Early life is critical for the development of an organism. External factors alter placental efficiency which can lead to consequential effects. The objective of the current study was to (1) examine placental characteristics and molecular factors affected by nutrient restriction (2) evaluate the mitigating properties of melatonin in a nutrient restricted pregnancy in regard to circadian, myogenic and adipogenic factors in fetal muscle and (3) evaluate the effects of prenatal and postnatal melatonin supplementation on offspring performance. In study 1, cows were fed a control (CON) or a 60% restricted (RES) diet from day 140 to 240 of gestation. Animals were slaughtered for placentome collection. Nutrient restriction increased vessel perimeter, downregulated genes related to blood vessel development, and upregulated ribosomal and translation factor expression. In lieu of downregulated vessel development, a compensatory effect geared towards nutrient-transport apparent. The 2nd study utilized spring-calving and fall-calving heifers in two trials with a 2 x 2 x 2 factorial design. Treatments were adequately-fed (ADQ) or 60% restricted (RES) dams along with melatonin (MEL) or no melatonin (CON) from day 160 to 240 of gestation. Cesarean sections were performed either in the morning (AM) or afternoon (PM). Circadian, myogenic and adipose-related factors in fetal loin muscle (LM) were analyzed. Fetal LM from the spring-calving (fall) group experienced a downregulation of circadian genes, myogenic genes and tendency for downregulation in lipolysis genes. Fetal LM collected from the fall-calving (summer) group had interactions in myogenic expression. Results demonstrate photoperiod and seasonal effects on nutrient restriction and melatonin supplementation in regard to tissue prioritization. In study 3, melatonin was supplemented to calves during the prenatal and postnatal period in a 2 x 2 factorial design. Supplementation did not alter offspring performance. A lack of differences may be attributed to similar endogenous melatonin levels in dams. Despite no differences in calf performance, tendencies for decreased milk yield and fat were observed in MEL versus CON dams. This demonstrates that melatonin may influence feed efficiency in calves that receive less nutrients during early life. The programming effects of melatonin after birth appear to be low.

A placenta dos mamíferos é um órgão transitório formado pela justaposição das membranas fetais e tecidos maternos, sendo responsável pelas trocas fisiológicas entre o feto e a mãe e pela síntese de hormônios fundamentais para o sucesso da gestação. O crescimento placentário e a nutrição fetal requerem altas taxas de crescimento e diferenciação celular, sendo fundamental um balanço adequado entre proliferação e morte celular das células trofoblásticas placentárias. Estas células possuem propriedades particulares no que diz respeito a suas funções metabólicas, endócrinas e angiogênicas, porém a atividade proliferativa destas células em diferentes regiões da placenta bovina é desconhecida. Neste estudo, levantamos a hipótese de que as células de diferentes regiões placentárias de bovinos devem apresentar padrões distintos de atividade proliferativa e morte celular, podendo ser algumas regiões mais ou menos responsáveis pelo desenvolvimento fetal ao longo da prenhez. Para testar esta hipótese, analisamos as células de diferentes regiões da placenta e em diferentes estágios gestacionais através de citometria de fluxo e coloração com marcador histoquímico, além de observações macroscópicas e histológicas para avaliar a morfologia da placenta e suas regiões. Foram analisadas as regiões: central e marginal dos placentônios, área interplacentomal, microplacentônios (≤1,0cm) e fusões placentomais. Por meio da citometria de fluxo realizamos uma distribuição das células placentárias nas diferentes fases do ciclo celular, observando a porcentagem de células em proliferação e apoptose. Em nossos resultados, encontramos particularidades macroscópicas, histológicas e metabólicas nas células de cada região placentária. A margem do placentônio apresentou um aumento prematuro de células em apoptose, com um aumento crescente a partir de 170 dias até o final da gestação, sugerindo que nesta região se inicie a desconexão placentomal. As áreas interplacentomais e fusões de placentônios apresentaram um equilíbrio na atividade proliferativa ao longo da gestação, sugerindo que a proliferação celular possua uma menor importância para a homeostase tecidual nestas regiões. Os microplacentônios apresentaram uma atividade proliferativa mais lenta, porém crescente ao longo