Phosphodiesterase Type 5 (PDE5) inhibitors are cardioprotective against ischemia/reperfusion (I/R) injury. However, it remains uncertain if I/R affects PDE5. We hypothesized that generation of reactive oxygen species (ROS) during I/R leads to upregulation of PDE5, which contributes to pathological changes following acute myocardial infarction (AMI). Adult male ICR mice were subjected to 30 minutes of in vivo or ex vivo I/R. To examine the role of ROS, a subset of hearts were perfused with 100 µM hydrogen peroxide (H2O2). Expression and activity of PDE5, pPDE5, and cGMP-dependent protein kinase (PKG) were measured by Western blots and spectrophotometric assay. The results show that ischemia and I/R significantly increased expression of PDE5. H2O2 had no effect on PDE5 expression and activity but significantly increased PKG activity. We conclude that acute cardiac ischemia or I/R upregulate PDE5 independent of oxidant stress in the heart.

L’infarctus du myocarde (IC) représente plus de 15 % de la mortalité mondiale liés aux maladies cardiovasculaires (MC). En absence d’une rapide reperfusion des coronaires occluses, aucune intervention thérapeutique n’est capable de limiter les effets délétères de l’IC. Un des moyens les plus efficaces de la cardioprotection, étudié en recherche, est le préconditionnement cardiaque ischémique (PCI). L’adénosine libérée au cours du PCI active via ces récepteurs P1 les voies de cardioprotection. Des études mettent en évidence également l’implication des purinorécepteurs P2Y dans la cardioprotection. Les récepteurs P2Y2, 4 et 6 sont les plus étudiés dans la cardioprotection. Les récepteurs P2Y sont sensibles aux nucléotides comme l’ATP et l’UTP libérés au cours de l’ischémie. Parmi les récepteurs P2Y seul le récepteur P2Y11 est doublement couplé à l’adénylate cyclase et à la phospholipase C (PLC). Il est également le seul récepteur dont le polymorphisme génétique, induisant une perte du signal métabotropique, prédispose à plus de risques d’IC et d’inflammation dans toutes les catégories d’âge indépendamment des facteurs de risques variables de l’IC (Amisten et al., 2007). Ceci suggère un important rôle du récepteur P2Y11 dans la prévention primaire et comme cible thérapeutique de l’infarctus du myocarde. Le β-NAD, nucléotide à base de pyridine, est libéré au cours de l’ischémie comme les médiateurs de cardioprotection notamment l’adénosine, l’ATP et l’UTP. Cependant, aucune étude ne s’est intéressée spécifiquement aux rôles du P2Y11 et des nucléotides pyridiniques, comme médiateurs, dans la cardioportection alors que le NAADP, un métabolite du β-NAD, est rapporté comme agoniste (Moreschi et al., 2008) du récepteur P2Y11. Dans ce travail, nous avons mis en évidence pour la première fois l’augmentation des concentrations interstitielles des métabolites du β-NAD comme le NAADP au cours de l’ischémie. L’augmentation des concentrations du NAADP décrit une cinétique comparable à celle de l’adénosine. Le NAADP extracellulaire ([NAADP]e), appliqué avant un cycle d’ischémie/reperfusion (I/R), déclenche une cardioprotection envers les effets délétères de l’I/R. En effet, le [NAADP]e améliore les fonctions contractiles, réduit les contractures, les arythmies de reperfusion et la taille de l’infarctus, dans un modèle d’I/R cardiaque chez le rat. Ce préconditionnement pharmacologique induit par le [NAADP]e implique les récepteurs P2Y11-like. Dans un modèle de cardiomyocytes, nous mettons en évidence l’activité métabotropique spécifique du récepteur P2Y11-like déclenché par le [NAADP]e. Le [NAADP]e déclenche via le récepteur P2Y11-like l’activation de la PKCε, ERK1/2, AKT et GSK-3β, des protéines kinases de prosurvie cellulaire, ce qui explique ses effets cardioprotecteurs. La phosphorylation des protéines de prosurvie cellulaire nécessite la médiation de la PKA, de la PLC et de la src. Le NF546, un nouvel agoniste sélectif du récepteur P2Y11, déclenche une activité métabotropique semblable à celle du [NAADP]e, confirmant ainsi l’existence