Further in vivo and in vitro studies using the truncated OsRMR1 proteins from the culture media of transgenic BY-2 cells demonstrated that OsRMR1 functioned as a receptor in transporting vicilin-like storage proteins via specific interaction with their vacuolar sorting determinants. Taken together, the OsRMR1 is a sorting receptor for the PSV pathway that defines a novel organelle as PVC for PSV in rice. / Receptor-mediated protein sorting is one of the mechanisms for transporting soluble proteins to the protein storage vacuoles (PSVs) in plant cells. Members of vacuolar sorting receptor (VSR) family proteins and receptor homology region-transmembrane domain-RING-H2 (RMR) family proteins have been shown to function in mediating the transport of storage proteins to PSVs in plants. However, no prevacuolar compartment (PVC) for the PSV pathway has been identified. In this study, I used a rice RMR protein (OsRMR1) as a probe to study the PSV pathway in rice. Using confocal immunofluorescent and immunogold electron microscopy (EM) with specific OsRMR1 antibodies, I have identified a novel organelle as a PVC for the PSV pathway, because OsRMR1 antibodies labeled the Golgi apparatus, trans-Golgi network (TGN) and the novel organelle in both rice cultured cells and developing rice seeds, as well as the protein body Type II (PBII) in developing rice seeds. This novel organelle is morphologically distinct from the lytic PVC or multivesicular body (MVB). / Shen, Yun. / "May 2008." / Adviser: Liwen Jiang. / Source: Dissertation Abstracts International, Volume: 70-03, Section: B, page: 1428. / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2008. / Includes bibliographical references (p. 124-139). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Electronic reproduction. [Ann Arbor, MI] : ProQuest Information and Learning, [200-] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Abstracts in English and Chinese. / School code: 1307.

by Yubing Li. / "September 2003." / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2003. / Includes bibliographical references (p. 173-190). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Electronic reproduction. Ann Arbor, MI : ProQuest Information and Learning Company, [200-] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Mode of access: World Wide Web. / Abstracts in English and Chinese.

Plants maintain organelle genomes that are descended from ancient microbes. Ages ago, these ancient microbes were engulfed by larger cells, beginning a process of co-evolution we now call the endo-symbiotic theory. Over time, DNA from the engulfed microbe was transferred to the genome of the larger engulfing cell, eventually losing the ability to be free-living, and establishing a permanent residency in the larger cell. Similarly, the larger cell came to rely so much on the microbe it had engulfed, that it too lost its ability to survive without it. Thus, mitochondria and plastids were born. Nearly all multicellular eukaryotes possess mitochondria; however, different evolutionary pressures have created drastically different genomes in plants versus animals. For one, animals have very compact, efficient mitochondrial genomes, with about 97% of the DNA coding for genes. These genomes are very consistent in size across different animal species. Plants, on the other hand, have mitochondrial genomes 10 to more than 100 times as large as animal mitochondrial genomes. Plants also use a variety of mechanisms to replicate and maintain their DNA. Central to these mechanisms are nuclear-encoded, organelle targeted replication proteins. To date, there are two DNA polymerases that have been identified in plant mitochondria and chloroplasts, Pol1A and Pol1B. There is also a DNA helicase-primase that localizes to mitochondria and chloroplasts called Twinkle, which has similarities to the gp4 protein from T7 phage. In this dissertation, we discuss the roles of the polymerases and the effects of mutating the Pol1A and Pol1B genes respectively. We show that organelle genome copy number decreases slightly and over time but with little effect on plant development. We also detail the interactions between Twinkle and Pol1A or Pol1B. Plants possess the same organellar proteins found in animal mitochondria, which are homologs to T7 phage DNA replication proteins. We show that similar to animals and some phage, plants utilize the same proteins in similar interactions to form the basis of a DNA replisome. However, we also show that plants mutated for Twinkle protein show no discernable growth defects, suggesting there are alternative replication mechanisms available to plant mitochondria that are not accessible in animals.