da gestação, sugerindo pouca contribuição destas estruturas para a liberação placentária. Estes achados estão de acordo com nossa hipótese de que cada região placentária contribui de forma distinta para o crescimento da placenta bovina, cada uma delas participando de maneira particular no processo de maturação e desconexão placentária e no crescimento e nutrição fetal ao longo da gestação. O entendimento das taxas proliferativas e apoptóticas é importante para a compreensão da patogênese das perdas embrionárias e anormalidades no desenvolvimento placentário. A descrição dos processos de proliferação e morte celular em diferentes regiões da placenta de gestações bovinas poderá ajudar a elucidar processos fisiológicos desconhecidos relacionados ao desenvolvimento do concepto e a falhas gestacionais. Espera-se que este estudo forneça elementos essenciais à melhor compreensão do desenvolvimento placentário, estabelecendo padrões de normalidade para cada região da placenta bovina e auxiliando na compreensão dos mecanismos de falhas gestacionais que levam a anormalidades fetais e placentárias, muito comuns em técnicas avançadas de manipulação embrionárias, como a fertilização in vitro, a produção de animais transgênicos e a clonagem animal. / The mammalian placenta is a transitory organ consisting of maternal-fetal tissues union, responsible for nutrient exchange and synthesis of many hormones which are essential for success of the gestation. Placental growth and fetal nutrition require high rates of cellular turnover and differentiation, and a balance between proliferation and apoptosis in the trophoblastic cells are essential to the placental development. The trophoblastic cells, that form the fetal portion of placenta, has unique properties and a wide range of metabolic, endocrine and angiogenic functions, but the proliferative profile of those cells. In this study we hypothesed that cells from different placental regions on bovine placenta must reveal distinct patterns of proliferative activity and apoptosis, and some regions may be potentially responsible to distinct modulation patterns in fetal growth and nutrition throughout pregnancy. We analyzed cells form different regions of normal bovine placenta, namely the central region of the placentome, the placentomes edges, interplacentomal areas, placentomal fusion, and microplacentomes (≤1.0cm). The cells of those regions were analyzed by flow cytometry and with a histochemical marker, as well as macroscopical and histological analysis. Using flow cytometry we performed the percentage of cells in each cell cycle phase, including apoptosis. Our findings indicated macroscopical, histological and metabolic particularities in different placental region. The edges of the placentome revealed a premature increase in apoptotic cells, with a significantly higher number of apoptotic cells from 170 days of gestation. That suggests this region to be the point of initiation of placentomal detachment in cattle. Interplacentomal areas and placentomal fusions showed no significant variations during pregnancy, suggesting that proliferation is minor importance for tissue homeostasis in those regions. Microplacentomes revealed a lower but an ascending proliferative activity, that suggests the relatively small role of those structures, with microplacentomes not contributing significantly to normal of placental functions and conceptus development during pregnancy. Taken together, the complete understanding of placental apoptotic and proliferative profiles at distinct placental tissue regions during gestation will shed light to unknown physiological processes related to conceptus development, as some regions may be potentially responsible, at different degrees of influence, to distinct modulation patterns in fetal growth and nutrition throughout pregnancy. In that regard, results from the present study using non-manipulated bovine gestations indicated that proliferation and apoptosis exhibit patterns that are specific for the individual placental areas during gestation and at term in normal, non-manipulated pregnancies in cattle. Variations involving proliferation and apoptotic rates may influence placental maturation and detachment, compromising placental functions and leading to fetal stress, abnormalities in development and abortion, as frequently seen in bovine pregnancies from in vitro fertilization and cloning procedures. Our findings describing the pattern of cell proliferation and apoptosis in normal bovine pregnancies may be useful for unraveling some of the developmental deviations frequently seen in nature and after in vitro embryo manipulations.

