Texte remanié de: Th. doct.--Bergen--University of Bergen, 1998. / Bibliogr. p. 36-50.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2007. / Titre de l'écran-titre (visionné le 5 mai 2008). Bibliogr.

Th. 3e cycle--Biochim.--Lille 1, 1979. N°: 777.

Thèse de doctorat : Sciences du vivant : Strasbourg 1 : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. p. 179-199.

La dystrophie musculaire de Duchenne est une maladie génétique liée au chromosome X qui atteint un garçon sur 3 500. Cette maladie est caractérisée par l'absence de dystrophine à la surface des fibres musculaires. Sans cette protéine, les fibres se brisent plus fréquemment et une faiblesse musculaire progressive apparait. Les patients décèdent généralement au début de la vingtaine. Il n'y a présentement aucun traitement pour cette pathologie. La greffe de cellules myogéniques est une thérapie possible, mais se heurte à un rejet par le système immunitaire du patient. Pour contourner ce problème, il est possible de développer une thérapie génique ex vivo, basée sur la greffe de cellules autologues modifiées génétiquement. Malheureusement, aucune technique efficace de modification génétique des cellules n'était disponible il y a quatre ans. Nous avons testé deux nouvelles techniques de modification génétique. Une première est non virale et la seconde utilise les lentivirus. La première consiste à transfecter un plasmide d'expression de la dystrophine par Nucléofection. Pour intégrer les séquences, un second plasmide, codant pour l'intégrase PhiC31, est aussi introduit dans les cellules. Cette technique nous a permis de stabiliser des plasmides allant de 7 kb à 21 kb, ce qui en fait les plus grosses séquences jamais stabilisées dans des cellules de culture primaire humaine. Cette expression a pu être détectée dans les fibres musculaires après une greffe. Nous avons aussi utilisé des lentivirus pour effectuer une modification génétique des cellules. Ce vecteur viral est très efficace pour introduire des cassettes d'expression pour des versions tronquées de la dystrophine. L'expression de cette dystrophine est détectable in vitro, mais aussi in vivo après la transplantation. De plus, une cassette servant à faire le saut d'exon thérapeutique a aussi été introduite dans des cellules myogéniques et a permis de faire exprimer une dystrophine presque complète par des cellules issues de patients DMD. Cette expression a aussi été détectée dans des modèles murins. Ces travaux constituent une preuve de principe de la faisabilité d'une thérapie génique ex vivo pour la DMD. Plusieurs améliorations restent à apporter, mais il semble que ces travaux laissent croire qu'un essai clinique sera réalisable. / Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe X-linked muscle genetic illness that afflicts one boy per 3 500. Cell therapy is a possible cure for this illness that usually kills patients around age 25. Transplantation of the heterologus myogenic cells is, however, restricted by the immune rejection by the patient. Ex vivo gene therapy offers an evasion to this problem. Introduction of the therapeutic gene into the patient’s own myogenic precursor cells, followed by transplantation is the base of this therapeutic. Four years ago, no efficient procedure to stably modify myogenic cells was available. New gene introduction techniques were thus tested in the present thesis. The first one is a non-viral method. We used a new transfection technology (Nucleofection) to introduce plasmid DNA coding for dystrophin with success. To stabilize the expression, human myogenic cells were co-nucleofected with a PhiC31 expressing plasmid. This integrase was capable of stabilising expression plasmids ranging from 7 kb to 21 kb. This very large sequence was the largest plasmid ever stabilised into human primary cultured cells. The presence of full-length dystrophin protein was detected in vitro and confirmed in vivo, after the transplantation of the myogenic precursor. Another technique was used: the lentiviral vectors. These viral vectors were designed to deliver an expression cassette for a truncated version of the dystrophin gene. The viral vector was efficient at modifying the cells. The expression was shown in vitro and in vivo after the transplantation of the modified cells. The lentiviral vectors were also essayed to deliver a U7 exon skipping cassette into DMD cells. It was then possible to demonstrate that this introduction led to the expression of a quasi normal dystrophin protein in vitro. The expression was also shown in vivo after the transplantation into SCID mice model. A non-viral approach combining nucleofection and the PhiC31 integrase may eventually permit safe auto-transplantation of genetically modified cells. The utilisation of lentiviral vectors also provided evidences that an ex vivo gene therapy is possible for DMD. We believe these results are paving the way to an eventual clinical trial for ex vivo gene therapy.