Les plantes doivent assurer la protection de trois génomes localisés dans le noyau, les chloroplastes et les mitochondries. Si les mécanismes assurant la réparation de l’ADN nucléaire sont relativement bien compris, il n’en va pas de même pour celui des chloroplastes et des mitochondries. Or il est important de bien comprendre ces mécanismes puisque des dommages à l’ADN non ou mal réparés peuvent entraîner des réarrangements dans les génomes. Chez les plantes, de tels réarrangements dans l’ADN mitochondrial ou dans l’ADN chloroplastique peuvent conduire à une perte de vigueur ou à un ralentissement de la croissance. Récemment, notre laboratoire a identifié une famille de protéines, les Whirly, dont les membres se localisent au niveau des mitochondries et des chloroplastes. Ces protéines forment des tétramères qui lient l’ADN monocaténaire et qui accomplissent de nombreuses fonctions associées au métabolisme de l’ADN. Chez Arabidopsis, deux de ces protéines ont été associées au maintien de la stabilité du génome du chloroplaste. On ignore cependant si ces protéines sont impliquées dans la réparation de l’ADN. Notre étude chez Arabidopsis démontre que des cassures bicaténaires de l’ADN sont prises en charge dans les mitochondries et les chloroplastes par une voie de réparation dépendant de très courtes séquences répétées (de cinq à cinquante paires de bases) d’ADN. Nous avons également montré que les protéines Whirly modulent cette voie de réparation. Plus précisément, leur rôle serait de promouvoir une réparation fidèle de l’ADN en empêchant la formation de réarrangements dans les génomes de ces organites. Pour comprendre comment les protéines Whirly sont impliquées dans ce processus, nous avons élucidé la structure cristalline d’un complexe Whirly-ADN. Nous avons ainsi pu montrer que les Whirly lient et protègent l’ADN monocaténaire sans spécificité de séquence. La liaison de l’ADN s’effectue entre les feuillets β de sous-unités contiguës du tétramère. Cette configuration maintient l’ADN sous une forme monocaténaire et empêche son appariement avec des acides nucléiques de séquence complémentaire. Ainsi, les protéines Whirly peuvent empêcher la formation de réarrangements et favoriser une réparation fidèle de l’ADN. Nous avons également montré que, lors de la liaison de très longues séquences d’ADN, les protéines Whirly peuvent s’agencer en superstructures d’hexamères de tétramères, formant ainsi des particules sphériques de douze nanomètres de diamètre. En particulier, nous avons pu démontrer l’importance d’un résidu lysine conservé chez les Whirly de plantes dans le maintien de la stabilité de ces superstructures, dans la liaison coopérative de l’ADN, ainsi que dans la réparation de l’ADN chez Arabidopsis. Globalement, notre étude amène de nouvelles connaissances quant aux mécanismes de réparation de l’ADN dans les organites de plantes ainsi que le rôle des protéines Whirly dans ce processus. / Plants must protect the integrity of three genomes located respectively in the nucleus, the chloroplasts and the mitochondria. Although DNA repair mechanisms in the nucleus are the subject of multiple studies, little attention has been paid to DNA repair mechanisms in chloroplasts and mitochondria. This is unfortunate since mutations in the chloroplast or the mitochondrial genome can lead to altered plant growth and development. Our laboratory has identified a new family of proteins, the Whirlies, whose members are located in plant mitochondria and chloroplasts. These proteins form tetramers that bind single-stranded DNA and play various roles associated with DNA metabolism. In Arabidopsis, two Whirly proteins maintain chloroplast genome stability. Whether or not these proteins are involved in DNA repair has so far not been investigated. Our studies in Arabidopsis demonstrate that DNA double-strand breaks are repaired in both mitochondria and chloroplasts through a microhomology-mediated repair pathway and indicate that Whirly proteins affect this pathway. In particular, the role of Whirly proteins would be to promote accurate repair of organelle DNA by preventing the repair of DNA double-strand breaks by the microhomology-dependant pathway. To understand how Whirly proteins mediate this function, we solved the crystal structure of Whirly-DNA complexes. These structures show that Whirly proteins bind single-stranded DNA with low sequence specificity. The DNA is maintained in an extended conformation between the β-sheets of adjacent protomers, thus preventing spurious annealing with a complementary strand. In turn, this prevents formation of DNA rearrangements and favors accurate DNA repair. We also show that upon binding long ssDNA sequences, Whirly proteins assemble into higher order structures, or hexamers of tetramers, thus forming spherical particles of twelve nanometers in diameter. We also demonstrate that a lysine residue conserved among plant Whirly proteins is important for the stability of these higher order structures as well as for cooperative binding to DNA and for DNA repair. Overall, our study elucidates some of the mechanisms of DNA repair in plant organelles as well as the roles of Whirly proteins in this process.

