In der vorliegenden Arbeit wurde ein Ansatz verfolgt, die besonderen Eigenschaften der Strukturbildung sequenzdefinierter Peptide mit den vielseitigen Materialeigenschaften synthetischer Blockcopolymere zu kombinieren. Dazu wurde ein synthetisches Polymer kovalent mit einer definierten Peptidsequenz verknüpft. Der Peptidblock (die Organisationseinheit) wurde speziell designt, um später die Strukturbildung des Peptid-Polymerkonjugates induzieren und leiten zu können. Als Organisationsmotiv diente hierbei das aus der Natur bekannte β-Faltblatt Strukturmotiv. Das Peptidsegment wurde in einer festphasengebundenen Synthese aufgebaut. Dabei wurden temporäre Stör-Segmente (Switch-Segmente) in die Peptidsequenz integriert. Diese Segmente unterdrücken die Aggregationstendenz während der Synthese und können durch einen pH-abhängigen Schaltvorgang in das natürliche Peptidrückgrat überführt werden. Zusätzlich zu der verbesserten Ausbeute und Reinheit der entsprechenden Peptide war auf diese Weise eine kontrollierte Aktivierung der Mikrostrukturbildung möglich. Mit Hilfe zwei verschiedener Synthesestrategien (Kupplungs- bzw. Polymerisationsstrategie) wurde ein Satz von definierten Peptid-Polymerkonjugaten mit unterschiedlich großen Polymersegmenten synthetisiert. Diese wurden anschließend im Hinblick auf ihre Strukturbildungseigenschaften in organischen Lösungsmitteln untersucht. Durch mikroskopische Verfahren (AFM, TEM), konnte für alle Konjugate, die Bildung faserartiger Aggregate mit Dimensionen im Nano- bis Mikrometerbereich beobachtet werden. Genauere Untersuchungen zeigten, dass die Peptidsegmente in diesen Faserstrukturen ein β-Faltblatt ausbilden. Dies ist ein deutlicher Hinweis darauf, dass die Strukturbildung der Konjugate tatsächlich durch den Peptidblock gesteuert und kontrolliert wurde. / The aim of this work was to combine the particular structuring properties of sequence-defined peptides with the versatile material properties of synthetic block-copolymers. Therefor, synthetic polymers were linked covalently to a defined oligopeptide-sequence using varying synthetic approaches. The oligopeptide was designed to guide and control the microstructure formation of the peptide-polymer conjugate. For this reason a peptide sequence with a high propensity to adopt the β-sheet motif was chosen. Thus, highly attractive, anisometric tape, fibrillar or fibre-like nanostructures can be accessed. However, such peptide-sequences are very difficult to synthesize and handle, as a result of their strong aggregation tendency. Therefore, temporary structure breaking units, so called switch-segments, were integrated into the peptide sequence, disturbing the peptide backbone and thus, temporarily suppressing the peptide properties. The controlled rearrangement of these defects reestablishes the native peptide backbone, switching the aggregation tendency of the peptide segment on, and triggers the assembly process. A set of defined peptide-polymer conjugates with different polymer block-lengths was synthesized either by an coupling approach or by RAFT polymerization using a switch-peptide macro chain transfer agent. Afterwards, the structure formation properties of these conjugates were investigated. By the use of microscopic techniques (AFM, TEM), the formation of densely twisted tape-like microstructures was observed for all conjugates. The formation of extended β-sheets was confirmed by different techniques (FT-IR, TEM-SAED), indicating a peptide guided microstructure formation process. Thus, it could be demonstrated that the peptide guided organization of synthetic polymers can be successfully transferred into organic solvents.

