L'îlot génomique Salmonella Genomic Island 1 (SGI1) est un élément intégratif et mobilisable, support de nombreux gènes de résistance aux antibiotiques, et identifié chez de nombreux genres bactériens. Le transfert de SGI1 requiert spécifiquement la présence d'un plasmide conjugatif du groupe d'incompatibilité IncA/C. Les régulateurs globaux AcaCD des plasmides IncA/C activent l’excision de SGI1 qui, une fois sous forme d’un intermédiaire extrachromosomique circulaire, va pouvoir être transféré en utilisant la machinerie de conjugaison encodée par les plasmides IncA/C (mobilisation conjugative en trans). Depuis la description de SGI1, plusieurs études ont relaté une apparente stabilité de SGI1 au cours des générations bactériennes. Cependant, des observations préliminaires indiquaient des difficultés de cohabitation entre SGI1 et les plasmides IncA/C. L’objectif de ce travail était d’étudier la stabilité de SGI1 et sa compatibilité avec les plasmides conjugatifs IncA/C dont dépend sa mobilité. L’opéron putatif S026- S025 de SGI1 a été identifié comme constituant un système Toxine-Antitoxine (TA) qui a été appelé sgiAT. Le rôle de ce système TA dans la stabilité de SGI1 a été mis en évidence en présence d'un plasmide IncA/C. De plus, l’incompatibilité entre SGI1 et les plasmides IncA/C a été démontrée expérimentalement pour la première fois. La stabilité de SGI1 est liée à son intégration chromosomique. Cependant, lorsque SGI1 est excisé du chromosome et donc vulnérable (il peut être perdu), c’est-à-dire en présence d’un plasmide IncA/C, le système TA sgiAT joue un rôle important dans le maintien de SGI1 dans les populations bactériennes. / The multidrug resistance Salmonella Genomic Island 1 (SGI1) is an integrative mobilizable element identified in several enterobacterial pathogens. This chromosomal island requires specifically the presence of a conjugative IncA/C plasmid to be excised and transfered by conjugation (mobilization in trans). Preliminary observations suggest stable maintenance of SGI1 in the bacterial host but paradoxically also incompatibility between SGI1 and IncA/C plasmids. Here, using a Salmonella enterica serovar Agona clonal bacterial population as model, we demonstrate that a Toxin-Antitoxin (TA) system encoded by SGI1 plays a critical role in its stable host maintenance when an IncA/C plasmid is concomitantly present. This system, designated sgiAT for Salmonella genomic island 1 Antitoxin and Toxin respectively, thus seems to play a stabilizing role in a situation where SGI1 is susceptible to be lost through plasmid IncA/C-mediated excision. Moreover and for the first time, the incompatibility between SGI1 and IncA/C plasmids was experimentally confirmed.

Le défi proposé était d'obtenir une mesure en direct du voltage présent sur une membrane bactérienne. D'abord, nous avons construit et inséré dans nos cellules E. coli un plasmide contenant le canal ionique dépendant du voltage NaChBac (Bacillus halodurans). ha, mesure d'une discontinuité dans le courant (au voltage bien documenté correspondant à l'ouverture du canal) devait permettre de calibrer la tension appliquée. Malheureusement, la présence de courants de fuite a masqué ce signal. Parallèlement, nous avons marqué la membrane avec l'ANNINE-6plus, une sonde fluorescente potentiométrique soluble dans l'eau à large décalage Stark. La fluorescence mesurée variait de ~1,5 % pour un changement de 150 mV sur la membrane. À notre connaissance, il s'agit des premières mesures optiques en temps réel du voltage sur une membrane bactérienne, bien qu'il faille en améliorer le signal et la robustesse.