A placenta dos mamíferos é um órgão transitório formado pela justaposição das membranas fetais e tecidos maternos, sendo responsável pelas trocas fisiológicas entre o feto e a mãe e pela síntese de hormônios fundamentais para o sucesso da gestação. O crescimento placentário e a nutrição fetal requerem altas taxas de crescimento e diferenciação celular, sendo fundamental um balanço adequado entre proliferação e morte celular das células trofoblásticas placentárias. Estas células possuem propriedades particulares no que diz respeito a suas funções metabólicas, endócrinas e angiogênicas, porém a atividade proliferativa destas células em diferentes regiões da placenta bovina é desconhecida. Neste estudo, levantamos a hipótese de que as células de diferentes regiões placentárias de bovinos devem apresentar padrões distintos de atividade proliferativa e morte celular, podendo ser algumas regiões mais ou menos responsáveis pelo desenvolvimento fetal ao longo da prenhez. Para testar esta hipótese, analisamos as células de diferentes regiões da placenta e em diferentes estágios gestacionais através de citometria de fluxo e coloração com marcador histoquímico, além de observações macroscópicas e histológicas para avaliar a morfologia da placenta e suas regiões. Foram analisadas as regiões: central e marginal dos placentônios, área interplacentomal, microplacentônios (≤1,0cm) e fusões placentomais. Por meio da citometria de fluxo realizamos uma distribuição das células placentárias nas diferentes fases do ciclo celular, observando a porcentagem de células em proliferação e apoptose. Em nossos resultados, encontramos particularidades macroscópicas, histológicas e metabólicas nas células de cada região placentária. A margem do placentônio apresentou um aumento prematuro de células em apoptose, com um aumento crescente a partir de 170 dias até o final da gestação, sugerindo que nesta região se inicie a desconexão placentomal. As áreas interplacentomais e fusões de placentônios apresentaram um equilíbrio na atividade proliferativa ao longo da gestação, sugerindo que a proliferação celular possua uma menor importância para a homeostase tecidual nestas regiões. Os microplacentônios apresentaram uma atividade proliferativa mais lenta, porém crescente ao longo da gestação, sugerindo pouca contribuição destas estruturas para a liberação placentária. Estes achados estão de acordo com nossa hipótese de que cada região placentária contribui de forma distinta para o crescimento da placenta bovina, cada uma delas participando de maneira particular no processo de maturação e desconexão placentária e no crescimento e nutrição fetal ao longo da gestação. O entendimento das taxas proliferativas e apoptóticas é importante para a compreensão da patogênese das perdas embrionárias e anormalidades no desenvolvimento placentário. A descrição dos processos de proliferação e morte celular em diferentes regiões da placenta de gestações bovinas poderá ajudar a elucidar processos fisiológicos desconhecidos relacionados ao desenvolvimento do concepto e a falhas gestacionais. Espera-se que este estudo forneça elementos essenciais à melhor compreensão do desenvolvimento placentário, estabelecendo padrões de normalidade para cada região da placenta bovina e auxiliando na compreensão dos mecanismos de falhas gestacionais que levam a anormalidades fetais e placentárias, muito comuns em técnicas avançadas de manipulação embrionárias, como a fertilização in vitro, a produção de animais transgênicos e a clonagem animal. / The mammalian placenta is a transitory organ consisting of maternal-fetal tissues union, responsible for nutrient exchange and synthesis of many hormones which are essential for success of the gestation. Placental growth and fetal nutrition require high rates of cellular turnover and differentiation, and a balance between proliferation and apoptosis in the trophoblastic cells are essential to the placental development. The trophoblastic cells, that form the fetal portion of placenta, has unique properties and a wide range of metabolic, endocrine and angiogenic functions, but the proliferative profile of those cells. In this study we hypothesed that cells from different placental regions on bovine placenta must reveal distinct patterns of proliferative activity and apoptosis, and some regions may be potentially responsible to distinct modulation patterns in fetal growth and nutrition throughout pregnancy. We analyzed cells form different regions of normal bovine placenta, namely the central region of the placentome, the placentomes edges, interplacentomal areas, placentomal fusion, and microplacentomes (≤1.0cm). The cells of those regions were analyzed by flow cytometry and with a histochemical marker, as well as macroscopical and histological analysis. Using flow cytometry we performed the percentage of cells in each cell cycle phase, including apoptosis. Our findings indicated macroscopical, histological and metabolic particularities in different placental region. The edges of the placentome revealed a premature increase in apoptotic cells, with a significantly higher number of apoptotic cells from 170 days of gestation. That suggests this region to be the point of initiation of placentomal detachment in cattle. Interplacentomal areas and placentomal fusions showed no significant variations during pregnancy, suggesting that proliferation is minor importance for tissue homeostasis in those regions. Microplacentomes revealed a lower but an ascending proliferative activity, that suggests the relatively small role of those structures, with microplacentomes not contributing significantly to normal of placental functions and conceptus development during pregnancy. Taken together, the complete understanding of placental apoptotic and proliferative profiles at distinct placental tissue regions during gestation will shed light to unknown physiological processes related to conceptus development, as some regions may be potentially responsible, at different degrees of influence, to distinct modulation patterns in fetal growth and nutrition throughout pregnancy. In that regard, results from the present study using non-manipulated bovine gestations indicated that proliferation and apoptosis exhibit patterns that are specific for the individual placental areas during gestation and at term in normal, non-manipulated pregnancies in cattle. Variations involving proliferation and apoptotic rates may influence placental maturation and detachment, compromising placental functions and leading to fetal stress, abnormalities in development and abortion, as frequently seen in bovine pregnancies from in vitro fertilization and cloning procedures. Our findings describing the pattern of cell proliferation and apoptosis in normal bovine pregnancies may be useful for unraveling some of the developmental deviations frequently seen in nature and after in vitro embryo manipulations.