Controlling interactions in synthetic polymers as precisely as in proteins would have a strong impact on polymer science. Advanced structural and functional control can lead to rational design of, integrated nano- and microstructures. To achieve this, properties of monomer sequence defined oligopeptides were exploited. Through their incorporation as monodisperse segments into synthetic polymers we learned in recent four years how to program the structure formation of polymers, to adjust and exploit interactions in such polymers, to control inorganic-organic interfaces in fiber composites and induce structure in Biomacromolecules like DNA for biomedical applications. / Die Kontrolle von Wechselwirkungen in synthetischen Polymersystemen mit vergleichbarer Präzision wie in Polypeptiden und Proteinen hätte einen dramatischen Einfluss auf die Möglichkeiten in den Polymer- und Materialwissenschaften. Um dies zu erreichen, werden im Rahmen dieser Arbeit Eigenschaften von Oligopeptiden mit definierter Monomersequenz ausgenutzt. Die Integration dieser monodispersen Biosegmente in synthetische Polymere erlaubt z. B. den Aufbau von Peptid-block-Polymer Copolymeren. In solchen sogenannten Peptid-Polymer-Konjugaten sind die Funktionalitäten, die Sekundärwechselwirkungen und die biologische Aktivität des Peptidsegments präzise programmierbar. In den vergangen vier Jahren konnte demonstriert werden, wie in Biokonjugatsystemen die Mikrostrukturbildung gesteuert werden kann, wie definierte Wechselwirkungen in diesen Systemen programmiert und ausgenutzt werden können und wie Grenzflächen zwischen anorganischen und organischen Komponenten in Faserkompositmaterialien kontrolliert werden können. Desweiteren konnten Peptid-Polymer-Konjugate verwendet werden, um für biomedizinische Anwendungen DNS gezielt zu komprimieren oder Zelladhäsion auf Oberflächen zu steuern.

Die immunologische Kontrazeption mittels Zona pellucida (ZP) Proteinen gilt als vielversprechender Ansatz für die Reproduktionskontrolle verwilderter Haus- und Wildtierbestände. Da die Applikation von nativer ZP mit Nebenwirkungen verbunden ist, wird die Verwendung einzelner ZP Peptide als Bestandteil kontrazeptiver Vakzine als besonders aussichtsreich erachtet. Das Prinzip dieser nebenwirkungsfreien ZP Immunisierung ist die gezielte Trennung der Entzündungsreaktionen auslösenden T-Zell-Epitope der ZP von den kontrazeptiv wirkenden B-Zell-Epitopen.<br> Niedermolekulare synthetische oder rekombinante Peptide allein sind gering immunogen und können somit keine ausreichende Immunantwort induzieren. Die Verwendung von Peptiden für die immunologische Kontrazeption erfordert daher ein &bdquo;Vakzin-Design&ldquo;, d. h. die gezielte Kombination der Peptide mit immunstimulierenden Substanzen (Liposomen, Carrierproteinen, Adjuvantien). Zielstellung der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung des Potentials synthetischer Peptide für die Immunokontrazeption von verwilderten Hauskatzen (Felis catus). Dazu wurden zunächst relevante B-Zell-Epitope des felinen Zona pellucida Proteins, ZPB2, identifiziert und synthetisiert. Zwei der synthetischen Peptide (P3, P6) wurden zur Herstellung von Antikörpern an BSA konjugiert und zusammen mit Freundschem Adjuvans in Ratten verimpft. Die kontrazeptive Relevanz beider Peptide sowie der Ratten Anti-Peptid Antiseren wurde im in vitro Befruchtungssystem der Hauskatze geprüft. Zur Untersuchung der Immunogenität der Peptide in der Zielspezies Hauskatze erfolgte die Entwicklung von Vakzin-Prototypen für die einmalige Applikation. Neben der Eruierung der Stärke und Dauer der Immunantwort wurde durch Verpaarung der Tiere auch das kontrazeptive Potential in vivo abgeschätzt. / Immunological contraception based on zona pellucida (ZP) proteins is regarded as a promising approach for the control of reproduction in feral domestic and wild animals. Because application of native ZP caused adverse reactions, utilization of single ZP peptides as elements of contraceptive vaccines were considered to bear good prospects. The principle of this ZP immunization is based upon a systematic separation of inflammation triggering T-cell epitopes from the contraceptive B-cell epitopes.<br> The present study evaluates the immunogenicity and contraceptive potential of synthetic feline ZPB2 peptides for immunocontraception in cats (Felis catus). First of all, relevant B-cell epitopes were identified and synthesized. In order to generate antipeptide antibodies two peptides (P3, P6) were chosen and coupled to BSA. Rats were immunized with the conjugation product combined with Freund&prime;s complete adjuvant.<br> The contraceptive efficacy of both peptides and of the anti-peptide antibodies generated were determined using in vitro fertilization of feline oocytes (IVF). To evaluate the peptides immunogenicity in the target species (cat), vaccine-prototypes were developed for a single application protocol. The strength and duration of the immune response was analyzed. Additionally, cats were mated to assess the contraceptive potential of the vaccines in vivo.