Le virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo (vFHCC), l'agent étiologique causant la fièvre hémorragique de Crimée-Congo (FHCC), est répandu à travers l'Afrique, l'Europe et l'Asie. La FHCC présente un taux de mortalité pouvant atteindre jusqu'à 30% et est considérée comme une infection virale émergente ou ré-émergente de haut niveau de surveillance internationale. Chez l'humain, le virus se transmet par des piqûres de tiques du genre Hyalomma sp infectées ainsi que par contact avec des fluides corporels d'animaux et humains infectés. À l'heure actuelle, il n'existe aucun vaccin approuvé par les principaux organismes de réglementation contre le vFHCC ni son vecteur, la tique. À cet effet, des vaccins à base d'ADN pourraient être utilisés afin d'induire les réponses immunitaires cellulaire et humorale, une technologie qui permettrait la fabrication et le déploiement flexible de vaccins en situation de pandémie. Dans la présente étude, la conception et le développement de nouveaux plasmides d'ADN, appelés plasmides pour l'administration intradermique de vaccins (pIDV, de l'anglais plasmids for intradermal delivery of vaccines) ont été optimisés pour l'expression dans les cellules eucaryotes en incorporant des éléments génétiques réutilisés d'autres plasmides bien caractérisés. Le clonage de l'élément PRE Woodchuck dans un plasmide pIDV-II a amélioré l'expression d'un transgène de protéine fluorescente verte (GFP), comparativement aux plasmides « parents » pVax et pCAGGS, d'où sa sélection pour les tests d'immunisation ultérieurs. Il a été démontré que le plasmide pIDV-II convient à la vaccination animale et qu'il augmente l'antigénicité chez la souris contre des glycoprotéines-cibles du virus Ebola, du VIH et du vFHCC, en comparaison avec le plasmide d'ADN pVax1, une technologie plus standard. Plus précisément, deux gènes précurseurs de glycoprotéines (GPC) des souches Turkey04 et Turkey-Keltit06 du vFHCC, dont la sélection des codons a été optimisée, ont été clonés pour former les plasmides pIDV-II-GPC-Tky-04 et pIDV-II-GPC-Kelkit06. Seule la construction comprenant la séquence GPC Turkey04 a été retenue pour les tests d'immunogénicité en raison de sa capacité à générer des simili-virus ou VLP, de l'anglais virus-like particles, dans un système de minigénome rapporteur. Ce plasmide a permis d'augmenter la réponse immunitaire cellulaire, mesurée par la liaison des IgG sériques aux VLP de vFHCC et la production d'interféron-gamma dans les splénocytes murins stimulés par peptides analogues. La réponse immunitaire chez des moutons injectés avec le plasmide pIDV-II-GPC-Tky04 par voie intradermique avec un appareil à tatouer IONAID (Intradermal Oscillatory Needle-Acquired Device), développé à l'interne, s'est montrée supérieure à la réponse immunitaire induite par électroporation. Cette étude a aussi examiné le potentiel immunogène des différents antigènes de tiques lorsqu'insérés dans pIDV-II. L'ADN codant pour l'antigène HA86 de la glycoprotéine a été sélectionné, car le gène est très similaire au seul vaccin anti-tiques de type Bm86 à avoir été commercialisé. L'antigène de tique 64P et le peptide pP0 ont été sélectionnés pour leur potentiel d'application comme éléments vaccinaux contre d'autres espèces de tiques. Le peptide pP0 a été employé pour fusionner les gènes HA86 et 64P. Des recherches antérieures suggèrent que le peptide immunostimulant 5mer4 encodé dans un fragment d'ADN puisse agir comme un adjuvant simple et efficace pour améliorer la réponse immunitaire chez des souris vaccinées. Ainsi, ce peptide a été retenu pour créer des antigènes de tiques ayant des propriétés adjuvantes encodés dans l'ADN plasmidique. Afin d'évaluer les IgG totaux chez la souris, un plasmide pIDV-II-10HIS a été généré afin d'exprimer et de purifier in vitro des antigènes recombinants de tiques. Néanmoins, seulement les constructions d'ADN basées sur le gène HA86 ont pu induire une réponse humorale chez la souris. Ce travail de thèse a également révélé que la séquence d'ADN du peptide 5mer4 fusionnée aux antigènes de tiques, encodés dans l'ADN, augmentait la liaison des IgG totaux aux antigènes HA86 chez des souris vaccinées. Dans l'ensemble, l'étude présentée ici décrit le développement d'un vaccin à ADN contre le vFHCC, qui pourrait être utilisé à l'avenir en conjonction avec un vaccin à ADN anti-tiques pour stimuler la reconnaissance immunitaire d'antigènes basés sur HA86 ciblant les tiques du genre Hyalomma sp dans un but de prévenir la transmission du vFHCC chez l'humain et les animaux. Cette stratégie s'avère