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Mécanismes de photo-commutation réversible des protéines fluorescentes / Reversible photoswitching mechanism of the Fluorescent ProteinsRegis Faro, Aline 27 September 2012 (has links)
La propriété d’être réversiblement commutable de certaines protéines fluorescenteshomologues à la GFP ouvre un vaste champ d’applications possibles: notamment le biostockagede données à haute densité et la microscopie à super résolution. Parmi ces protéines,on trouve plusieurs variantes de la GFP, notamment la protéine jaune YFP, et des protéinesfluorescentes issues d'espèces marines Anthozoaires, comme Dronpa ou Padron. Plusieursétudes structurales indiquent que ces protéines fluorescentes photochromiques commutent parisomérisation et protonation couplées du chromophore. Cependant, la synchronisation entreces deux événements, le détail des mécanismes de photo-commutation, et le rôle de ladynamique conformationelle restent incomplètement compris. Par l'utilisation combinée de lacristallographie cinétique et de la spectroscopie optique in cristallo à basse température, nousavons comparé le comportement des protéines YFP, Dronpa et IrisFP, et nous avons étudié endétail le mécanisme photo-physique de commutation chez la protéine Padron. Contrairement àDronpa et IrisFP, la photo-commutation d’YFP est plus efficace à basse température qu’àtempérature ambiante. Nos résultats suggèrent que le mécanisme de commutation d’YFPn'implique pas de changement conformationel majeur, mais plutôt une protonation photoinduitedu chromophore ne nécessitant pas d'isomérisation. Au contraire, les études réaliséessur la protéine Padron nous ont permis de montrer que, dans ce cas, l’isomérisation duchromophore peut se produire indépendamment de sa protonation, et, étonnamment, àtempérature cryogénique. De plus, deux états intermédiaires ont pu être caractérisés au coursdu processus de photo-commutation. La protéine Padron a permis de mettre à jour le premiermarqueur codable génétiquement qui soit efficacement photo-commutable à températurecryogénique. / The property to be reversible switchable of some homologues fluorescents protein ofGFP open a large field for possible applications: such as, high-density data bio-storage andsuper-resolution microscopy. Between these proteins, we find several variants of GFP, such asyellow fluorescent protein, YFP, and fluorescents protein from marine Anthozoary species, asDronpa or Padron. Several structural studies suggest that these fluorescent proteins switch viaisomerization coupled with the protonation of the chromophore. However, thesynchronization between these processes, the detail about the photo-switching mechanism,and the role of conformational dynamics remains unclear. In combination of the kineticcrystallography and the optic spectroscopy in cristallo at low temperature, we have comparedthe YFP behavior, Dronpa and IrisFP, and we have studied in detail the photo-physicmechanism of Padron switching. In contrast to Dronpa and IrisFP, the YFP photoswitching ismore efficient at low temperature than at room temperature. Our results suggest that theYFPswitching is not associated to large structural rearrangements, but mostly a photo-inducedprotonation of the chromophore without isomerization. On the contrary, the studies done withPadron allowed us to show, in this case, the chromophore isomerization can be producedindependently of the protonation, at cryo-temperatures. Moreover, two intermediate stateswere revealed in the photo-pathway. Padron fluorescent protein allows to advance the firstgenetically inserted dye, being photo-switchable at cryogenic temperature
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