Zugl.: Kiel, Univ., Diss., 2009

Das Influenzavirus infiziert Säugetiere und Vögel. Der erste Schritt im Infektionszyklus ist die Anbindung des Viruses über sein Oberflächenprotein Hämagglutinin (HA) an Zuckerstrukturen auf Epithelzellen des respiratorischen Traktes im Wirtsorganismus. Aus den drei komplementaritätsbestimmenden Regionen (complementarity determining regions, CDRs) der schweren Kette eines monoklonalen Hämagglutinin-bindenden Antikörpers wurden drei lineare Peptide abgeleitet. Die Bindungseigenschaften der drei Peptide wurden experimentell mittels Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie untersucht. Es zeigte sich, dass in Übereinstimmung mit begleitenden Molekulardynamik-Simulationen zwei der drei Peptide (PeB und PeC) analog zur Bindefähigkeit des Antikörpers in der Lage sind, Influenzaviren vom Stamm X31 (H3N2 A/Aichi/2/1968) zu binden. Die Interaktion des Peptids PeB, welches potentiell mit der konservierten Rezeptorbindestelle im HA interagiert, wurde anschließend näher charakterisiert. Die Detektion der Influenzaviren war unter geeigneten Immobilisationsbedingungen im diagnostisch relevanten Bereich möglich. Die Spezifität der PeB-Virus-Bindung wurde mittels geeigneter Kontrollen auf der Seite des Analyten und des Liganden nachgewiesen. Des Weiteren war das Peptid PeB in der Lage die Bindung von X31-Viren an Mimetika seines natürlichen Rezeptors zu inhibieren, was die spezifische Interaktion mit der Rezeptorbindungsstelle im Hämagglutinin belegt. Anschließend wurde die Primärsequenz von PeB durch eine vollständige Substitutionsanalyse im Microarray-Format hinsichtlich der Struktur-Aktivitäts-Beziehungen charakterisiert. Dies führte außerdem zu verbesserten Peptidvarianten mit erhöhter Affinität und breiterer Spezifität gegen aktuelle Influenzastämme verschiedener Serotypen (z.B. H1N1/2009, H5N1/2004, H7N1/2013). Schließlich konnte durch Verwendung einer in der Primärsequenz angepassten höher affinen Peptidvariante die Influenzainfektion in vitro inhibiert werden. Damit stellen die vom ursprünglichen Peptid PeB abgeleiteten Varianten Rezeptormoleküle in biosensorischen Testsystemen sowie potentielle Wirkstoffe dar. / The influenza virus infects mammals and birds. The first step of the infection cycle comprises the attachment of the viral surface protein hemagglutinin (HA) on glycan structures on epithelial cells within the respiratory tract of the host organism. Starting from the complementarity determining regions (CDRs) of the heavy chain of a monoclonal hemagglutinin-binding antibody three linear peptides were derived. The binding properties of these peptides was characterized experimentally using surface plasmon resonance spectroscopy. In accordance with accompanying molecular dynamics simulation it was shown, that two of the three peptides (PeB and PeC) were able to bind the influenza virus of the strain X31 (H3N2 A/Aichi/2/1968) comparably to the antibody itself. The interaction of peptide PeB, which was supposed to bind to the conserved receptor binding site at the HA, was then characterized more in detail. The detection of influenza viruses was achieved within the diagnostically relevant concentration range using defined immobilization conditions. The specificity of the peptide-virus-binding was proven by appropriate control experiments. Additionally, peptide PeB was able to inhibit the binding of X31 viruses to mimics of its natural receptor. Furthermore the structure-activity-relationship within all the amino acids of peptide PeB was characterized using a full substitutional analysis in a microarray format. This led to improved peptidic variants, which were able to bind different influenza serotypes and inhibit the influenza infection in vitro. The found peptides and their variants can now be used as receptor molecules in biosensors and also represent potential drug candidates.