très prometteuse pour la protection contre d'autres vecteurs et pathogènes causant la maladie de Lyme, la Dengue et le Zika. / Crimean-Congo hemorrhagic fever virus (CCHFV), the etiologic agent of Crimean-Congo hemorrhagic fever (CCHF), has a wide presence in Africa, Europe, and Asia. CCHF is associated with a mortality rate of up to 30% and is considered an emergent or re-emergent virus of global concern due to its continuing spread. In humans, the virus is transmitted by infected Hyalomma sp ticks as well as from contact with body fluids from infected animals through transient viremia and nosocomial transmission. Currently, there are no clinical or veterinary vaccines approved by major regulatory agencies against CCHFV or the tick vector. DNA-based vaccine technology can be used to induce cellular and humoral immune responses and allows for manufacturing and flexible deployment of vaccines in pandemic scenarios. In this study, the design and development of novel DNA plasmids for intradermal delivery of vaccines (pIDVs) were first generated and optimized for eukaryotic expression using repurposed genetic elements from well-characterized plasmids. The cloning of a known Woodchuck post-translational regulatory element (PRE) in a pIDV-II plasmid improved transgene expression of a cloned green fluorescent protein similarly compared to a cloned version of the parent plasmids pVax and pCAGGS, and was chosen for subsequent immunization assays. The pIDV-II plasmid was demonstrated to be suitable for animal immunization and improved antigenicity in mice against glycoproteins from EBOV, HIV, and CCHFV targets, which differed in their molecular complexity, compared to the standard pVax1 DNA plasmid technology. Specifically, two codon-optimized glycoprotein precursor (GPC) CCHFV genes from Turkey04 and Turkey-Keltit06 strains, two clinically related isolates, were cloned to create pIDV-II-GPC-Tky-04 and pIDV-II-GPC-Kelkit06 plasmids. Only the construct bearing the GPC sequence Turkey04 was selected for immunogenicity assays due to its capacity to generate CCHF virus-like particles (CCHFV-VLPs) in a Biosafety Level 2 surrogate minigenome reporter system. This plasmid improved the humoral and adaptive cell-mediated immune responses as assessed by serum IgG binding to CCHFV-VLPs and production of interferon-gamma by peptide-stimulated mice splenocytes, respectively. The immune response to pIDV-II-GPC-Tky04 in sheep delivered by intradermal oscillatory needle-acquired injection device (IONAID) tattooing technology made in-house was more robust than the immune response to an electroporation-assisted procedure. This study also examined concealed and exposed tick antigens that were tested as pIDV-II vaccines to potentially control tick infestation in animals. The "concealed" DNA-encoded HA86 antigen truncated glycoprotein was selected since the gene is closely related to the only commercially successful Bm86-like anti-tick vaccine; furthermore, its recombinant form has shown efficacy in decreasing the survival of Hyalomma ticks in vaccinated calves. The exposed 64P tick antigen and pP0 peptide were also selected for this study based on previous research suggesting broader applicability of these factors to tick species other than the original isolate. The pP0 peptide was used to fuse the HA86 and 64P genes. Previous research suggests that the use of the DNA-encoded immune peptide 5mer4 as an effective adjuvant with a simple composition enhances the immune response of vaccinated mice; thus, this peptide was used to create adjuvant DNA-encoded tick immunogens. For proper evaluation of total IgG responses in mice, a pIDV-II-10HIS plasmid was created to transiently express and purify in-vitro recombinant tick antigens. Generally, in this study, after a single immunization, only HA86-based DNA constructs were able induce humoral responses in mice. This thesis work also determined that using the peptide 5mer4 fused to DNA-encoded tick antigens efficiently enhanced total IgG binding to HA86 antigens in groups of vaccinated mice. Overall, the study presented here describes the development of CCHFV DNA-based vaccine, which can be combined with a DNA-based anti-tick vaccine and recombinant proteins for immune detection of HA86-based antigens targeting ticks of the genus Hyalomma sp. to prevent CCHFV spread in animals and humans in the future. This strategy offers great promise for protecting against other pathogens and their vectors, such as Borrelia sp, ticks, and mosquitoes that cause diseases including Lyme disease, Zika, and Dengue.