Les plantes doivent assurer la protection de trois génomes localisés dans le noyau, les chloroplastes et les mitochondries. Si les mécanismes assurant la réparation de l’ADN nucléaire sont relativement bien compris, il n’en va pas de même pour celui des chloroplastes et des mitochondries. Or il est important de bien comprendre ces mécanismes puisque des dommages à l’ADN non ou mal réparés peuvent entraîner des réarrangements dans les génomes. Chez les plantes, de tels réarrangements dans l’ADN mitochondrial ou dans l’ADN chloroplastique peuvent conduire à une perte de vigueur ou à un ralentissement de la croissance. Récemment, notre laboratoire a identifié une famille de protéines, les Whirly, dont les membres se localisent au niveau des mitochondries et des chloroplastes. Ces protéines forment des tétramères qui lient l’ADN monocaténaire et qui accomplissent de nombreuses fonctions associées au métabolisme de l’ADN. Chez Arabidopsis, deux de ces protéines ont été associées au maintien de la stabilité du génome du chloroplaste. On ignore cependant si ces protéines sont impliquées dans la réparation de l’ADN. Notre étude chez Arabidopsis démontre que des cassures bicaténaires de l’ADN sont prises en charge dans les mitochondries et les chloroplastes par une voie de réparation dépendant de très courtes séquences répétées (de cinq à cinquante paires de bases) d’ADN. Nous avons également montré que les protéines Whirly modulent cette voie de réparation. Plus précisément, leur rôle serait de promouvoir une réparation fidèle de l’ADN en empêchant la formation de réarrangements dans les génomes de ces organites. Pour comprendre comment les protéines Whirly sont impliquées dans ce processus, nous avons élucidé la structure cristalline d’un complexe Whirly-ADN. Nous avons ainsi pu montrer que les Whirly lient et protègent l’ADN monocaténaire sans spécificité de séquence. La liaison de l’ADN s’effectue entre les feuillets β de sous-unités contiguës du tétramère. Cette configuration maintient l’ADN sous une forme monocaténaire et empêche son appariement avec des acides nucléiques de séquence complémentaire. Ainsi, les protéines Whirly peuvent empêcher la formation de réarrangements et favoriser une réparation fidèle de l’ADN. Nous avons également montré que, lors de la liaison de très longues séquences d’ADN, les protéines Whirly peuvent s’agencer en superstructures d’hexamères de tétramères, formant ainsi des particules sphériques de douze nanomètres de diamètre. En particulier, nous avons pu démontrer l’importance d’un résidu lysine conservé chez les Whirly de plantes dans le maintien de la stabilité de ces superstructures, dans la liaison coopérative de l’ADN, ainsi que dans la réparation de l’ADN chez Arabidopsis. Globalement, notre étude amène de nouvelles connaissances quant aux mécanismes de réparation de l’ADN dans les organites de plantes ainsi que le rôle des protéines Whirly dans ce processus. / Plants must protect the integrity of three genomes located respectively in the nucleus, the chloroplasts and the mitochondria. Although DNA repair mechanisms in the nucleus are the subject of multiple studies, little attention has been paid to DNA repair mechanisms in chloroplasts and mitochondria. This is unfortunate since mutations in the chloroplast or the mitochondrial genome can lead to altered plant growth and development. Our laboratory has identified a new family of proteins, the Whirlies, whose members are located in plant mitochondria and chloroplasts. These proteins form tetramers that bind single-stranded DNA and play various roles associated with DNA metabolism. In Arabidopsis, two Whirly proteins maintain chloroplast genome stability. Whether or not these proteins are involved in DNA repair has so far not been investigated. Our studies in Arabidopsis demonstrate that DNA double-strand breaks are repaired in both mitochondria and chloroplasts through a microhomology-mediated repair pathway and indicate that Whirly proteins affect this pathway. In particular, the role of Whirly proteins would be to promote accurate repair of organelle DNA by preventing the repair of DNA double-strand breaks by the microhomology-dependant pathway. To understand how Whirly proteins mediate this function, we solved the crystal structure of Whirly-DNA complexes. These structures show that Whirly proteins bind single-stranded DNA with low sequence specificity. The DNA is maintained in an extended conformation between the β-sheets of adjacent protomers, thus preventing spurious annealing with a complementary strand. In turn, this prevents formation of DNA rearrangements and favors accurate DNA repair. We also show that upon binding long ssDNA sequences, Whirly proteins assemble into higher order structures, or hexamers of tetramers, thus forming spherical particles of twelve nanometers in diameter. We also demonstrate that a lysine residue conserved among plant Whirly proteins is important for the stability of these higher order structures as well as for cooperative binding to DNA and for DNA repair. Overall, our study elucidates some of the mechanisms of DNA repair in plant organelles as well as the roles of Whirly proteins in this process.