Die sichere Diagnose der Lyme-Borreliose und der Nachweis des verursachenden Spirochäten Borrelia burgdorferi bei Mensch und Tier sind problematisch. In Nordamerika ist B. burgdorferi sensu stricto (B. burgdorferi s.s.) die einzige pathogene Spezies, während in Europa und Asien mit B. garinii und B. afzelii mindestens zwei weitere pathogene Arten vorkommen. B. valaisiana, B. spielmanii und B. lusitaniae werden ebenfalls als Verursacher der Lyme-Borreliose diskutiert. Der indirekte Erregernachweis durch Detektion von Antikörpern mittels Antigen aus Borrelienlysat im Zweistufentest (ELISA und Western-Blot) gilt seit langem trotz der anspruchsvollen Interpretationskriterien als Methode der Wahl. Ein hochspezifischer ELISA mit dem synthetischen C6 Peptid als Antigenkomponente ergänzt erst seit wenigen Jahren die Diagnostik. Das C6-Peptid basiert auf der invariablen Region 6, welche eine konstante Region des ansonsten hochvariablen Borrelien-Oberflächenproteins VlsE darstellt. Nur metabolisch aktive Borrelien exprimieren VlsE/C6 Epitope im Säugetierwirt. Studien zeigten, dass C6-Antikörper mehrere Monate nach einer potenziell erfolgreichen antibiotischen Therapie deutlich messbar und langfristig absinken. In Deutschland sind ein C6-Schnelltest (4Dx®SNAP®, IDEXX Inc., USA) und ELISA (Quant C6®, IDEXX Inc., USA) für die Serodiagnostik bei Hunden erhältlich. Über die Anwendbarkeit des C6-Peptids für die kanine Borreliosediagnostik in Deutschland liegen wenige Daten vor, aber zunehmend wird der Ersatz des Zweistufentests durch das C6-Peptid diskutiert. In dieser Arbeit sollte zunächst festgestellt werden, ob potenzielle kanine Infektionen in der Routinediagnostik mit dem C6-Peptid ebenso sensitiv detektiert werden können wie mit dem Zweistufentest und ob C6-positive Hunde nach einer Antibiose mit dem deutlichen Sinken der C6 Antikörperspiegel als Zeichen eines potenziellen Therapieerfolges reagieren. Dafür wurden 510 Sera von Hunden aus verschiedenen deutschen Tierarztpraxen untersucht, wobei neben der serologischen Untersuchung eine Analyse der Vorberichte erfolgte. Eine dort angegebene, bestehende Infektion konnte in 93,3 % der Fälle serologisch nicht bestätigt werden und nur bei 3,3 % der Hunde wurden infektionsspezifische Antikörper ermittelt. Der Zweistufentest und der C6 Schnelltest wiesen hier eine vollständige Übereinstimmung auf. Unabhängig vom Vorliegen klinischer Anzeichen wurden für diese Studie C6-positive Hunde mit Antibiotika behandelt. Vier bis 18 Monaten nach der Therapie wurde von insgesamt 27 Hunden eine zweite Blutprobe untersucht. Die C6 Antikörperspiegel waren bei acht Hunden im ELISA um mindestens 50 % gesunken. Für deutliche Effekte musste aber ein ausreichend hoher initialer C6-Antikörperspiegel vorliegen. Da in Europa mindestens drei pathogene Borrelienarten vorkommen, wurde in einem murinen Infektionsmodell analysiert, ob speziesspezifische C6-Peptide von B. burgdorferi s.s., B. garinii und zwei Varianten von B. afzelii sicher Antikörper detektieren, die durch definierte experimentelle Monoinfektionen mit B. burgdorferi s.s. N40, B. garinii PBi, B. afzelii Slovakia, B. afzelii PKo, B. valaisiana, B. spielmanii oder B. lusitaniae induziert wurden. Um die erfolgreiche Infektion zu belegen, wurden murine Gewebe zur Borrelienisolation in Kulturmedien inkubiert und zusätzlich eine qPCR zum Nachweis von ospA durchgeführt. Eine PCR zur Detektion von essenziellen Plasmiden ergab, dass die B.