fonctionnelle du récepteur P2Y11-like au niveau des cardiomyocytes de rat. L’activation du récepteur P2Y11-like, que ce soit par le [NAADP]e ou le NF546, induit une augmentation des concentrations intracellulaires du β-NAD et de ses métabolites, le NADP, le NAADP, le NAAD et l’ADP ribose cyclique. Le β-NAD, le NAADP comme le NAAD, ont été impliqués dans le déclenchement au niveau intracellulaire des voies de cardioprotection comme la voie des sirtuines et de l’autophagie. Ces mécanismes peuvent être complementaires de l’effet cardioprotecteur du [NAADP]e. L’ensemble de nos données conforte le rôle cardioprotecteur du récépteur P2Y11 et suggère que le NAADP interstitiel accumulé au cours de l’ischémie pourrait avoir un rôle de facteur paracrine de survie cellulaire améliorant la survie des cardiomyocytes au cours des évènements ischémiques. / Myocardial infarction (MI) accounts for more than 15 % of global deaths related to cardiovascular diseases (CD). In the absence of a prompt reperfusion of occluded coronary arteries, none of therapeutic interventions is able to limit the deleterious effects of MI. One of the most effective means of cardioprotection, studied in research, is the ischemic cardiac preconditioning (ICP). Adenosine released during ICP triggers, via P1 receptors, cardioprotective effects. Involvement of the purinoceptors (P2Y) in cardioprotective effects has been also reported. P2Y2,4,6 receptors, the most studied P2Y receptors in cardioprotection, are activated by the nucleotides released during ischemia such as ATP and UTP. Among the P2Y receptors, P2Y11 is dually coupled to Gs and Gq proteins and is the single P2Y receptor which has been linked, via a genetic polymorphism, to an increased risk of acute myocardial infarction and elevated levels of C-reactive protein in humans in all age groups (Amisten et al., 2007). This suggests for the P2Y11 receptor an important role in primary prevention and as a therapeutic target of the P2Y11 receptor for myocardial infarction. β-NAD, a pyridine nucleotide, is released during ischemia like adenosine, ATP and UTP. However, no study has focused on the roles of P2Y11 receptor and pyridine nucleotide in mediating cardioprotective effects while NAADP, a β-NAD metabolite, has been reported as an agonist (Moreschi et al., 2008) of the P2Y11 receptor. In this work, we show, for the first time, increased interstitial concentrations of NAADP during ischemia. Interstitial kinetics of NAADP is similar to adenosine. Using a pharmacological preconditioning protocol, triggered by extracellular NAADP ([NAADP]e) before a prolonged ischemia/reperfusion (I/R), rat hearts rapidly recovered post-ischemic contractile function and displayed attenuated contracture, infarct size and arrhythmogenesis. This pharmacological preconditioning involves the P2Y11-like receptor. In cardiomyocytes culture, [NAADP]e induces specific metabotropic response of the P2Y11-like receptor. [NAADP]e triggers via the P2Y11-like receptor prosurvival protein kinases activation such as PKCε, ERK1/2, AKT and GSK-3β which explains its protective effects. Phosphorylation of prosurvival protein kinases requires the mediation of PKA, PLC and src. As with [NAADP]e, the NF546, a new selective agonist of P2Y11 receptor, triggers a metabotropic activity, thus confirming the functional existence of P2Y11-like receptor in rat cardiomyocytes. Activation of the P2Y11-like receptor, either by [NAADP]e or NF546 induced an increase in intracellular concentrations of β-NAD and its metabolites, NADP, NAADP, NAAD and cyclic ADP ribose. More, β-NAD, NAADP as well as NAAD have been involved in activation of cardioprotective pathways such as sirtuine pathways and autophagy. Taken together, our data demonstrate for the first time that the P2Y11 receptor mediates cardioprotective effects induced by [NAADP]e. NAADP is released during ischemia suggesting that [NAADP]e may act as a paracrine survival factor, prolonging cardiomyocytes lifespan during ischemic events.

