Im Rahmen der hier vorliegenden Doktorarbeit wurde eine 512 Mitglieder umfassende kombinatorische Rezeptorbibliothek auf der Basis eines Guanidiniocarbonylpyrrols mit einer tripeptidischen Seitenkette dargestellt werden. Die kombinatorische Synthese der Bibliothek erfolgte nach der „Split and Mix“ Methode auf Amino-TentaGel als fester Phase in IRORI MikroKans unter Benutzung der IRORI Radiofrequenzcodierung zur Dekodierung der einzelnen Mitglieder der Bibliothek. Die Bibliothek ist für die selektive Erkennung von Tetrapeptiden mit freien C-Termini konzipiert. Als Zielliganden wurden zwei biologisch relevante Modellpeptide ausgewählt, zum einen das Alzheimer Modellpeptid L Val L Val L Ile L-Ala-OH und zum anderen das Tetrapeptid D-Glu-L-Lys-D-Ala-D-Ala-OH, das im Zusammenhang mit dem Aufbau von Zellwänden bei Bakterien eine wichtige Rolle einnimmt. Die Bestimmung von Bindungskonstanten auf der festen Phase erfolgte mit Hilfe eines Fluoreszenzscreenings, wobei die intensive Fluoreszenz eines Dansylrestes ausgenutzt wurde. Es wurden für alle 512 Mitglieder der Bibliothek Bindungskonstanten in Wasser auf der festen Phase für beide Liganden bestimmt. Die Bindungskonstanten für das Alzheimer Modellpeptid variierten von 4200 M-1 für die besten Rezeptoren bis zu 20 M-1, also einem vollständigen Verlust der Bindungsaktivität, für die schlechtesten Rezeptoren. Hierbei zeigte sich, dass die Mehrzahl gut bindender Rezeptoren in Position AA1 eine Lys(Boc) Seitenkette aufwiesen. Anschließend wurden molekulardynamische Rechnungen durchgeführt, um Struktur-Stabilitätsbeziehungen aufstellen zu können. Die auf der festen Phase erhaltenen Ergebnisse konnten durch die Bestimmung von Bindungskonstanten in Lösung durch UV-Titrationen bestätigt werden. Weiterhin wurden Untersuchungen mit einem Rezeptor in der Gasphase mit Hilfe von FT-ICR IRMPD ESI-MS durchgeführt. Darüber hinaus wurden in vitro Untersuchungen zur Inhibierung der Fibrillenbildung der Amyloid Proteine A (1-42) und A (1-40) mit ausgewählten Rezeptoren durchgeführt. Für die kinetische und quantitative Inhibierung der Fibrillenbildung konnten zwei Rezeptoren gefunden werden, die den Nukleationsprozess bei beiden Peptiden signifikant verzögerten und auch zu einer geringeren Menge an gebildeten Amyloid-Plaques gegenüber der Kontrolle führten. Die Bestimmung von Bindungseigenschaften der Rezeptorbibliothek gegen das Tetrapeptid D-Glu-L-Lys-D-Ala-D-Ala-OH, das im Zusammenhang mit der Entwicklung von neuen Antibiotika steht, wurde ebenfalls über fluoreszenzspektroskopische Methoden auf der festen Phase durchgeführt. In diesem Fall wurde nicht nur D-Glu-L-Lys-D-Ala-D-Ala-OH, sondern auch die inverse Sequenz auf Bindungsaktivität untersucht. Hierbei zeigte sich, dass das Bakterien Modellpeptid mit deutlich höheren Bindungskonstanten auf der festen Phase erkannt wurde als das inverse Peptid. Die Bindungskonstanten für D-Glu-L-Lys-D-Ala-D-Ala-OH liegen für die besten Rezeptoren bei 17000 M-1, für die inverse Sequenz nur bei 5500 M-1, obwohl beide Liganden für Rezeptoren mit einem oder zwei Lysinen an Position AA1, AA2 oder AA3 die höchsten Bindungskonstanten aufwiesen. Der Faktor der Bindungskonstanten zwischen sehr gut bindenden Rezeptoren und schlecht bindenden Rezeptoren betrug für beide Peptide über 200! Die besseren Bindungseigenschaften von D-Glu-L-Lys-D-Ala-D-Ala-OH im Vergleich zu der inversen Sequenz konnten durch molekulardynamische Rechnungen darauf zurückgeführt werden, dass das inverse Peptid beide Carboxylate intramolekular über eine Salzbrücke mit der Lysin-Seitenkette stabilisieren kann, während D-Glu-L-Lys-D-Ala-D-Ala-OH nur eine Salzbrücke zu einem der beiden Carboxylate ausbilden kann und das andere Carboxylat somit für eine effektive Komplexierung mit dem Guanidiniocarbonylpyrrol zur Verfügung steht. Die auf der festen Phase erhaltenen Bindungskonstanten für das Bakterien-Modellpeptid konnten ebenfalls durch die Bestimmung von Bindungskonstanten in Lösung durch UV- und Fluoreszenztitrationen bestätigt werden. Kationische Guanidiniocarbonylpyrrol-Rezeptoren sind in der Lage anionische Tetrapeptide mit hohen Assoziationskonstanten, selbst in so polaren Lösemitteln wie Wasser, zu