Thesis (Ph. D.)--University of Missouri--Columbia, 2001. / Typescript. Vita. Includes bibliographical references (leaves 143-156). Also available on the Internet.

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Reversible phosphorylation is a major mechanism for regulating the activity, localization and stability of proteins required for vital cellular processes such as glucose metabolism, gene expression, establishment of polarity, mitosis and cytokinesis. Phospho-regulation is driven by the activities of kinases and phosphatases. Together, these enzymes account for ∼3% of eukaryotic genomes and it is estimated that 30% of the eukaryotic proteome is composed of phospho-proteins. Protein kinases (PKs) have been studied extensively, however relatively little is known regarding the signaling networks of protein phosphatases (PPases). The identification of PPase functional networks has been slow due to the redundant nature of the majority of PPases, the complexity of their substrate recognition in vivo, and the lack of large-scale analyses that would facilitate network analysis. We hypothesized that large-scale analysis of genetic interactions using the Synthetic Genetic Array (SGA) and proteomic analyses using 2D-PAGE Difference Gel Electrophoresis (DiGE) could reveal PPase functional networks. Here, we apply this approach to the essential and conserved PP1 PPase Glc7 as it regulates numerous cellular processes in budding yeast. For this study, we created a glc7 hypomorphic mutant (glc7-E101Q) suited for both SGA and DiGE analyses. SGA analysis of glc7-E101Q revealed a broad network of 147 synthetic sick/lethal (SSL) and 178 synthetic rescue (SR) interactions. DiGE comparison of the glc7-E101Q proteome relative to wild-type at medium-resolution (∼1000 proteins) revealed alterations in 39 proteins that changed as a consequence of both the mutation and growth conditions. One of the proteins identified in this analysis was Eno1, a non-essential enolase that is mis-regulated in the presence of glucose and identified a SR mutation in the glc7-E101Q SGA. Subsequent phenotypic analysis suggests a novel, non-metabolic role for Eno1 in the Glc7 interaction network. Our results reveal that parallel analysis, using SGA and DIGE, can reveal novel functions and networks that a single analysis may not detect.

Thesis (M.S.)--Youngstown State University, 2009. / Includes bibliographical references (leaves 57-66). Also available via the World Wide Web in PDF format.

Thesis (Ph. D.)--University of Virginia, 2007. / Title from title page. Includes bibliographical references. Also available online through Digital Dissertations.

The mammalian Vasodilator Stimulated Phosphoprotein (VASP) is a founding member of the Ena/VASP family of proteins that includes Drosophila Enabled (ena), the mammalian Ena homologue (Mena) and the Ena-VASP-like protein (Evl). VASP was initially discovered and characterized as a substrate for cGMP- and cAMP-dependent protein kinases (cGKs and cAKs). Ena/VASP proteins are involved in Actin-filament formation, plasma membrane protrusion, acceleration of Actin-based motility of Listeria and the establishment of cell-cell adhesion. Moreover, Ena/VASP proteins have been implicated as inhibitory factors in repulsive axon guidance and inhibition of plasma membrane activity and random motility in fibroblast. In order to study the physiological function of VASP, VASP-deficient mice had been generated in the laboratory by homologous recombination. VASP-/- mice showed hyperplasia of megakaryocytes in the bone marrow and spleen and a two-fold increase in thrombin- and collagen-induced platelet activation. To further investigate the cellular function of VASP, I established cardiac fibroblast cell lines derived from both wild type and VASP-/- mice. Both cell lines presented similar growth rates and normal contact dependent-growth inhibition but showed differences in morphology, migration and adhesion. Adherent VASP-/- cells, despite normal Mena and Evl expression levels, were highly spread. VASP-/- cells covered about twice the substrate surface area as wild type cells, while the cell volumes were unchanged. This shape difference suggests that VASP is involved in the regulation of spreading. Since the small GTPases Rac and Cdc 42 and their effector p21-activated kinase (Pak) are key regulators of lamellipodia formation and cell spreading, I analyzed this signalling pathway in VASP-/- cells stimulated with Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) or fetal calf serum. In wild type cells Rac and Pak were rapidly and transiently activated by PDGF or serum; however, in the absence of VASP both Rac and Pak activation was dramatically prolonged. The Rac/Pak pathway is known to play an essential role in cell motility. VASP deficient cells showed compromised migration and reorientation in a wound healing assay, probably due to enhanced Rac activity. The spreading phenotype, compromised migration and the effect observed on the Rac and Pak activities were reverted in VASP-/- cells stably transfected with full lenght human VASP, indicating a VASP dependent modulation of the Rac/Pak pathway and Rac/Pak regulated processes. Moreover, adhesion and detachment of VASP-deficient cells were significantly slower when compared to wild type cells. Preincubation of VASP+/+ cells with a cGMP analog accelerated adhesion. This acceleration did not take place in the VASP-/- cells, suggesting a VASP dependent effect. The second part of this work focused on VASP function in platelets. On the one hand I investigated the possibility of VASP-dependent Rac regulation in mouse platelets. Murine platelets are a good model for studying Rac regulation since they express high levels of VASP but not Mena/Evl and since VASP-deficient platelets show an increased platelet activation. Rac was activated by platelet agonists which was inhibited by preincubation with cGMP and cAMP analogs. Initial results which need to be extended showed that the cGMPcaused inhibition of Rac activation was VASP-dependent. Finally, in vivo platelet adhesion (platelet-vessel wall interactions) was studied using VASP-deficient mice. These studies demonstrated in-vivo that VASP down regulates platelet adhesion to the vascular wall under both physiological and pathophysiological conditions. / Das Säugerprotein Vasodilator Stimulated Phosphoprotein (VASP) ist ein Gründungsmitglied der Ena/VASP Proteinfamilie, die das Drosophila Enabled (ena), das homologe Säugerprotein ena (Mena) und das Ena-VASP-like Protein (Evl) einschließt. VASP wurde ursprünglich als ein Substrat von cGMP- und cAMP abhängigen Proteinkinasen (cGKs und cAKs) entdeckt und charakterisiert. Ena/VASP Proteine sind bei der Polymerisation von Aktinfilamenten, bei der Protrusion von Plasmamembranen, der Beschleunigung von Aktinbasierter Beweglichkeit von Listerien und bei der Ausbildung von Zell-Zell-Adhäsionen beteiligt. Außerdem wurde gezeigt, dass Ena/VASP-Proteine hemmende Faktoren bei der repulsiven Axonführung sind und sowohl die Plasmamembranaktivität als auch die ungerichtete Fibroblastenbeweglichkeit hemmen. Um die physiologische Funktion von VASP zu untersuchen, wurden VASP-defiziente Mäuse im Labor durch homologe Rekombination generiert. VASP-/- Mäuse zeigten eine Hyperplasie der Megakaryozyten im Knochenmark und in der Milz sowie eine zweifache Erhöhung der durch Thrombin und Kollagen induzierten Plättchen-Aktivierung. Um die zelluläre Funktion von VASP weiter aufzuklären, etablierte ich kardiale Fibroblasten- Zelllinien sowohl von Wildtyp als auch von VASP-/- Mäusen. Beide Zelllinien zeigten gleiche Wachstumsraten und eine normale, kontaktabhängige Wachstumshemmung, hatten aber Unterschiede in ihrer Morphologie, Wanderung und Adhäsion. Adhärente VASP-/- Zellen waren trotz normaler Mena und Evl Expression stark ausgebreitet. VASP-/- Zellen bedeckten eine ungefähr zweimal so große Substratoberfläche wie Wildtyp-Zellen, während das Zellvolumen unverändert war. Diese Formunterschiede lassen vermuten, dass VASP bei der Regulation der Ausbreitung involviert ist. Da die kleinen GTPasen Rac und Cdc 42 und ihr Effektorsystem p21-aktivierte Kinase (Pak) Schlüsselregulatoren der Lamellipodienformierung und der Zellausdehnung sind, untersuchte ich diesen Signalweg in VASP-/- Zellen, die mit Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) oder fetalem Kälberserum stimuliert wurden. In Wildtypzellen wurden Rac und Pak schnell und transient durch PDGF oder Serum aktiviert, in der Abwesenheit von VASP war die Aktivierung von Rac und Pak jedoch dramatisch verlängert. Der Rac/Pak Signalweg ist dafür bekannt, dass er eine essentielle Rolle bei der Zellbeweglichkeit spielt. VASP defiziente Zellen zeigten, wahrscheinlich wegen der erhöhten Rac Aktivität, eine veränderte Wanderung und Reorientierung in einem Wundheilungs-Versuch. Der ausgebreitete Phänotyp, die veränderte Wanderung und die beobachteten Effekte bei den Rac und Pak Aktivitäten wurden in VASP-/- Zellen, die stabil mit humanem VASP transfiziert wurden, normalisiert, was eine VASP abhängige Steuerung des Rac/Pak Signalwegs und der Rac/Pak regulierten Prozesse vermuten läßt. Weiterhin waren die Adhäsion und die Ablösung von VASP-defizienten Zellen signifikant langsamer als in den Wildtyp-Zellen. Die Vorinkubation von VASP+/+ Zellen mit einem cGMP-Analog beschleunigte die Adhäsion. Diese Beschleunigung fand in VASP-/- Zellen nicht statt, was einen VASP-abhängigen Effekt vermuten läßt. Der zweite Teil dieser Arbeit konzentrierte sich auf die VASP Funktion in Thrombozyten. Einerseits untersuchte ich die VASP-abhängige Regulation von Rac in murinen Thrombozyten. Diese sind dafür besonderes gut geeignet, da sie VASP aber nicht Mena/Evl exprimieren und da VASP-defiziente Thrombozyten verstärkt aktiviert werden. Rac wurde durch Thrombozyten-Agonisten aktiviert, was durch eine Präinkubation mit cGMP- und cAMP-Analoga gehemmt wurde. Erste Ergebnisse, die noch einer weiteren Bestätigung bedürfen, zeigten, daß die cGMP-vermittelte Hemmung der Rac-Aktivierung VASP-abhängig war. Abschließend wurde auch die in-vivo Plättchen-Adhäsion (Thrombozyten-Gefäßwand- Interaktion) unter Einsatz von VASP-defizienten Mäusen untersucht. Diese Ergebnisse zeigten für in-vivo-Bedingungen, daß VASP die Thrombozyten-Adhäsion an die Gefäßwand sowohl unter physiologischen als auch pathophysiologischen Bedingungen unterdrückt.

Das Vasodilatator stimulierte Phosphoprotein (VASP) ist ein Zytoskelett-assoziiertes Protein der Ena (Enabled)/VASP-Proteinfamilie. Seine Funktionen bezüglich Aktin- Polymerisation, Thrombozyten-Aggregation, Wachstumskegel-Führungsprozessen und Motilität sowohl von Zellen als auch von Listerien sind bisher nur unvollständig charakterisiert. In dieser Arbeit konnte ich zeigen, wie die VASP-F-Aktin Interaktion in vitro durch die Phosphorylierung zweier Aminosäuren von VASP reguliert wird. Transfektions-Experimente mit VASP und RhoA deuten eine mögliche Beteiligung von VASP im Signalweg von RhoA an. Zudem führen Überexpression und Deletion von VASP in Zellen zu demselben Stressfaser-Phänotyp, der unabhängig vom stimulierenden Einfluss von Serum ist. In VASPdefizienten Fibroblasten ist außerdem die Membranrigidität und die Phosphorylierung der leichten Kette des Myosins erhöht, was auf ein stabileres und stärker kontrahiertes Aktin- Zytoskelett in diesen Zellen schließen lässt. Die Regulation und Organisation des Aktin- Zytoskeletts beeinflusst auch die zelluläre Adhäsion, die in VASP-defizienten Zellen verändert ist. VASP-defiziente Zellen adhärieren signifikant stärker an Fibronektinbeschichtete Perlen als Wildtyp-Zellen. Der Widerstand dieser Perlen gegenüber mechanischen Kräften ist in VASP (-/-) Zellen signifikant erhöht. Dieser Unterschied beruht in erster Linie auf dem verstärkten Aktin-Zytoskelett in diesen Zellen und ist unabhängig von Mikrotubuli. Messungen mit rekonstituierten Zelllinien zeigen zudem eine VASPAbhängigkeit dieses Effekts. Der GTPase Rap1 kommt eine wichtige Bedeutung bei der Integrin-abhängigen Adhäsion von Zellen zu. Aktivierung von Epac, einem Guanin-Nukleotid- Austauschfaktor von Rap1, führt in Wildtyp-Zellen zur Verstärkung des Widerstandes gegenüber mechanischen Kräften, die auf Fibronektin-beschichtete Perlen wirken, ohne dabei die Membranrigidität zu verändern. Diese Kraft-Verstärkung wird weder vom Aktin- noch vom Mikrotubuli-Zytoskelett beeinflusst. Es exisitiert daher ein Mechanismus, bei dem die Länge von elastischen Membranfortsätzen unabhängig von der Membranfestigkeit und dem Aktin-Zytoskelett reguliert wird. Diese Experimente zeigen, dass VASP eine wichtige Rolle bei der Stabilität und Kontraktilität des Aktin-Zytoskeletts, der Membranrigidität sowie bei der zellulären Adhäsion spielt. Die vorliegenden Ergebnisse weisen darauf hin, dass hierbei weniger die direkte Interaktion von VASP mit dem Aktin-Zytoskelett von Bedeutung ist, sondern viel mehr seine mögliche Funktion als Gerüstprotein (Scaffold), das eine geregelte Signaltransduktion organisiert. / The actin-cytoskeleton associated protein VASP (vasodilator stimulated phosphoprotein) is a founding member of the Ena (enabled)/VASP protein family. Its function in actinpolymerisation, platelet aggregation, axon-guidance, cell motility and Listeria monocytogenes is yet not completely understood. In this work I could show that the phosphorylation of two amino acid residues of VASP diminishes its interaction with F-actin. Transfection experiments with VASP and RhoA suggest a possible role for VASP in the RhoA signalling pathway. Both, overexpression and deletion of VASP results in a similar stressfiber phenotype, which is independent of the stimulatory effect of serum. Furthermore membrane rigidity and myosin light chain phosphorylation in VASP deficient cells is increased, indicating a more contracted and rigid cytoskeleton in these cells. Cell adhesion is influenced by the regulation and organisation of the actin-cytoskeleton. VASP deficient cells not only adhere significantly stronger to fibronectin-coated beads but also resistance to displacement by mechanical forces is enhanced. This effect results from greater stability of the actin-cytoskeleton while there is no evidence for microtubuli involvement. Experiments with reconstituted VASP (-/-) cell lines proof this effect being VASP-dependent. The GTPase Rap1 is an important regulator of integrin-dependent cell adhesion. Activation of Epac, a guanine nucleotid exchange factor for Rap1, in wildtyp cells leads to enhanced resisting forces to mechanical displacement of fibronectin-coated beads while membrane rigidity remains unchanged. This phenomenon is neither dependent on F-actin nor microtubuli indicating a modulation of membrane tethers independently of membrane rigidity. These results show that VASP is an important regulator of actin-cytoskeletal stability and contractility, as well as membrane rigidity and cell adhesion. Furthermore these data suggest a possible role for VASP as a scaffold protein organising intracellular signal transduction.

Thesis (Ph. D.)--University of Missouri--Columbia, 2003. / "August 2003." Typescript. Vita. Includes bibliographical references (leaves 158-174). Also issued on the Internet.

Thesis (Ph. D.)--University of Missouri-Columbia, 2004. / Typescript. Vita. Includes bibliographical references (leaves 112-125). Also available on the Internet.

Thesis (Ph. D.)--University of Missouri-Columbia, 2004. / Typescript. Vita. Includes bibliographical references (leaves 112-125). Also available on the Internet.