 ± 1.25) e 30% (PI:10.00; PC:1) pelas vias mencionadas acima, com quadro clínico de paralisia. O isolado de L. ega mostrou diferenças na proporção de mortos e quadro clínico furioso quando comparado com o CVS nos dois modelos animais. Os resultados sugerem que o contato com os morcegos insetívoros infectados pelo vírus da raiva representa um risco de transmissão da doença, por meio de ferimentos superficiais da pele provocadas pelas mordeduras ou ainda pela via respiratória, supostamente por meio de aerossóis. Pelo sequenciamento completo da proteína G viral do isolado do L. ega, foram observadas substituições na seqüência de aminoácidos nos sítios antigênicos AI, AII, assim como no domínio de fusão dependente de baixo pH. Os resultados obtidos, sugerem que as diferenças no comportamento biológico podem estar associadas às substituições encontradas na sequencia de aminoácidos da proteína G. / The isolation of rabies virus (genotype 1) from the non-hematophagous bats is becoming frequent in heavy urbanized areas in Brazil. This work intended to investigate the pathogenicity of a Brazilian rabies virus isolate from the insectivorous bat Lassiurus ega, from PresidentePrudente-SP, comparing with the CVS/32 (Challenge Virus Standard) fixed rabies virus strain. The viruses were reactivated through intracerebral inoculation into mice and the pathogenicity experiments were made in hamsters and mice, challenged by intramuscular (IM), intradermal (ID) and intranasal (IN) routes and by superficial abrasion of skin. The presence of virus in the brain of animals manifesting the signs compatible with rabies was confirmed by the direct immunofluorescence test. For the evaluation of the pathogenicity, the clinical manifestations, incubation (IP) and clinical (CP) periods in days and the mortality were considered. In hamsters, the isolate of L. ega exhibited a furious form of rabies with total mortality rate of 2.60%, with following distribution: 2.08% IM (IP: 11 days; CP: 6 days) and 8.33% IN (IP: 10.66 ± 1.15 and PC: 7.33 ± 1.54). The presence of rabies virus in the CNS was detected only in animals inoculated through IM and IN routes. The CVS strain has provoked paralytic disease with a total mortality rate of 39.84% as the follow: 62.50% IM (IP 7.50 ± 2.33; CP: 5.13 ± 1.89), 78.12% ID (IP 9.13 ± 2.23; CP 3.88 ± 2.23) and 18.75% IN (IP 12.00 ± 2.77; CP 7.14 ± 2.54). In mice, the isolate of L. ega manifested signs of aggressiveness and rabies was confirmed in animals that were inoculated intramuscularly and intranasally. The total mortality rate observed in mice was 20%, by the IM route was 50% (IP 16.80 ± 2.20; CP 1.4 ± 0.54) and 30% by the intranasal route (IP 14.00 ± 4.35; CP: 2.66 ± 0.57) respectively. The CVS strain showed a total mortality rate of 45.00% and by the IM route, 100% (PI: 6.30 ± 0.67; CP: 1.5 ± 0.70), by the ID route, 70% (IP: 7.14 ± 1.34; CP 2.28 ± 1.25) and by IN, 30% (IP: 10, 00; C: 1.00) showing signs of paralysis. Compared to the CVS strain, the isolate of L. ega showed difference in mortality rate and signs of aggressiveness were found both in hamster and mouse model. The results suggest that the contact with the insectivorous bats infected with rabies virus would represent a risk of disease transmission, by means of superficial wounds of the skin inflicted by bites or by inhalation of aerosols. By the complete sequencing of the viral G protein of the isolate of L. ega, sequencings of amino acids substitutions were observed at antigenic sites AI, AII, as well as the in domain of fusion dependent on low pH. According to the results, differences in the biological behavior may be associated to the substitutions found in the amino acids sequence of the G protein.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2017-03-22T13:53:05Z No. of bitstreams: 1 Maruzanete Pereira de Melo.pdf: 1618100 bytes, checksum: d81055349760c7e0a71d06d44d214cd2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-22T13:53:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maruzanete Pereira de Melo.pdf: 1618100 bytes, checksum: d81055349760c7e0a71d06d44d214cd2 (MD5) Previous issue date: 2015-07-29 / Brazil is the thrid worldwide producer of corn kernel (Zea mays L.), only behind of the United States of América and China. The causal agents of ears and stalk rot are fungi like Stenocarpella maydis, Fusarium spp and Penicillium oxalicum, worth mentioning to the Fusarium species, specially the complex Giberrela fugikuori species. These species, usually related to ear and stalk rot are: Fusarium verticillioides (Gibberella moniliformis), Fusarium proliferatum (G. intermédia) and F. subglutinans (G. subglutinans). Other species like F. thapsinum (G. thapsina), were found in corn crop, however this specie causes high loses in sorghum crops. Recently, was described a new specie of the complex G. fugikuri, associated to corn kernels, called F. theparatum. These species are widely distributed all the world, being F. verticillioides the most frequently associated to corn crop and other grasses. To identify the Fusarium are necessaries three species concepts: morphological specie, based on similarity of morphological characters nominated morphological markers; the concept of biological specie, based on sexual compatibility between the member of the same specie; and the concept of phylogenetic specie based on genic sequences analisys. Fungi of the Fusarium gender are potential producers of many mycotoxins, being the most important the tricothecenos (vomitoxin), fumonisins, zearalenona, moniliformin and fusaric acid. These metabolites are substances that cause pulmonary edema in pigs, leukoencephalomalacia in horses and, in humans in South Africa, it was observed high incidence of esophagus cancer. When was analyzed the corn products that this population was feeding, it was found high concentrations of mycotoxis. Fusarium verticillioides species have systemic movement in seeds, roots and stalks, and can be transmitted for long distances by seeds. / O Brasil é o terceiro maior produtor mundial de grãos milho (Zea mays L.), ficando atrás apenas dos Estados Unidos e China. Os agentes causadores de podridões de espiga e colmo são fungos como: Stenocarpella maydis, Fusarium spp e Penicillium oxalicum, merecendo destaque para as espécies de Fusarium, em especial as espécies do complexo Giberrela fujikuroi. As espécies do complexo, frequetemente associado à podridão de colmo e espiga são: Fusarium verticillioides (Gibberella moniliformis), Fusarium proliferatum (G. intermédia) e F. subglutinans (G. subglutinans). Outra espécie como F. thapsinum (G. thapsina), foi constatado a cultura do milho, porém esta espécie causa grandes perdas à cultura do sorgo. Recentemente, foi descrita uma nova espécie do complexo Gibberela fujikuroi, associado a grãos de milho, denominando F. theperatum. Estas espécies encontram-se amplamente distribuídos em todo o mundo, sendo F. verticillioides, a espécie, mas freqüentemente associado a cultura do milho e outras gramíneas. A identificação de Fusarium envolve três conceitos de espécies, o de espécie morfológica baseada na similaridade dos caracteres morfológicos observáveis, denominados marcadores morfológicos; o de espécies biológicas, baseado na compatibilidade sexual entre membros das mesmas espécies; e o conceito de espécies filogenéticas baseado na análise de seqüências gênicas. Fungos pertencentes ao gênero são Fusarium potentes produtores de uma variedade de micotoxinas, sendo as mais importantes os tricotecenos (vomitoxinas), fumonisinas, zearalenona, moniliformina e acido fusárico. Estes metabólicos são substâncias, causa edema pulmonar em suínos, leucoencefalomalácia em eqüinos e em humanos na África do Sul, observou-se alta incidência de câncer de esôfago. Ao analisar os produtos a base de milho, que esta população estava consumindo, constatou altas concentrações de micotoxinas. Espécies de Fusarium verticillioides, possui movimento sistêmico em sementes, raízes e colmo, podendo ser transmitido por sementes a longa distância.