binden. Abschließend kann gesagt werden, dass die Komplexstabilitäten von einer fein abgestimmten Kombination von elektrostatischen und hydrophoben Wechselwirkung abhängen. / A medium sized combinatorial library of 512 members was synthesized on a solid support. Its structure was based on a cationic guanidiniocarbonyl pyrrole receptor as a carboxylate binding motif and a tripeptidic side chain to provide selectivity. The library was synthesized on Amino-TentaGel according to a standard Fmoc protocol following the „split and mix“ approach in combination with the IRORI-radio frequency tagging technology. The library was designed for the molecular recognition of peptides with an unprotected C terminus. Two different biological important peptide models were chosen as targets for the determination of binding constants on solid support as well as in solution: The C-terminal sequence of the Amyloid -protein (1-42) L Val L Val L Ile L-Ala-OH, which is known to be critical for the seeding of amyloid formation and hence has strong implications for the pathogenesis of Alzheimer’s disease and the tetrapeptide D-Glu-L-Lys-D-Ala-D-Ala-OH, which is linked to the antibacterial efficacy of some antibiotics like vancomycin. The determination of the binding constants on solid support was accomplished by a fluorescence binding assay, using the intense fluorescence activity of a dansyl group attached to the tetrapeptide. The use of the IRORI MikroKan technique allowed the determination of binding constants for all members of the library even in water. In this assay the binding constants varied from 20 M 1 for the worst receptor sequences to 4200 M-1 for the best receptors, a discrimination of a factor of 200 among this moderately sized library. The majority of good binders had a Lys(Boc) side chain at position AA1. The binding constants determined on bead could be confirmed by the determination of binding constants of some receptors in solution by UV titrations. In conclusion, cationic Guanidiniocarbonylpyrrole receptors are able to form stable complexes with the Alzheimer model peptide even in highly polar solvents. Furthermore, the activation energy for the dissociation of the noncovalent complex of a trivaline receptor with the Alzheimer model peptide in the gas phase was determined via FT-ICR IRMPD ESI-MS methods. In addition to this the ability of cationic guanidiniocarbonylpyrrole receptors identified in the library screening to inhibit fibril formation of A (1-42) and A (1-40) in vitro were performed. Two receptor sequences were capable of kinetic and quantitative reduction of the formation of fibrils of both proteins.. The determination of binding properties of the tetrapeptide D-Glu-L-Lys-D-Ala-D-Ala-OH with the receptor library was also performed by a fluorescence assay. This ligand is related to bacterial growth and therefore to the development of new antibiotics. For the test of sequence selective peptide binding we used a fluorescent derivative of D-Glu-L-Lys-D-Ala-D-Ala-OH and the inverse sequence. The ligand D-Glu-L-Lys-D-Ala-D-Ala-OH showed distinct higher binding constants on solid phase than the inverse peptide. The association constants of D-Glu-L-Lys-D-Ala-D-Ala-OH for the best receptors are about 17000 M-1. For the inverse sequence the best binders are in the region of 5500 M-1. The tendencies of good binders were, however similar for both sequences. Receptors having two lysine residues at position AA1, AA2 or AA3, belonged to the best binders in both assays. The binding constants vary from the best to the worst receptors by a factor of 200 for both sequences! The binding constants determined on solid support for the peptidoglycan-model peptide could be again confirmed by the determination of binding constants in solution via UV- and fluorescence titrations. Cationic guanidiniocarbonylyprrole receptors are able to recognize tetrapeptides with free carboxylate with high association constants, even in highly polar solvents like methanol or water. As a concluding remark, it can be mentioned that complex stabilities of these peptidic ligands depend on a fine tuned combination of electrostatic and hydrophobic interactions.