Orientador: Aureo Tatsumi Yamada / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T00:51:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Aires_MarluciaBastos_D.pdf: 2189429 bytes, checksum: 72ea45d01e8d2f7c191ae7c71d82c5f8 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A implantação embrionária implica em alterações profundas do ambiente uterino, cujos eventos devem obedecer uma sincronia temporal e espacial com o estágio do desenvolvimento embrionário. Qualquer desequilíbrio nesta sincronia resulta em interrupção da gestação e o desconhecimento dos mecanismos que atuam nas interações materno-fetais inviabilizam as possíveis intervenções buscando controlar as causas que levam às perdas iniciais da gestação. Visando contribuir para a melhor compreensão da biologia da resposta uterina de bovinos, o presente trabalho utilizou úteros de bovinos (Bos spp) não gestantes (NG) e gestantes nos períodos correspondentes à implantação embrionária para a coleta de fragmentos das regiões carunculares (CAR) e intercarunculares (IC). Esses fragmentos foram processadas para embebição em parafina destinadas às análises histológicas e obtenção de RNA total para realização de RT-PCR semi-quantitativo dos morfógenos Bmp2, Wnt2, Wnt5a, Wnt7a, e de seus antagonistas Sostdc1, Noggin, Dkk1 e Sfrp2. Pela análise histológica do desenvolvimento da mucosa uterina da região CAR foram estabelecidos os critérios morfológicos das seqüências de alterações da histoarquitetura endometrial em resposta à implantação embrionária constituindo quatro grupos (P1-P4) definindo os períodos gestacionais correspondentes, quais sejam: P1 (20-26 dg) - adesão das células trofoblásticas na superfície apical das células epiteliais e/ou entremeadas no revestimento epitelial, P2 (28-33 dg) - presença de projeções digitiformes na superfície da região CAR e tecido epitelial uterino constantemente rompido em ambas as regiões CAR e IC, P3 (35-40 dg) - expansão das projeções da região CAR formando uma rede anastomosada, entremeada pelo córion e P4 (50-60dg) - consolidação do placentônio. A ruptura das células epiteliais observada em P2 demonstra a fragilidade da interação epitélio-córion neste período que pode estar diretamente relacionada com a alta freqüência de perdas gestacionais em bovinos particularmente durante a implantação embrionária. A reação imunocitoquímica para anti-PCNA demonstrou uma marcação crescente no epitélio (E) e estrato subepitelial (ES), particularmente nas projeções da CAR de P1 a P4 e em menor proporção no E e estrato compacto (EC) da IC, confirmando a intensa atividade proliferativa associada com a hipertrofia endometrial. As análises da expressão genica através de RT-PCR, demonstraram a presença dos transcritos de Bmp2, Sostdc1, Noggin, Wnt2, Wnt5a, Wnt7a, Sfrp2 e Dkk1, e pela hibridização in situ, confirmaram-se as expressões localizadas dos genes Bmp2, Wnt5a, Wnt7a, Dkk1, Sfrp2, além dos receptores Bmpr1a e Bmpr2 no E+ES da CAR e E+EC da IC no útero NG e gestantes de P1 a P4. A expressào de Bmp2 foi maior na CAR em relação a IC em P1 e P2 o que sugere uma participação importante na ativação da resposta da região CAR relacionada com a implantação embrionária, enquanto o Wnt5a parece não atuar neste período. A redução da expressão de Wnt2 em P1, indica uma regulação negativa na CAR e IC no inicio da implantação, enquanto que a menor expressão de Wnt7a na CAR em relação a IC sugere que este gene não está relacionado com as principais alterações observadas nessa região. A maior expressão de Dkk1 e Sfrp2 na CAR em relação à IC, sugere a participação na atividade celular da região CAR, porém não apresenta relação direta com a expressão dos genes Wnt analisados, assim como a ausência de Sostdc1 no endométrio e a menor expressão de Noggin demonstram não serem estes os antagonistas principais de BMP que atuam no endométrio bovino. A expressão de Wnt e Bmp em conjunto com seus antagonistas simultaneamente