Oenococcus oeni joue un rôle essentiel dans l’élaboration du vin. Adaptée aux environnements acides et riches en alcool, elle est la bactérie lactique naturellement sélectionnée pour mener la fermentation malolactique (FML). Elle est ainsi la principale espèce recherchée et utilisée industriellement comme levain malolactique. Toutefois, il existe une grande diversité phénotypique au sein des souches d’O. oeni et notamment une variabilité des propriétés technologiques que sont la résistance à la lyophilisation, la résistance à l’inoculation dans le vin et la capacité à réaliser rapidement la FML. De nombreux gènes impliqués dans l’adaptation au vin ont déjà été identifiés mais, ne se sont pas toujours révélés efficaces pour la sélection de souches œnologiques. Dans ce contexte, cette étude a consisté à identifier des gènes spécifiques des souches d’intérêt technologique à travers l’analyse des plasmides et génomes. Face aux difficultés rencontrées pour purifier les grands plasmides, seul le plasmide pOENI-1 a été étudié. Ce travail a révélé différentes formes plasmidiques regroupées en une famille nommée « pOENI-1 ». Plusieurs gènes accessoires ont été identifiés et deux d’entre eux ont été détectés chez les souches associées aux fermentations malolactiques spontanées. La comparaison des génomes de souches aux propriétés technologiques diverses a également révélé des séquences génétiques qui leur sont spécifiques. L’ensemble de ces travaux a permis d’identifier plusieurs gènes dont la distribution statistique parmi les souches d’O. oeni a été analysée par la construction de courbes ROC. Ces courbes permettent d’évaluer la qualité des gènes en tant que marqueurs génétiques des souches d’intérêt technologique. Il est donc maintenant possible d’orienter la sélection des nouveaux levains malolactiques par l’utilisation des données génétiques et des outils statistiques décrits dans cette étude. / Oenococcus oeni plays an essential role in the production of wine. Adapted to acidic and alcohol rich environments, it is the lactic acid bacterium species that is naturally selected to conduct malolactic fermentation (MLF). It is also the main species that is selected and used industrially as malolactic starter. However, there is a huge phenotypic diversity among strains of O. oeni, which includes a variability of technological properties such as resistance to freeze-drying, resistance to inoculation into the wine and the ability to quickly achieve the MLF. Many genes involved in adaptation to wine have been identified but have not always proven effective in selecting wine strains. In this context, this study aimed to identify genes that are specific strains of technological interest through the analysis of genomes and plasmids. Due to difficulties encountered to purify large plasmids, only the plasmid pOENI-1 was studied. This work has revealed several different but related plasmids that were grouped into a family named "pOENI-1". Several accessory genes have been identified and two of them were detected in O. oeni strains associated with spontaneous MLF. Comparing the genomes of strains showing various technological properties also revealed genetic sequences that are specific of those strains. Altogether, these works have revealed several genes whose statistical distribution among O. oeni strains was analyzed by constructing ROC curves. These curves are used to assess the quality of genes as genetic markers of strains of technological interest. It is now possible to guide the selection of new malolactic starters by the use of genetic data and statistical tools described in this study.

Bacillus cereus (Bc) et Bacillus thuringiensis (Bt) sont deux espèces génétiquement proches. Bc est une bactérie pathogène que peuvent causer des gastro-entérites d’origine aliméntaire. Bt est une bactérie entomopathogène, dont le cycle de vie dans la larve d’insecte est contrôlé par des systèmes de quorum sensing, comme le système Rap/Phr, que régule processus tels que la sporulation, la formation de biofilm et la conjugaison. La présence des ces genès a été identifiée dans les plasmides, et ces eleménts ont été associés à l’adaptation des spécies dans sont niche ecologique. Le but de cette étude est de comprendre le rôle des plasmides dans ces bactéries. Pour la première étude l’insecte larvae, le niche privilegie de Bt, ont été infectées par souches de Bc et Bt, avec un contenu plasmidique diffèrent. Le fitness a été evallué par le comptage de cellules végétatives et spores dans quatre temps. Les souches de Bt et Bc ont été classées dans cinq groups par rapport à sont fitness. Dans ces groups le plasmide a affecté le fitness de la bactérie positive ou négativement. Les résultats ont démontré que les souches du group du B. cereus que reçoivent a pathogène plasmid ne est pas suffisant pour une augmentation effectif de la population bactérienne, i.e., coloniser l’hôte. La deuxième étude a permis caractériser le système rap/phr porté par le plasmide cryptique pHT8_1. Les résultats démontrent que la protéine Rap8 inhibe la sporulation dans la l’insecte. L’activité de cette protéine est inhibée par le peptide de signalisation Phr8. Le système Rap/Phr8_1 a permis les bactéries exercer un strict contrôle sur la sporulation, un processus important pour assurer la survie et la dissémination des bactéries. L’ensemble des résultats de la deuxième étude montrent que les plasmides peuvent fournir avantages pour l’adaptation et evolution de B. thuringiensis dans son niche ecologique, alors