Abstract The repair of thoracoabdominal aortic aneurysms carries a substantial risk of ischaemic perioperative spinal cord injury. Although several protective methods have been developed, the risk of paraplegia has not been eliminated. Moreover, aortic aneurysms, including arch aneurysms, are complex clinical challenges requiring cerebral protection with hypothermic circulatory arrest (HCA). Hypothermia lowers the rate of cerebral metabolism and allows a temporary halt of the systemic circulation. However, there is still a risk for cerebral damage and a need for additional neuroprotective methods. During the last 15 years, our research group has used a porcine model to investigate a variety of neuroprotective tools. In this thesis, an animal model was utilized to study the efficacy of remote ischaemic preconditioning (RIPC) to ameliorate ischaemic damage to the central nervous system, and to shed light on the potential mechanism. Moreover, diazoxide, the pharmacological mimetic of RIPC, was tested in the HCA animal model. In the first Study (I), RIPC showed beneficial effect on the spinal cord against ischaemic insult as recorded with motor-evoked potentials. Strikingly, the beneficial effect of RIPC was observed even before the ischaemia. In the second Study (II), some beneficial effect of RIPC was seen in the immunohistochemical analysis of the spinal cord ischemia but the result remains inconclusive. Similarly, the diazoxide-treated animals had better hemodynamic status postoperatively and mildy better antioxidant activity of the brain in the third Study (III). The fourth study (IV) was a review of the current knowledge of RIPC from the cardiovascular point of view. Our studies indicate that RIPC might be a potential adjunct for preventing neuronal ischaemic injury in the setting of thoracoabdominal aortic surgery. Our result indicates that further preclinical studies with diazoxide are required before studies can be conducted in humans. / Tiivistelmä Torakoabdominaalisen aortan aneurysman kirurginen korjaaminen sisältää riskin iskeemiselle selkäytimen vauriolle. Vaikka useita suojaavia tekniikoita on kehitetty, paraplegian riskiä ei ole saatu poistettua kokonaan. Kirurgisen korjaamisen haasteellisuus moninkertaistuu, jos aneurysma on laajentunut myös aortan kaareen. Tällöin vaaditaan hypotermista verenkierron pysäytystä (HCA). Hypotermia alentaa aivojen metabolista aktiivisuutta merkittävästi ja siten verenkierron väliaikainen pysäytys on mahdollista. Tästä huolimatta hypotermiseen verenkierron pysäytykseen liittyy riski aivokudoksen vauriolle. Meidän tutkimusryhmämme on tutkinut useita keskushermostoa suojaavia tekniikoita ja lääkeaineita viimeisen 15 vuoden aikana. Käytämme sikaa koe-eläin mallina, jota on tämänkin väitöskirjan osajulkaisuissa käytetty. Tämän väitöskirjatyön tarkoituksena on ollut tutkia sekä esialtistavan raajaiskemian (RIPC) että farmakologisen mimeetin, diazoxiden, keskushermostoa suojaavia vaikutuksia sekä niiden mahdollista vaikutusmekanismia. Ensimmäisessä osajulkaisussa esialtistava raajaiskemia paransi selkäytimen iskemian sietokykyä, mikä näkyi alaraajojen motorisissa herätepotentiaaleissa. Merkittävintä tutkimuksessa oli, että esialtistavan raajaiskemian edulliset vaikutuksen selkäytimeen oli nähtävissä jo ennen iskemiaa. Toisessa osajulkaisussa esialtistava raajaiskemialla oli nähtävissä edullisia, mutta ei varauksettomia, vaikutuksia selkäytimen iskemian immunohistokemiallisessa analyysissä. Kolmannessa osatyössä diazoxidin vaikutukset iskemiaa vastaan nähtiin parempana hemodynaamisena tilana ja antioksidatiivisen aktiivisuuden lisääntymisenä aivoissa, mutta tulos on myös tulkinnanvarainen. Neljäs osajulkaisu kokosi tämän hetken tietämyksen esialtistavasta raajaiskemiasta. Tutkimuksissamme osoitimme, että esialtistava raajaiskemiassa on potentiaalia tulla yhdeksi välineeksi keskushermoston iskemiaa vastaan torakoabdominaalisen aortan kirurgiassa. Lisäksi diazoxidin mahdolliset neuroprotektiiviset vaikutukset vaativat lisää koe-eläintutkimuksia ennen ihmiskokeisiin siirtymistä.

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