Techn. Hochsch., Diss., 2005--Aachen.

Geringe Wasserlöslichkeiten kleiner organischer Wirkstoffkandidaten, sogenannter Leitstrukturen, sind in der Medikamentenentwicklung häufig für das Scheitern vielversprechender Projekte verantwortlich. Um diese Kandidaten dennoch zur Marktreife bringen zu können, wurden verschiedene Strategien entwickelt. Neben der kostenintensiven Strukturoptimierung rücken Formulierungsadditive in den Fokus, die in der Lage sind, Wirkstoffe zu solubilisieren, transportieren und gezielt freizusetzen. In dieser Arbeit wird eine Hochdurchsatz-Screening-Methode präsentiert, die eine schnelle und arbeitsextensive Identifizierung maßgeschneiderter Binder für wasserunlösliche, niedermolekulare Wirkstoffe ermöglicht und mithilfe derer Löslichkeitsvermittler in Form von Peptid-Polymer-Konjugaten mit definierten Solubilisierungs- und Freisetzungseigenschaften realisiert werden können. Dazu werden Peptidbibliotheken in einem zweistufigen Prozess auf Wirkstoffbindung und auf Wirkstofffreisetzung durchsucht. Das Screening kann aufgrund einer innovativen on-chip Immobilisierung der Peptidbibliothek und der intrinsischen Fluoreszenz der niedermolekularen Wirkstoffe halbautomatisiert durchgeführt werden. Vielversprechende Peptidsequenzen können anschließend direkt on-chip mittels MALDI-ToF-MS/MS bzw. fragmentierungsfrei sequenziert und löslichkeitsvermittelnde Peptid-PEG-Konjugate hergestellt werden. In einem Testsystem wurden maßgeschneiderte Peptid-PEG-Konjugate mit unterschiedlichen Freisetzungseigenschaften für einen potentiellen Alzheimer-Wirkstoff realisiert und sowohl Solubilisierungseigenschaften, als auch die Freisetzungseigenschaften in einem vereinfachten Blutplasmamodell mittels Fluoreszenzanisotropie und Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie bestätigt. In Zelltests mit einer Neuro-2a-Zelllinie konnten durch Zugabe der Wirkstoff-Transporter-Komplexe effektiv die Ausbildung der bei einer Alzheimer-Erkrankung auftretenden Tau-Protein-Aggregate bis zu 55 % reduziert werden. / Low water solubility of promising small organic drugs is one of the main reasons for failures during early drug development. Solubilizers promise to overcome these difficulties by solubilization, improved transport and final release of the potential drug candidates, which may result in an approval as a commercial drug. Here, a high-throughput screening method is presented, which is capable of identifying tailor-made peptide-polymer conjugates binding small molecule drugs, which can be used to act as solubilizers with precisely defined drug uptake and release properties. The screening is based on a two-dimensional process, which in a first step identifies strong binders and in a second, characterises their drug release. Due to its innovative on-chip immobilization of the peptide library and the intrinsic fluorescence of the small molecule drugs, the screening can be performed semi-automatically. Promising peptides can be sequenced directly by on-chip fragmentation-free or via MALDI-ToF-MS/MS and subsequently peptide-PEG conjugates can be synthesized. A screening against a high potential Alzheimer´s disease drug resulted in several tailor-made peptide-PEG conjugates with various drug uptake and release characteristics, which were confirmed in additional experiments. Here, loading capacities were determined and release properties analysed with a simplified blood plasma model utilizing fluorescence anisotropy and fluorescence correlation spectroscopy. Cell tests with a Neuro-2a cell line confirmed the effectiveness of the drug-transporter aggregates by reducing the tau-protein concentration by 55 % and inhibiting their aggregation, which is one of the key issues in Alzheimer´s disease.