que les résultats de la première étude indiqués que les souches de Bc group doivent avoir un contenu génétique approprié pour exhiber un fitness élévé en permettant une optimal multiplication and dissemination de populations bactérienne dans l’insect larvae. / Bacillus cereus (Bc) and Bacillus thuringiensis (Bt) are two closely related species. Bc is a pathogenic species responsible for gastroenteritis by food-borne. Bt is an entomopathogenic bacterium, which the lifecycle in insect larvae is controlled by quorum sensing systems, such as Rap/Phr, which regulates processes such as sporulation, biofilm formation and conjugation. The presence of these genes in plasmids has been described, furthermore, plasmids have been involved in bacterial adaptation to their ecological niche. In order to understand the role of the plasmids to these species, two complementary works were carried out. First, insect larvae, a privileged ecological niche of Bt strains, were infected with Bc and Bt strains harboring different plasmid contents. Their fitness were evaluated by vegetative cells and spore counts at four time points. Bt and Bc strains were classified into five groups according to the bacterial fitness. In these groups, the plasmid affects positively or negatively the bacterial fitness. The results demonstrated that for B. cereus group strains, getting a pathogenicity plasmid is not enough to effectively increase bacterial population, colonizing insect hosts. The second study characterized the rap/phr system encoded by the cryptic plasmid pHT8_1. The Rap8 protein inhibited the sporulation process in insect larvae. This protein was directly inhibited by the active signaling peptide Phr8. The Rap8/Phr8 system may allow the bacteria to exert a tight control of the sporulation process in the host cadaver for optimizing the multiplication, the survival and the dissemination of the bacteria. Thus, the results of the second study showed that the plasmids can provide advantages for the adaptation and the evolution of B. thuringiensis in its ecological niche, while the results of the first study indicate that B. cereus group strains must have a suitable genetic background to display a high fitness allowing optimal multiplication and dissemination of the bacterial population within insect larvae.

Notre connaissance de la diversité virale associée aux microorganismes procaryotiques issus des sources hydrothermales océaniques profondes demeure encore limitée. Peu d’études se sont intéressées à l’abondance virale ou à l’impact des virus sur la mortalité microbienne au sein de ces écosystèmes. Le nombre de virus caractérisés, issus de ces environnements, reste faible. Deux virus, PAV1 et TPV1, associés à des archées hyperthermophiles anaérobies appartenant à l’ordre des Thermococcales ont été décrits dans notre laboratoire. Afin de poursuivre nos recherches sur la diversité virale infectant les microorganismes hydrothermaux marins, l’ordre bactérien des Thermotogales a été ciblé. Cet ordre est composé de bactéries chimioorganotrophes anaérobies pour la plupart hyper/thermophiles. Elles partagent la même niche écologique que les Thermococcales et sont métaboliquement proches. De nombreux transferts latéraux de gènes ont, par ailleurs, contribué à l’histoire évolutive des Thermotogales, subodorant l’implication potentielle de virus. La présence de séquences CRISPR a également été rapportée au sein de plusieurs génomes de Thermotogales, suggérant que les Thermotogales sont ou ont certainement déjà été exposées à des infections virales. Pour autant, à ce jour, les seuls éléments génétiques mobiles à avoir réellement été décrits chez les Thermotogales sont 3 miniplasmides et aucun virus. Une cinquantaine de souches de Thermotogales provenant majoritairement de la collection de notre laboratoire (Souchothèque de Bretagne et Collection Ifremer) a été passée au crible quant à la présence d’éventuels bactériovirus associés. A l’issue de ce criblage, des éléments à ADN extra-chromosomiques, incluant 2 plasmides et 7 bactériovirus (du type Siphoviridae) ont été découverts au sein de souches appartenant aux genres Thermosipho et Marnitoga. Des analyses préliminaires ont été réalisées sur ces différents éléments et l’un des nouveaux systèmes hôte/virus a été caractérisé en détail. MPV1 (Marinitoga piezophila virus 1) est un siphovirus-like tempéré isolé d’une bactérie piezophile, il constitue le premier bactériovirus associé à l’ordre des Thermotogales. La souche hôte est piezophile mais aisément cultivable à pression atmosphérique au terme de plusieurs repiquages. Si l’essentiel des analyses a été mené à pression atmosphérique, la production virale s’est avérée tout à fait effective à pression hydrostatique. Nous avons réalisé les analyses de la séquence complète du génome MPV1 (43,7 kb, extrait des capsides virales purifiées) et sa comparaison avec le provirus présent au sein du génome séquencé de Marinitoga piezophila KA3. Les analyses de ce génome viral ont suggéré une proximité évolutive de MPV1 avec les bactériovirus de Firmicutes. Nous avons également mis en évidence que le bactériovirus partage son hôte avec un élément génétique extra chromosomique circulaire de 13,3 kb (pMP1). Ce « ménage à 3 » est surprenant dans le sens où l’élément de 13,3 kb, contenant 13 ORF de fonctions majoritairement inconnues, utilise les capsides virales afin de se propager. Ceci pourrait, ainsi, illustrer un nouvel exemple de piratage moléculaire. / Our knowledge of the viral diversity associated