O Circovírus suíno tipo 2 (PCV-2) pertence ao gênero Circovirus da família Circoviridae. É considerado “vírus emergente”, tendo sido associado, principalmente, à Síndrome de Refugagem Multissistêmica dos suínos (SRM). O genoma circular é composto por: (i) ORF-1 que codifica a proteína replicativa; (ii) ORF-2 que codifica a proteína estrutural formadora do capsídeo, (iii) região não codificadora que intercala as ORF-1 e 2 e contem a origem da replicação, denominada IGS-1 e (iv) região que intercala as ORF-1 e 2, denominada IGS-2. Oito amostras, denominadas amostras completas, tiveram mais de 1705 nucleotídeos seqüenciados (945 da ORF-1, 699 da ORF-2, 20 da IGS-1 e 39 da IGS-2); duas amostras tiveram em média 1692 nucleotídeos seqüenciados (945 da ORF-1 e 699 da ORF-2, os restantes correspondem às regiões IGS-1 e 2); uma amostra teve 1392 nucleotídeos seqüenciados (945 da ORF-1, 414 da ORF-2, 9 da IGS-1 e 24 da IGS-2) e nove amostras tiveram em média 970 nucleotídeos seqüenciados (196 da ORF-1 e 699 da ORF-2, os restantes correspondem às regiões IGS-1 e 2). Portanto, a partir dessas 20 amostras em estudo, foram obtidas: (i) oito amostras completas; (ii) 11 seqüências completas de ORF-1 e (iii) 19 seqüências completas de ORF-2, as quais foram analisadas. A identidade de nucleotídeo variou de: (i) 99,7% a 100% entre as oito amostras completas; (ii) 99,3% a 100% entre as 11 seqüências completas de ORF-1 e (iii) 91,9% a 100% entre as 19 seqüências completas de ORF-2. A topologia das árvores genealógicas utilizando as oito seqüências completas e as 11 seqüências completas de ORF-1 foi similar, agrupando todas as amostras em estudo em um só grupo denominado subtipo PCV-2a. Pela análise da genealogia da ORF-1 observou-se que todas as amostras agruparam-se com uma amostra de PCV-2 associada à Síndrome de Dermatite e Nefropatia suína (PDNS), formando um grupo separado das amostras de PCV-2 associadas à Síndrome de Refugagem Multissistêmicas dos suínos (SRM) e abortamento. A genealogia proposta para as 19 amostras que tiveram a ORF-2 seqüenciada, dividiu as amostras em dois grupos, sendo que 14 amostras agruparam-se num grupo denominado subtipo PCV-2a e 5 no subtipo PCV-2b. Os resultados mostraram a circulação de, pelo menos, dois subtipos de PCV-2 no Brasil / Porcine circovirus 2 belongs to Circovirus genus and Circoviridae family. It is considered an “emerging virus” being associated to Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome (PMWS). The circular viral genome is formed by: (i) ORF-1 coding for the replicative associated proteins; (ii) ORF-2 encoding the structural proteins of the viral capsid; (iii) a non-coding intergenic sequence between ORF-1 and ORF-2 containing the replicative origin of the viral genome (IGS-1) and (iv) a second non-coding intergenic sequence between ORF-1 and ORF-2 (IGS-2). Eight samples, named complete sequences, had about 1705 nucleotides determined (945 from ORF-1, 699 from ORF-2, 20 from IGS-1 and 39 from IGS-2); two samples had about 1692 nucleotides sequenced (945 from ORF-1, 699 from ORF-2, and the rest from IGS-1 and 2); one sample had 1392 nucleotides sequenced (945 from ORF-1, 414 from ORF-2, 9 from IGS-1 and 24 from IGS-2) and nine samples had about 970 nucleotides sequenced (196 from ORF-1, 699 from ORF-2, and the rest from IGS-1 and 2). Therefore, from the 20 samples it was obtained: (i) eight complete sequences; (ii) 11 complete sequences of ORF-1 and (iii) 19 complete sequences of ORF-2. The identity at nucleotide level was from: (i) 99,7% to 100% among the eight complete sequences; (ii) 99,3% to 100% among the 11 sequences of ORF-1 and (iii) 91,9 to 100% among the 19 sequences of ORF-2. The topology of the tree generated by the ORF-1 analysis revealed a cluster formed by the Brazilian samples of PCV-2 and the samples associated to PDNS and another cluster formed by the PCV-2 associated to other syndromes. The genealogy presented for the 19 samples using the data from ORF-2 revealed the presence of two clusters, one of them formed by 14 samples named subtype PCV-2a and the other formed by 5 samples, named PCV-2b. The results demonstrated that, at least, two subtypes of PCV-2 circulate in Brazil

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:49:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo1536_1.pdf: 1578098 bytes, checksum: cd53d4f3b0340ecec7afbbf71d57a1be (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A produção de cachaça no Brasil data do início da colonização. Entretanto, as indústrias de cachaça até 1945 eram rurais e rudimentares, não havendo padrões de qualidade. A produção doméstica aumentou bastante e desde então o processo de produção vem sendo aperfeiçoado e melhorado, o que tem acarretado melhorias no rendimento, produtividade e qualidade do produto final. É uma bebida tipicamente brasileira, vem conquistando parcela crescente do mercado internacional de bebidas destiladas por ser considerada exótica e de sabor especial. O processo artesanal, no entanto, carece de procedimentos tecnológicos mais refinados que tornem o produto competitivo no mercado, tanto em termos de produtividade quanto em qualidade. Estas características estão diretamente relacionadas com a qualidade da população de leveduras envolvidas no processo fermentativo da cachaça. A análise desta população poderá fornecer subsídios para a identificação de linhagens específicas para os diferentes alambiques, as quais deverão unir o maior rendimento com a produção de metabólitos que qualificam o produto em termos de aroma e sabor. A partir destes fatos, têm-se como objetivos caracterizar e identificar a população de leveduras do processo fermentativo em diferentes unidades de produção de cachaça artezanal da zona da mata de Pernambuco e avaliar a produção de metabólitos fermentativos de interesse para a qualidade organoléptica da cachaça a partir de culturas puras das leveduras isoladas. A caracterização molecular das leveduras isoladas através de marcadores de PCR, forneceram dados importantes para detectar quais são os perfis de leveduras presente na fermentação da cachaça e através do sequenciamento detectamos as espécies. Os isolados foram caracterizados quanto ao perfil de amplificação do locus ITS1-5.8s ITS2 do DNA ribossomal e agrupados em ribotipos. A relação genética entre os isolados do mesmo ribotipo e a diferenciação entre os ribotipos foram comprovadas pela técnica de DNA-fingerprinting usando os iniciadores (GTG)5, M13 e (GACA)4. Um ou dois representantes de cada ribotipo foi posteriormente identificado por seqüenciamento da região D1/D2 do gene 26S de rDNA. Além de diferentes linhagens de Saccharomyces cerevisiae foram encontradas também as espécies Pichia caribbica (Candida fermentati), Candida millei, C. drosophilae, C. ubatubensis, C. guillermondii e Zyqosaccharomyces fermentati. Dois isolados foram identificados como Candida sp e Zyqosaccharomyces sp. Para as características metabólicas foram cultivadas células em meio YPD, coletadas e reinoculadas em meio de caldo de cana filtrado para concentração final de células de 10% (m/v). Os inóculos foram incubados até o final da fermentação, os metabólitos presentes nos sobrenadantes foram determinados por cromatografia gasosa. As linhagens isoladas de alambiques produtores de aguardente artesanal apresentaram diferenças significativas em relação aos parâmetros produção de rendimento da fermentação e na formação dos principais compostos voláteis. Não foi observada a produção de metanol nos ensaios fermentativos

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:03:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4413_1.pdf: 803009 bytes, checksum: 2449a453f3c7b312f9820def6480617e (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2003 / Um total de 803 amostras de leveduras foram isoladas em intervalos de quinze dias de amostras de mosto fermentado de quatro diferentes destilarias de álcool combustível no Nordeste do Brasil: 110 isolados da destilaria Miriri, 90 da destilaria Giasa e 443 da destilaria Japungu, todas localizadas no Estado da Paraíba. Outras 160 foram da destilaria JB, localizada no Estado de Pernambuco. Todas as leveduras foram submetidas à análise molecular baseada em PCR através do iniciador (GTG)5, que permite a amplificação de seqüências simples entre dois microssatélites no DNA. Também foram analisadas amostras de DNA de Saccharomyces cerevisiae de referência, de diferentes espécies de Saccharomyces e de espécies não pertencentes ao gênero Saccharomyces. Para todas as linhagens de S.cerevisae industriais e de coleção usadas como referência, foram obtidos padrões de amplificação que compartilham bandas não encontradas em outras espécies de Saccharomyces, nem nas espécies testadas não pertencentes ao gênero Saccharomyces. Isto demonstra que o iniciador (GTG)5 pode ser usado para discriminar S.cerevisae de qualquer outra espécie de levedura, o que sugere seu uso posterior em taxonomia molecular. Além disso, bandas polimórficas foram identificadas entre muitas linhagens de S. cerevisae, tanto de referência quanto de isolados industriais, o que permitiu a discriminação de 17 linhagens nativas de S. cerevisiae, confirmadas pelo método clássico de identificação. Em conjunto, os resultados obtidos neste trabalho demonstraram que o iniciador (GTG)5 pode ser usado no acompanhamento de populações de leveduras em processos fermentativos. Os isolados de perfil (GTG)5 P1 e P18 apresentaram características fermentativas e de persistência no processo sendo portanto indicadas para receberem genes de interesse industrial

O isolamento do vírus da raiva (genótipo 1) a partir de morcegos não hematófagos está se tornando cada vez mais freqüente nas grandes cidades do Brasil. Este trabalho foi delineado para investigar a patogenicidade de um isolado do vírus da raiva, do morcego insetívoro Lassiurus ega, procedente do município de Presidente Prudente SP, em comparação ao vírus fixo da raiva, amostra CVS/32 (Challenge Vírus Standard). Os vírus foram reativados por meio de inoculação intracerebral em camundongos e os experimentos de patogenicidade foram realizados em camundongos e hamsters, desafiando-os pelas vias intramuscular (IM), intradérmica (ID), intranasal (IN) e abrasão superficial da pele (AP). A presença do vírus nos cérebros de animais que haviam manifestado sinais compatíveis à raiva, foi confirmada mediante a prova de imunofluorescência direta. Foram considerados para a avaliação da patogenicidade o quadro clínico, proporção de mortos, e a duração dos períodos de incubação (PI) e clínicos (PC) em dias. Em hamsters, o isolado de L. ega exibiu um quadro furioso, com proporção total de mortos de 2.60%; assim discriminada: 2.08% IM (PI: 11 dias; PC: 6 dias) e 8.33% IN (PI:10.66 ± 1.15 e PC: 7.33 ± 1.54). A presença do vírus no SNC foi detectada apenas em animais inoculados por essas vias. Por outro lado, o vírus CVS produziu um quadro paralítico com mortalidade total de 39.84%, com a seguinte distribuição: 62.50% IM (PI 7.50 ± 2.33; PC: 5.13 ± 1.89) 78.12% ID (PI 9.13 ± 2.23; PC 3.88 ± 2.23) 18.75% IN (PI 12.00 ± 2.77; PC 7.14 ± 2.54). Em camundongos, o isolado do L. ega manifestou sinais de agressividade e a raiva foi confirmada em animais inoculados IM e IN. A proporção de mortos observados em camundongos foi de 50.00% (PI 16.80 ± 2.20; PC 1.4 ± 0.54) e 30% (PI 14 ± 4.35; PC: 2.66 ± 0.57) respectivamente e o vírus CVS produziu mortalidade de 45.00% (PI: 6.30 ± 0.67; PC: 1.5 ± 0.70), 70% (PI: 7.14 ± 1.34; PC 2.28 ± 1.25) e 30% (PI:10.00; PC:1) pelas vias mencionadas acima, com quadro clínico de paralisia. O isolado de L. ega mostrou diferenças na proporção de mortos e quadro clínico furioso quando comparado com o CVS nos dois modelos animais. Os resultados sugerem que o contato com os morcegos insetívoros infectados pelo vírus da raiva representa um risco de transmissão da doença, por meio de ferimentos superficiais da pele provocadas pelas mordeduras ou ainda pela via respiratória, supostamente por meio de aerossóis. Pelo sequenciamento completo da proteína G viral do isolado do L. ega, foram observadas substituições na seqüência de aminoácidos nos sítios antigênicos AI, AII, assim como no domínio de fusão dependente de baixo pH. Os resultados obtidos, sugerem que as diferenças no comportamento biológico podem estar associadas às substituições encontradas na sequencia de aminoácidos da proteína G. / The isolation of rabies virus (genotype 1) from the non-hematophagous bats is becoming frequent in heavy urbanized areas in Brazil. This work intended to investigate the pathogenicity of a Brazilian rabies virus isolate from the insectivorous bat Lassiurus ega, from PresidentePrudente-SP, comparing with the CVS/32 (Challenge Virus Standard) fixed rabies virus strain. The viruses were reactivated through intracerebral inoculation into mice and the pathogenicity experiments were made in hamsters and mice, challenged by intramuscular (IM), intradermal (ID) and intranasal (IN) routes and by superficial abrasion of skin. The presence of virus in the brain of animals manifesting the signs compatible with rabies was confirmed by the direct immunofluorescence test. For the evaluation of the pathogenicity, the clinical manifestations, incubation (IP) and clinical (CP) periods in days and the mortality were considered. In hamsters, the isolate of L. ega exhibited a furious form of rabies with total mortality rate of 2.60%, with following distribution: 2.08% IM (IP: 11 days; CP: 6 days) and 8.33% IN (IP: 10.66 ± 1.15 and PC: 7.33 ± 1.54). The presence of rabies virus in the CNS was detected only in animals inoculated through IM and IN routes. The CVS strain has provoked paralytic disease with a total mortality rate of 39.84% as the follow: 62.50% IM (IP 7.50 ± 2.33; CP: 5.13 ± 1.89), 78.12% ID (IP 9.13 ± 2.23; CP 3.88 ± 2.23) and 18.75% IN (IP 12.00 ± 2.77; CP 7.14 ± 2.54). In mice, the isolate of L. ega manifested signs of aggressiveness and rabies was confirmed in animals that were inoculated intramuscularly and intranasally. The total mortality rate observed in mice was 20%, by the IM route was 50% (IP 16.80 ± 2.20; CP 1.4 ± 0.54) and 30% by the intranasal route (IP 14.00 ± 4.35; CP: 2.66 ± 0.57) respectively. The CVS strain showed a total mortality rate of 45.00% and by the IM route, 100% (PI: 6.30 ± 0.67; CP: 1.5 ± 0.70), by the ID route, 70% (IP: 7.14 ± 1.34; CP 2.28 ± 1.25) and by IN, 30% (IP: 10, 00; C: 1.00) showing signs of paralysis. Compared to the CVS strain, the isolate of L. ega showed difference in mortality rate and signs of aggressiveness were found both in hamster and mouse model. The results suggest that the contact with the insectivorous bats infected with rabies virus would represent a risk of disease transmission, by means of superficial wounds of the skin inflicted by bites or by inhalation of aerosols. By the complete sequencing of the viral G protein of the isolate of L. ega, sequencings of amino acids substitutions were observed at antigenic sites AI, AII, as well as the in domain of fusion dependent on low pH. According to the results, differences in the biological behavior may be associated to the substitutions found in the amino acids sequence of the G protein.