-lusitaniae- und B.-valaisiana-Isolate nicht infektiös waren. Eine Infektion konnte durch Gewebekultur und qPCR dagegen bei mit B.-burgdorferi-s.s.-, B- garinii-, B.-afzelii- und B. spielmanii-inokulierten Mäusen belegt werden. Die Ergebnisse des C6-Peptid-ELISAs wurden mit dem des Zweistufentests als Goldstandard verglichen und die Sensitivitäten der C6-Peptide ermittelt. Diese betrug bei C6-Peptiden von B. burgdorferi s.s. und B. garinii je 100 % für B.¬burgdorferi¬s.s.¬N40, B. garinii-PBi- oder B.-afzelii-PKo-spezifische C6-Antikörper. Dagegen konnten C6-Peptide basierend auf B. afzelii nur B.-afzelii-PKo-spezifische Antikörper zu 100 % erfassen. Antikörper gegen B. afzelii Slovakia wurden von jedem C6-Peptid schlechter erfasst als Antikörper gegen B. afzelii PKo, was das Vorkommen stamm- oder isolatspezifischer C6-Antikörperfraktionen nahelegt. Die Untersuchung der 27 C6-positiven Hundesera aus der serologischen Studie ergab zudem, dass der Großteil der Sera ausschließlich gegenüber B.-burgdorferi-C6 und B.-garinii-C6 deutlich messbar reagierte. Die Eignung des C6-Peptids in praxi als ein schneller, hochspezifischer Infektionsmarker für den serologischen Nachweis bei Hunden aus Deutschland kann bestätigt werden. Allerdings kann der alleinige Nachweis von C6-Antikörpern weder einen detaillierten Vorbericht, noch den Zweistufentest auf Lysatantigen-Basis ersetzen. Seine Eignung als Marker für einen potenziellen Therapieerfolg ist nur unter definierten Bedingungen gegeben. Die divergenten Sensitivitäten verschiedener C6 Peptidsequenzen gegenüber Antikörpern von in Europa vorkommenden Borrelien-Arten und Isolaten machen deutlich, dass zukünftig weiterer, intensiver Forschungsbedarf bezüglich der Etablierung von ausreichend sensitiven C6-Testsystemen für europäische Bedürfnisse notwendig ist.

Regensburg, Univ., Diss., 2009.

München, Techn. Univ., Diss., 2000.

1 CHARLES UNIVERSITY FAKULTY OF PHARMACY IN HRADEC KRÁLOVÉ DEPARTMENT OF BIOPHYSICS AND PHYSICAL CHEMISTRY DISSERTATION THESIS RADIOLABELED ANTIBODIES - THE PERSPECTIVE FOR DIAGNOSIS AND THERAPY Supervizor: Mgr. PAVEL BÁRTA, Ph.D. HRADEC KRÁLOVÉ, 2017 Bc. JANA MEJTSKÁ 2 ABSTRACT EN Different types of tissues have a characteristic cell morphology. Each cell has typical molecules on its surface, which may be either of physiological or pathological type. The presence of these surface structures can be interesting for possible modulation of specific cell populations from neighboring cells. Utilization of this property is then essential particularly in a case of tumor cells. Targeting on tumor specific cell structures involves the use of receptor specific peptides or monoclonal antibodies. The discovery of the preparation of monoclonal antibodies has opened a new chapter in the treatment and diagnosis not only tumor diseases. The advantage of monoclonal antibodies is their specificity and also high affinity to the type of the target cell structures. This study is focused on the summary of monoclonal antibodies which are currently being applied on the treatment or diagnosis of a particular cancer. Furthermore, this work also includes antibodies which are under development for intended medical applications with...