to procaryotic microorganisms inhabiting the deep sea hydrothermal vents is still limited. Only few studies have focused on viral abundance and impact on microbial mortality within these ecosystems. A limited number of viruses from these environments were isolated and characterized. Two viruses, PAV1 and TPV1, associated to hyperthermophilic anaerobic Archaea, Thermococcales order, have ever been described in our laboratory. The topic of this phD thesis was to extend our investigation to other deep sea vent microorganisms in order to deepen our knowledge on the marine hydrothermal virosphere. We decided to focus more precisely on the bacterial order of Thermotogales. This order is composed of anaerobic chemoorganotrophic bacteria that are, for almost, hyper/thermophilic. They share the same ecological niche as the Thermococcales and are metabolically close. Numerous lateral gene transfers have contributed to the evolutionary history of the Thermotogales, implying the potential involvement of viruses. The presence of CRISPRs has also been reported in many genomes, suggesting that Thermotogales certainly are or have been exposed to viral infections. However, up till now, only 3 miniplasmids have been described within Thermotogales and no viruses. Fifty strains of Thermotogales, mostly from the LM2E culture collection (Ifremer and “UBOCC”), were screened for the presence of potential bacteriovirus. Extrachromosomal DNA elements, including 2 plasmids and 7 bacterioviruses (siphovirus-like), were discovered amongst strains belonging to both Thermosipho and Marinitoga genera. Preliminary studies were performed on these elements and one of the new virus-host systems was characterized in details. MPV1 (Marinitoga piezophila virus 1) is a temperate siphovirus-like isolated from a piezophilic bacterium, it is the first bacteriovirus associated to the Thermotogales order. This host strain is piezophilic but easily cultivable at atmospheric pressure after several subcultures. Whether most experiments were performed at atmospheric pressure, the viral production appeared to be effective at hydrostatic pressure. We reported the analyses of the complete sequence of the MPV1 genome (43.7 kb, extracted from purified virions) and its comparison to the provirus present in the sequenced genome of Marinitoga piezophila KA3. Analyses of the viral genome suggested a close evolutionary relationship of MPV1 to Firmicutes bacterioviruses .We also reported that this bacteriovirus shares its host with a circular extrachromosomal genetic element of 13.3 kb (pMP1). This ‘ménage à trois’ is surprising in the sense where the 13.3kb element, that contains 13 ORFs of mostly unknown function, uses the viral capsid to propagate. Therefore, it would likely correspond to a new example of molecular piracy.

La sécrétion de vésicules membranaires (VMs) constitue un processus physiologique important qui a particulièrement été étudié chez les Bactéries et les Eucaryotes. La récente découverte de la production de VMs chez les Archées souligne cependant que ce phénomène est universel et suggère que le dernier ancêtre commun aux trois domaines, LUCA (Last Universal Common Ancestor), produisait certainement des VMs. Les VMs des Archées n'ayant pour le moment été étudiées que chez certaines Crénarchées (ex : G/ Sulfolobus), nous avons entrepris de caractériser les VMs produites par un groupe d'Euryarchées hyperthermophiles anaérobies, les Thermococcales. Dans la première partie de cette étude, nous avons examiné le mécanisme de production ainsi que la composition en lipides et en protéines des VMs de trois espèces de Thermococcales: Thermococcus kodakaraensis, Thermococcus gammatolerans et Thermocococus sp. 5-4. Nous avons observé que les VMs sont sécrétées par un processus de bourgeonnement à partir de l'enveloppe cellulaire similaire à la formation des ectosomes par les cellules eucaryotes. De plus, les VMs sont fréquemment libérées en groupes, formant de grosses protubérances ou des filaments ressemblant aux nanopodes récemment décrits chez les Bactéries. Des différences de structure et de composition protéique sont observées entre les VMs des trois souches étudiées. Cependant, les VMs et les membranes cellulaires d'une même souche ont des compositions protéique et lipidique très proches, confirmant que les VMs sont produites à partir des membranes des cellules. Les VMs et les membranes cellulaires des trois souches comportent notamment un récepteur de peptides de la famille OppA (Oligopeptide-binding protein A) et des homologues de cette protéine ont été identifiés dans les VMs de certaines souches de Sulfolobus.Les VMs sécrétées par les Thermococcales sont associées à de l'ADN et cette association les protègent contre la thermodégradation. Nous montrons dans notre étude que les cellules de T. kodakaraensis transformées avec le plasmide navette plC70 relâchent des VMs comportant ce plasmide. De façon intéressante, ces VMs peuvent être utilisées pour transférer pLC70 à des cellules dénuées de plasmides, suggérant que les VMs pourraient être impliquées dans le transfert d'ADN entre cellules à haute température.Dans la seconde partie de cette étude, nous nous sommes particulièrement intéressés à la souche Thermococcus nautilus, une Thermococcale produisant des VMs associées de manière sélective à deux plasmides contenus dans la cellule. L'un d'eux correspond notamment à un génome viral défectueux de la lignée d'adenovirus PRD1. Ceci indique que les VMs peuvent être un moyen de transport pour des génomes viraux et suggère que la production de VMs par des cellules ancestrales pourraient avoir joué un rôle dans l'apparition des virus.En plus d'être impliquées dans le transport de plasmides/virus, les VMs produites par T. nautilus exercent un effet toxique sur certaines souches de Thermococcales, probablement dû au convoyage de toxines. Même si ces " thermococcines " nécessitent d'être caractérisées, il s'agit de la première mise en évidence d'une activité toxique liée aux VMs chez les Thermococcales.