Les plasmides confèrent aux bactéries qui les possèdent diverses fonctions pouvant accroître leurs chances de survie dans des environnements défavorables. C’est le cas d’Aeromonas salmonicida ssp. salmonicida, bactérie à l’origine de la furonculose chez les salmonidés. Elle possède trois petits plasmides (pAsa1, pAsa2 et pAsa3) qui sont cryptiques c’est-à-dire sans fonction connue. Pour compléter son plasmidome standard, s’ajoutent aux précédents, deux autres plasmides fréquemment retrouvés, pAsal1 et pAsa5, porteurs de gènes codant pour le système de sécrétion de type III, important facteur de virulence pour ce microorganisme. Enfin, ce ne sont pas moins de 17 plasmides porteurs de gènes de résistance aux antibiotiques et quatre supportant des facteurs de virulence qui ont été mis en évidence au cours des 30 dernières années pour cette bactérie. La propagation des gènes de résistance aux antibiotiques pose un problème dans le contexte vétérinaire puisqu’elle constitue, pour le moment, un obstacle au traitement efficace et durable contre la bactérie et conséquemment contre la furonculose. L’étude des petits plasmides d’A. salmonicida ssp. salmonicida s’inscrit dans cette démarche d’une meilleure connaissance de leur plasticité et de leur diversité. Ce projet a donc permis de mettre en évidence la présence de trois nouveaux petits plasmides : pAsa10, pAsaXI et pAsaXII. pAsa10 est la preuve supplémentaire que la propagation des gènes de résistance aux antibiotiques se poursuit, notamment par l’entremise du transposon Tn1721. L’analyse des séquences de pAsaXI et pAsaXII a permis de mettre en évidence des plasmides porteurs de nouvelles fonctionnalités pour A. salmonicida ssp. salmonicida, et des dérivés respectifs des plasmides cryptiques pAsa3 et pAsa2, très présents dans la bactérie, mais sans utilité apparente. Enfin, la haute capacité de transfert de ce microorganisme est encore démontrée, car ces plasmides sont identiques à d’autres retrouvés dans Shewanella baltica et Aeromonas bivalvium, respectivement. / Plasmids confer to the bacteria that possess them various functions that increase their chances of survival in adverse environments. This is the case with Aeromonas salmonicida ssp. salmonicida, a bacterium which causes furunculosis in salmonids. It has three small plasmids (pAsa1, pAsa2 and pAsa3) that are cryptic that is to say without a known function. To supplement its standard plasmidome, two other frequently found plasmids, pAsal1 and pAsa5, which are carriers of genes coding for the type III secretion system, an important virulence factor of this microorganism. Finally, there are no less than 17 plasmids with genes coding for antibiotic resistance and 4 bearing virulence factors that have been demonstrated over the last 30 years for this bacterium. The spread of antibiotic resistance poses a problem in the veterinary context, since it is currently an obstacle to effective and sustainable treatment against the bacterium and consequently to furunculosis. The study of the small plasmids of A. salmonicida ssp. salmonicida is part of this process of a better knowledge of their plasticity and diversity. This project highlighted the presence of three new small plasmids: pAsa10, pAsaXI and pAsaXII. pAsa10 is a new evidence that propagation of antibiotic resistance genes continues, notably through the transposon Tn1721. The analysis of pAsaXI and pAsaXII sequences allowed to identify plasmids carrying new functionalities for A. salmonicida ssp. salmonicida, and derivatives of cryptic plasmids pAsa3 and pAsa2, respectively, very present in the bacterium but without apparent utility. Finally, the high transfer capacity of this microorganism is further demonstrated because these plasmids are identical to others found in Shewanella baltica and Aeromonas bivalvium, respectively.

Thèse doctorat : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie : Strasbourg 1 : 2006. / Thèse soutenue sur un ensemble de travaux. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 22 p.

Les génomes bactériens sont le siège de deux phénomènes de transferts de l'information génétique: les transferts verticaux et horizontaux. Leur coéxistence ce qui implique une délicate balance entre maintenance et instabilité des génomes. L'information génétique des bactéries est généralement portée par des réplicons circulaires : chromosomes et plasmides. Un des sérieux désavantages des réplicons circulaires est leur grande sensibilité aux réarrangements causés par recombinaison homologue. Un nombre impair de crossing-over pendant ou après la réplication de ces réplicons entraine la formation de molécules dimériques. Ces dimères correspondent à une fusion covalente des deux copies du réplicon, non-résolus les dimères ne ségrégeront pas correctement au moment de la division cellulaire. La résolution des formes multimériques des plasmides et chromosomes circulaires est médiée par un mécanisme de recombinaison spécifique de site efficace et extrêmement contrôlé : le système Xer. Les mécanismes de résolution des dimères de chromosome et de plasmide sont différents. De plus, bien que le système de résolution de dimères de chromosome soit contrôlé dans le temps et dans l'espace, chez de nombreuses bactéries il est détourné de son rôle principal par des éléments génétiques mobiles appelés IMEXs (Integrative Mobile Elements exploiting Xer). Le système Xer est alors impliqué dans les transferts verticaux et horizontaux de gènes, illustrant comment une même machine moléculaire peut intervenir dans plusieurs processus biologiques. Pour cela, des acteurs externes différents vont jouer un rôle clé dans le contrôle d'une machine Xer centrale et ainsi apporter une diversité de mécanismes, chacun dédié à une processus biologique propre. Afin de mieux comprendre les contrôles différentiels du système Xer, je me suis intéressé aux éléments génétiques mobiles. Via l'étude de la stabilité intra-chromosomique des IMEXs et de la résolution des dimères de certains grands plasmides, j'ai pu montrer que FtsK, la protéine activatrice de la résolution des dimères de chromosome, est impliquée dans la stabilisation des éléments acquis par transferts horizontaux de gènes. / The genetic information of bacteria is generally carried by circular replicons: chromosomes and plasmids. One of the serious disadvantages of circular replicons is their high sensitivity to rearrangements caused by homologous recombination. An odd number of crossing-over, during or after the replication of these replicons, results in the formation of dimeric molecules. These dimers correspond to a covalent fusion between the two copies of the replicon. If they are not resolved, the dimers will not segregate properly at the time of cell division. The resolution of multimeric forms of circular plasmids and chromosomes is mediated by an efficient and highly controlled site-specific recombination mechanism: the Xer system. The mechanisms of resolution of the chromosome and plasmid dimers are different. In addition, even if the chromosome dimer resolution system is controlled in time and space, in many bacteria it is hijacked by mobile genetic elements called IMEXs (Integrative Mobile Elements Exploiting Xer). The Xer system is then involved in the vertical and horizontal transfer of genes, illustrating how the same molecular machine can intervene in several biological processes. For this, different external actors will play a key role in controlling a central Xer machine and thus bring a variety of mechanisms, each dedicated to a specific biological process. In order to better understand the differential controls of the Xer system, I focused on mobile genetic elements. By studying the intra-chromosomal stability of IMEXs and the resolution of large plasmids dimers, I was able to show that FtsK is involved in the stabilization of the acquired mobile genetic elements.

Titre de l'écran-titre (visionné le 4 décembre 2024) / De par son implication dans plusieurs maladies neurologiques ainsi que dans les mécanismes sous jacents de la mémoire et de l'apprentissage, il est capital d'étudier la plasticité synaptique. Ce projet a cherché à développer des outils et protocoles permettant d'étudier les synapses et leur développement en utilisant le modèle du poisson-zèbre larvaire. À cet égard, j'ai exploité des techniques de biologie moléculaire pour concevoir et créer des plasmides codant pour l'expression de biomarqueurs synaptiques fluorescents. FingR-PSD95 (Fibronectin intrabody generated with mRNA display) est une protéine génétiquement encodée agissant à la manière d'un anticorps capable de cibler la protéine post-synaptique PSD95 localisée au niveau de l'espace post-synaptique des synapses excitatrices. Lorsqu'associé à une protéine fluorescente, FingR-PSD95 rend donc l'observation de synapses excitatrices en microscopie possible. Pour permettre au poisson-zèbre d'exprimer ces biomarqueurs, j'ai injecté des plasmides encodant FingR-PSD9 couplé à une protéine fluorescente verte (GFP) dans des œufs fécondés de poisson-zèbre au stade unicellulaire. Pour observer les prolongements neuronaux, j'ai utilisé un marquage membranaire rouge couplé au système FingR-PSD95. L'intégration de l'ADN plasmidique au génome du poisson-zèbre se fait par le système de transposase Tol2. Par la suite, j'ai employé des techniques de microscopie à fluorescence pour réaliser de l'imagerie synaptique sur des larves de poisson-zèbre vivantes. La caractérisation de ce marquage synaptique et de son efficacité chez le poisson-zèbre a alors permis de déterminer les stratégies d'optimisation nécessaires pour éventuellement développer une nouvelle lignée transgénique. Dans le cadre d'expériences de suivi de développement synaptique chez le poisson-zèbre, il est souhaitable de pouvoir imager des larves à des stades avancés de développement alors que leur répertoire comportemental se complexifie et leur organisation synaptique se développe considérablement. Il est nécessaire de développer des protocoles d'imagerie adaptés aux changements physiologiques dus à la maturation des larves. Ainsi, il sera possible d'étudier l'organisation synaptique du poisson-zèbre au travers d'expériences comportementales, d'apprentissage, et de manipulations de l'exposome (microbiote, toxines, stress, environnement social) à différents stades de développement.

Aeromonas salmonicida sous-espèce salmonicida, agent étiologique de la furonculose, impacte négativement les piscicultures chaque année au Québec. Dans les dernières années, une hausse de résistance aux antibiotiques chez cette bactérie a été remarquée. De la résistance contre la tétracycline chez les poissons est fréquemment observée, bien que cet antibiotique ne soit que peu utilisé par l'industrie aquacole. C'est toutefois le cas de l'industrie porcine, où la tétracycline est abondamment utilisée. En s'intéressant à l'environnement autour des piscicultures, ce présent projet établit l'hypothèse qu'il est envisageable d'observer des liens reliant la furonculose, les gènes de résistance aux antibiotiques chez A. salmonicida sous-espèce salmonicida et la contribution potentielle de l'environnement. À l'aide de méthodes de séquençage génomique et de bio- informatique, de nouveaux plasmides ont été caractérisés. Les plasmides, pAsa-2358, pAsa-2900 et pAsa- 2900b, font maintenant partie du répertoire de plasmides de résistance retrouvés au Québec chez la sous- espèce salmonicida. Des échantillons provenant de piscicultures et de leur environnement limitrophe ont été récoltés et testés par biologie moléculaire dans le but de détecter les plasmides connus au Québec pour cette bactérie incluant les trois nouveaux plasmides. Un portrait global des plasmides retrouvés a été dressé, confirmant la présence potentielle de la bactérie sans éclosion active de furonculose. Effectivement, plusieurs plasmides problématiques de la sous-espèce, soit pSN254b et ceux de la famille des pRAS3 ont été détectés. Plus particulièrement, pSN254b confère une résistance à plusieurs antibiotiques, donnant une résistance à tous les antibiotiques autorisés au Canada pour traiter la furonculose. Sachant qu'ils sont détectés autant dans les sédiments que dans l'eau, il est possible d'envisager qu'à ces moments, une grande concentration de cet ADN était disponible dans l'environnement. Cette étude permet un premier pas vers l'analyse environnementale des milieux piscicoles au Québec. / Aeromonas salmonicida subspecies salmonicida, etiological agent of furunculosis, negatively impacts the fish farming industry every year in the province of Quebec. In the last years, a dramatic increase in the presence of antibiotic resistance genes within the bacterial strains of interest was observed. Tetracycline resistance in fish farms in Quebec is frequently observed, even though this antibiotic is rarely used against furunculosis in the industry. Moreover, it is quite overused in the swine industry. Looking more closely at the surrounding environments of fish farms, the present study establishes the hypothesis that it is possible to potentially establish links in between furunculosis, resistance genes in A. salmonicida subspecies salmonicida and the potential contribution of the environment. Working with genomic sequencing and bioinformatics, new plasmids were characterized. Plasmids pAsa-2358, pAsa-2900 and pAsa-2900b are now part of the list of known resistance- bearing plasmids in the province of Quebec for the subspecies salmonicida. Environmental samples were also collected and tested by molecular biology in the goal of detecting known plasmids found in Quebec in this bacterium, including the three new plasmids mentioned. A global portrait of plasmids found in them is discussed, confirming the potential presence of Aeromonas salmonicida subspecies salmonicida in the fishponds without active outbreaks of furunculosis. Problematic plasmids from the subspecies, pSN254b and those from the pRAS3 family were detected. More specifically, pSN254b confers resistance to multiple antibiotics, providing resistance to all antibiotics authorized for treatment in Canada. Knowing that these plasmids were detected both in sediment and water samples, it is possible to think that this DNA was available at a high concentration in the environment at this time. This study allows the debuts of the analysis of the environment of fish farms in Quebec.