Sammanfattning Diabetes mellitus karakteriseras av högt blodsocker och är ett samlingsnamn för olika diabetessjukdomar där typ 1-diabetes och typ 2-diabetes är de vanligaste sjukdomarna. Kroppens blodglukoshalter regleras av hormonet insulin som är ett nödvändigt hormon för att kroppens celler ska kunna ta upp kolhydrater, aminosyror och fett. Vid typ 1-diabetes förstörs bukspottkörtelns insulinproducerande betaceller av kroppens eget immunförsvar. Viktiga transplantationsmetoder för att återställa bukspottkörtelns endokrina funktion är pancreas- och öcellstransplantation som båda resulterat i främst minskade akuta hypoglykemier men även förbättrade blodsockervärden och insulinfrihet. Pancreastransplantation är en mer riskfylld operation jämfört med öcellstransplantation och studier har visat på mer postoperativa komplikationer men längre och högre insulinfrihet hos patienter som genomgått pancreastransplantation. Tanken utvecklades till att jämföra litteratur som behandlar studier som jämför pancreas- och öcellstransplantation hos diabetiker avseende komplikationer, glukoskontroll och insulinfrihet. Syftet med arbetet var att göra en jämförelse mellan litteratur som behandlar pancreastransplantation respektive öcellstransplantation hos patienter med diabetes mellitus för att utröna vilken behandling som ger minst komplikationer och behov av insulinbehandling efter transplantation och en uppföljningstid på minst 1 år. Litteraturstudien baseras på 6 kohortstudier som alla erhölls via databasen PubMed. Studierna är utförda i Schweiz, USA, Tjeckien, Kanada och utgår från i grunden samma frågeställning men har delvis olika patienturval och metoder. Studie 2 och studie 5 har betydligt högre studiepopulation än övriga studier vilket ger högre bevisvärde för resultatet i dessa studier. Resultatsammanställningen visar att på både kort och lång sikt är komplikationsrisken betydligt större hos patienter efter pancreastransplantation jämfört med öcellstransplantation. Allvarliga, omedvetna hypoglykemier, som är livshotande tillstånd, är ovanliga hos patienter efter båda typerna av transplantation. På både kort och lång sikt visar pancreastransplanterade patienter betydligt lägre HbA1c-värden och betydligt högre C-peptidvärden jämfört med öcellstransplanterade patienter. Resultatet visar, i linje med tidigare resultat, att insulinfriheten består hos fler pacreastransplanterade patienter och under längre tid jämfört med öcellstransplanterade patienter. Efter 5 år är &gt;50% av pancreastransplanterade patienter insulinfria medan motsvarande siffra hos öcellstransplanterade patienter är &lt;10%.För att besvara syftet har litteraturstudien visat att vid jämförelse mellan litteratur som behandlar pancreastransplantation respektive öcellstransplantation hos patienter med diabetes mellitus ger öcellstransplantation minst akuta komplikationer men pancreastransplantation högst insulinfrihet, minst behov av insulinbehandling, efter transplantation och en uppföljningstid på minst ett år. / Abstract Diabetes mellitus is characterized by hyperglycemia and is a collective name for different diabetic diseases. Type 1 diabetes and type 2 diabetes are the most common diseases. Insulin, which is the regulatory hormone for the body`s blood glucose levels, is necessary for the body`s cells to be able to absorb nutrition like carbohydrates, amino acids and fat. In type 1 diabetes the pancreas insulin-producing beta cells are destroyed by the body`s own immune system. Important transplantation methods to restore pancreatic endocrine function are whole pancreas transplantation and islet transplantation. Both methods of transplantation mainly decreased acute hypoglycaemia and improved blood sugar levels and insulin therapy. Pancreas transplantation is a more risky operation compared to islet transplantation. Patients who have gone through pancreatic transplantation in general have shown more postoperative complications but at the same time also longer periods without insulin therapy compared to patients who have gone through islet transplantation. The aim of this study was to make a comparison between literature dealing with pancreatic transplantation and islet transplantation regarding complications, glucose control and insulin requirements with a follow-up time of at least 1 year. The literature study is based on 6 cohort studies, all obtained through the PubMed database. The studies were conducted in Switzerland, USA, Czech Republic, Canada and are basically based on the same question but have partly different patient selection and methods. Study 2 and study 5 have a significantly higher study population than other studies, which gives higher evidence of the results of these studies. The results compilation shows that in both the short and the long term, the risk of complications is significantly greater in patients after pancreatic transplantation compared to islet transplantation. In both the short and long term, pancreatic transplant patients show significantly lower HbA1c values and significantly higher C-peptide values compared to islet transplant patients. Severe unconscious hypoglycaemia is a life-threatening condition. However, severe unconscious hypoglycaemia is uncommon in patients after both types of transplantation. The result shows, in line with previous results, that insulin freedom persists in higher number of pancreatic transplant patients and for longer period of time compared to islet transplant patients. After 5 years &gt;50% of pancreatic transplant patients are insulin free while the corresponding number in islet transplant patients is &lt;10%. In summary, data presented in this literature study show that islet transplantation give less acute complications, but that whole pancreas transplantation results in better glucose control for a longer time period.