Les bactéries sont des organismes extrêmement sociaux, qui présentent de multiples comportements de coopération. De plus, les génomes bactériens sont caractérisés par la présence de nombreux éléments génétiques mobiles, tels que les plasmides. Ces éléments mobiles sont la cause de transferts génétiques horizontaux, et jouent un rôle important dans l'évolution bactérienne. La coopération et le transfert horizontal ont tous deux des conséquences importantes sur la santé humaine: des comportements coopératifs sont souvent à l'origine de propriétés de virulence chez les bactéries pathogènes, et le transfert horizontal entraîne la dissémination de gènes de résistance aux antibiotiques. L'évolution du transfert horizontal a jusqu'ici été analysée essentiellement en termes de bénéfices infectieux apportés à des éléments génétiques égoïstes. Cependant, le taux de transfert des plasmides est extrêmement variable et partiellement contrôlé par les gènes des bactéries hôtes, suggérant une co-évolution complexe entre hôtes et plasmides. De plus, les plasmides sont particulièrement riches en gènes liés à des comportements coopératifs, et semblent donc jouer un rôle-clé dans les phénomènes de socialité bactérienne. Ce travail porte sur la coévolution entre mobilité génétique et socialité chez les bactéries. Nous analysons ici les pressions de sélection agissant sur le transfert de plasmides et la production de biens publics, à l'aide de modèles mathématiques et d'un système synthétique que nous avons construit chez Escherichia coli, dans lequel nous pouvons contrôler indépendamment la coopération et la conjugaison. Dans un premier temps, nous montrons expérimentalement que le transfert horizontal favorise le maintien de la coopération dans une population structurée, en augmentant la sélection de parentèle agissant au niveau des gènes transférés. Dans un second temps, nous montrons expérimentalement et théoriquement que l'échange génétique lui-même peut être sélectionné: les bactéries transférant des plasmides codant pour des biens publics sont favorisées dans une population structurée. Le transfert de gènes codant pour des biens privés peut également être sélectionné, à condition que ce transfert s'effectue entre bactéries apparentées. Finalement, ces interactions entre transfert horizontal et coopération peuvent mener à une association entre allèles de coopération et de transfert, expliquant la fréquence élevée de gènes sociaux situés sur des plasmides.Ces résultats permettent de mieux comprendre le maintien de comportements coopératifs chez les bactéries, et suggèrent des moyens de cibler certains cas de virulence bactérienne. / Bacteria are social organisms which participate in multiple cooperative and group behaviours. They moreover have peculiar genetic systems, as they often bear mobile genetic elements like plasmids, molecular symbionts that are the cause of widespread horizontal gene transfer and play a large role in bacterial evolution. Both cooperation and horizontal transfer have consequences for human health: cooperative behaviours are very often involved in the virulence of pathogens, and horizontal gene transfer leads to the spread of antibiotic resistance. The evolution of plasmid transfer has mainly been analyzed in terms of infectious benefits for selfish mobile elements. However, chromosomal genes can also modulate horizontal transfer. A huge diversity in transfer rates is observed among bacterial isolates, suggesting a complex co-evolution between plasmids and hosts. Moreover, plasmids are enriched in genes involved in social behaviours, and so could play a key role in bacterial cooperative behaviours. We study here the coevolution of gene mobility and sociality in bacteria. To investigate the selective pressures acting on plasmid transfer and public good production, we use both mathematical modelling and a synthetic system that we constructed where we can independently control public good cooperation and plasmid conjugation in Escherichia coli. We first show experimentally that horizontal transfer allows the specific maintenance of public good alleles in a structured population by increasing relatedness at the gene-level. We further demonstrate experimentally and theoretically that this in turn allows for second-order selection of transfer ability: when cooperation is needed, alleles promoting donor and recipient abilities for public good traits can be selected both on the plasmid and on the chromosome in structured populations. Moreover, donor ability for private good traits can also be selected on the chromosome, provided that transfer happens towards kin. The interactions between transfer and cooperation can finally lead to an association between transfer and public good production alleles, explaining the high frequency of genes related to cooperation that are located on plasmids. Globally, these results provide insight into the mechanisms maintaining cooperation in bacteria, and may suggest ways to target cooperative virulence.

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Les plasmides pSci de Spiroplasma citri GII3 possèdent une structure mosaïque avec de nombreuses régions conservées. Des dérivés du plasmide pSci2 ont été produits par délétions successives et leur capacité de réplication a été évaluée. Le plus petit réplicon obtenu ne contient plus qu’une CDS (pE) et ses régions flanquantes. L’inactivation dans un vecteur navette du gène pE est suffisante pour abolir la réplication de ce plasmide dans S. citri. Des dérivés des pSci ont été introduits efficacement dans S. kunkelii et S. phoeniceum, deux spiroplasmes phytopathogènes pour lesquels aucun outil génétique n’était disponible jusqu’à présent. La stabilité des dérivés des pSci a également été évaluée par leur capacité à persister en l’absence de pression de sélection. L’instabilité ségrégationnelle des plasmides dans lesquels soj a été délété ou inactivé indique que la protéine de partition Soj/ParA est essentielle au maintien des plasmides pSci. L’incompatibilité sélective entre un plasmide pSci et ses dérivés a été exploitée pour produire une collection de souches possédant des profils plasmidiques différents. L’analyse des phénotypes d’acquisition et de transmission de plusieurs de ces mutants suggère que la CDS traG portée par le pSci6 est essentielle à la transmission de S. citri GII3. En revanche, les plasmides pSci1-5, codant les protéines adhésine-like ScARPs, ne sont indispensables ni à l’acquisition ni à la transmission. Dans le cadre de ce travail, plusieurs outils génétiques ont été adaptés aux mollicutes. Le promoteur Pxyl/tetO2 a été utilisé pour contrôler l’expression du gène de la spiraline chez S. citri et M. agalactiae. Enfin, un système de linéarisation de plasmide in vivo basé sur l’expression de l’endonucléase I-SceI a été utilisé pour l’élimination de plasmides pSci chez S. citri. / Plasmids pSci from Spiroplasma citri GII3 display a mosaic gene organization with highly conserved regions. Through successive deletions, various pSci2 derivatives were constructed and assessed for their ability to replicate. The smallest functional replicon consists of one single CDS (pE) and its flanking, intergenic regions. Furthermore, shuttle (S. citri/E. coli) plasmids, in which the pE gene was disrupted, failed to replicate in S. citri, suggesting that PE is the replication protein. S. citri plasmids were efficiently introduced into S. kunkelii and S. phoeniceum, two plant pathogenic spiroplasmas, the transformation of which had never been described before. Studying stability of various pSci-derived plasmids in the absence of selection pressure strongly suggests the occurrence of an active partition system involving the soj-like gene. Selective incompatibility between a given pSci plasmid and its derivatives was used to remove plasmids from the wild-type strain. As a result, a collection of S. citri GII3 mutants differing in their plasmid contents was produced. Experimental transmission of these mutants through injection to or ingestion by the leafhopper vector will provide new insights into the role of plasmid encoded determinants in the biology of S. citri. First data indicated that pSci6 traG is required for insect transmission of S. citri GII3. In contrast, pSci1-5, encoding adhesin-like proteins, are not essential for both transmission and acquisition. In the frame of this work, new genetic tools have been adapted for use in mollicutes. The tetracycline inducible promoter, Pxyl/tetO2, was used to control spiraline gene in S. citri and M. agalactiae. Also, an in vivo linearization system based on the expression of the I-SceI-endonuclease was used to remove pSci plasmids from S. citri.