nas regiões CAR e IC atesta a dependência da ação múltipla e sinérgica/antagônica de vários fatores na modulação da resposta da mucosa uterina na implantação embrionária e durante o desenvolvimento da placentação sinepitéliocorial. / Abstract: The embryo implantation implies in deep changes of the uterine environment which events must be topologically and chronologically synchronized with embryo development stage. Any imbalance in this synchronization results in disruption of the gestation and the lack of knowledge regarding the mechanisms of maternal-fetal interaction make difficult any potential action intending to control the causes which induce early gestational loss. Aiming to contribute to a better understanding of the biology of bovine uterine response, the present work evaluated the caruncle (CAR) and intercaruncle (IC) regions collected from non-pregnant (NG) and pregnant bovine uteri (Bos spp) and processed for paraffin embedding and submitted to histological analysis, RNA isolation for RT-PCR of Bmp2, Wnt2, Wnt5a and Wnt7a morphogen genes and their antagonists Sostdc1, Noggin, Dkk1 and Sfrp2 gene expression. By histological analysis of CAR uterine mucosa development, the morphological criteria of the endometrial histoarchitecture changes sequences were established and adopted to compose four groups (P1- P4) with corresponding gestational stages: P1 (20-26 gd) - adhesion of throphoblast cells on the apical surface of epithelium cells and/or between them, P2 (28-33 gd) - villous-like projections on the CAR surface and areas of disrupted or absence of epithelial cells on both CAR and IC regions, P3 (35-40 gd) - expansion of villous-like projections resulting in an anastomosis mesh where chorion villi intrude, P4 (50-60 gd) - placentome consolidation. The constant disruption of epithelial cells seen in P2 evidenced the fragility of epithelium-chorion interaction that may be related to the high incidence of bovine pregnancy loss particularly during embryo implantation. The immunocytochemistry for PCNA demonstrated reactivity in epithelium (E) and subepithelium stratum (SS), particularly on CAR villous-like projections from P1-P4 and in a less frequent proportion in the epithelium (E) and compactum stratum (CS) from IC, demonstrating the intense proliferative activity associated with endometrial hypertrophy. The gene expression analysis by RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) confirmed the transcripts for Bmp2, Sostdc1, Noggin, Wnt2, Wnt5a, Wnt7a, Sfrp2 and Dkk1, and by In situ hybridization the localized expression of Bmp2, Wnt5a, Wnt7a, Dkk1, Sfrp2, and also Bmpr1a and Bmpr2 receptors in E+SS and E+CS in NG and P1-P4 uteri. The Bmp2 expression was higher on CAR when compared to IC in P1 and P2 which suggest an important involvement on CAR response activation related to embryo implantation, whereas Wnt5a does not seem to participate at this period. The decreased expression of Wnt2 in P1 point out a negative regulation on CAR and IC in the beginning of implantation, while the lower expression of Wnt7a in CAR when compared to IC suggest that this is not the main gene related to changes of CAR in pregnancy. The highest expression of Dkk1 and Sfrp2 on CAR when compared to IC indicate their participation on the cellular activity on the CAR region, but it is not involved directly with the expression of Wnt genes analyzed, as well as the absence of Sostdc1 on the endometrium and the lowest expression of Noggin demonstrated that they are not the main BMP antagonists acting on bovine endometrium. The expression of Wnt and Bmp together with their antagonists simultaneously on CAR and IC regions attest the multiple and synergic/antagonic action of several factors on the modulation of uterine mucosa response during the embryo implantation and development of synepitheliochorial placentation. / Doutorado / Histologia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural